黃連多糖中單糖組成的HPLC-MSn法快速識別

張亞麗 高 簡 苗祥貞 張 瀟 劉永剛 譚 鵬

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京，100102)

黃連多糖中單糖組成的HPLC-MSn法快速識別

張亞麗 高 簡 苗祥貞 張 瀟 劉永剛 譚 鵬

(北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京，100102)

目的：探討采用HPLC-MSn法快速識別黃連多糖中的單糖組成。方法：黃連藥材經(jīng)過提取、分離、除蛋白、除色素，最終得到黃連多糖，用2 mol/L的三氟乙酸水解黃連多糖，以1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)作單糖衍生化試劑，利用HPLC-MSn識別黃連中單糖的組成，并解析其衍生物的裂解規(guī)律。結(jié)果：通過分析，得到的黃連多糖中含有甘露糖、核糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖/木糖、巖藻糖，其中核糖、巖藻糖為首次在黃連多糖中報道的單糖。結(jié)論：HPLC-MSn法對中藥多糖組分中的單糖成分進行分析具有重要的指導意義。

黃連多糖；PMP；單糖；HPLC-MSn

黃連來源于毛茛科植物云連Coptis.teetaWall.、黃連C.chinensisFranch.和三角葉黃連C.deltoideaC.Y.ChengetHsiao的干燥根莖[1]，在中醫(yī)臨床上常用于清熱燥濕，瀉火解毒的病癥[2]。我國黃連資源豐富，并且其臨床應(yīng)用廣泛，效果顯著，千年來受到中醫(yī)的青睞，但黃連的化學成分復雜，其中許多成分，如小檗堿、黃連堿等具有很強的生理和藥理活性[3-11]。

黃連中含有大量的小檗堿類成分[12]，其化學和藥理方面是目前研究最為廣泛的一類[13-23]，但對黃連中的多糖類成分研究甚少[24-29]。呂秀梅等采用Box-Behnken設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)選出黃連中黃連多糖的提取工藝條件；姜爽等[30]探討了黃連多糖的最佳提取工藝及其體外抗氧化作用，證明了黃連多糖對超氧陰離子自由基、羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用；吳玉娟等、王偉等[31]對黃連多糖進行提取，并檢測了黃連多糖的抗氧化活性,均證明了黃連多糖作為抗氧化劑,具有較好的清除自由基的作用；熊雄等分離了黃連多糖成分，并研究黃連多糖及黃連水提液的降糖作用及機制，實驗結(jié)果表明黃連多糖具有一定的降血糖活性，且其活性較水提液好；尹登科等[32]通過實驗證明黃連多糖可通過抑制RAGE表達，從而降低AGEs對內(nèi)皮細胞的激活作用。

黃連多糖已被證明有較好的活性，且多糖是在自然界中廣泛存在的化合物，其單糖成分的確定是控制多糖標準的關(guān)鍵。Honda等[33]于1989年首次使用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)對還原性單糖進行LC分析；在此之后Wang等[34]采用PMP-HPLC-MSn，對鮑魚性腺多糖中的成分進行了分析；Wu等[35]用HPLC/ESI-MS技術(shù)，對水解后的羊棲菜多糖衍生化反應(yīng)，對其中的單糖成分的分析也得到了較好的效果。本研究針對黃連多糖中的單糖類成分進行分析，并首次采用HPLC-MSn法，根據(jù)單糖衍生化裂解規(guī)律確定黃連多糖中單糖成分的組成。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo Scientific LTQ-Orbitrap線性離子阱串聯(lián)靜電軌道場高分辨質(zhì)譜，美國Thermo-Fisher公司；LC-20AT島津高效液相色譜儀，日本島津公司；2862H UV/VIS SPETRO photometer，尤尼科上海儀器有限公司；SHZ-D(III)循環(huán)水式多用真空泵，鞏義市予華儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；電子天平PL2002，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試劑 甲醇、乙腈(色譜純)，美國Fisher Scientific；D-101大孔樹脂購自上海源葉生物科技有限公司所；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、三氟乙酸(TFA)等均為分析純；水為高純水。

1.3 分析樣品 黃連購自北京三和藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學中藥鑒定系教授鑒定為毛茛科植物黃連(RhizomaCoptidis)的干燥根莖，本文中的黃連多糖即用此中藥提取而得；D-半乳糖(Gal，AJ0603LA14)、D-甘露糖(Man，A16O6L4546)、L-鼠李糖(Rha，SJ0715GA13)、D-木糖(Xyl，JA412RA13)、D-葡萄糖(Glu，140648-200602)、D-阿拉伯糖(Ara，AJ0702FA14)、L-巖藻糖(Fuc,TM0312QB14)購自上海源葉生物科技有限公司所。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜條件：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(250×4.6 mm)；流動相：20 mmol/L醋酸銨(每100 mL加入1 mL冰醋酸)-乙腈(85∶15，v/v)；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；檢測波長：254 nm；進樣量：20 μL。

質(zhì)譜條件：霧化電壓4.0 kV；管狀透鏡電壓110 V；鞘氣流量30 L/min；毛細管溫度350 ℃；輔助器流量10 L/min；負離子模式全掃描。分辨力R設(shè)為30 000，二級和三級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，選取上一級豐度最高的3個峰進行CID碎片掃描，以離子阱檢測碎片離子。

2.2 對照品溶液的制備 分別稱取甘露糖、半乳糖、葡萄糖各1.80 mg，鼠李糖、巖藻糖各1.64 mg，阿拉伯糖、木糖各1.50 mg，定容于10 mL氨水中。取氨水溶液500 μL于具塞試管中，加入0.5 mol/L的PMP甲醇溶液500 μL，超聲溶解，置于70 ℃水浴中加熱30 min。取出冷卻至室溫后加入10%的冰醋酸進行中和，再加入1 mL的三氯甲烷，充分震搖、靜置，離心，棄去氯仿層，重復3次以除去未反應(yīng)的衍生化試劑PMP，將所得上清液進行HPLC-MSn分析。

2.3 供試品溶液的制備 將干燥的黃連藥材粗粉100 g，先用10倍量的丙酮進行脫脂，加熱回流1 h，再用10倍量水煎煮2次，2 h/次，離心10 min(4 000 r/min)，合并濾液，濃縮至200 mL，加入95%乙醇，使乙醇濃度達到80%，4 ℃靜置24 h，抽濾得草烏粗多糖沉淀，依次用丙酮、乙醇洗滌后得沉淀。

沉淀加適量水復溶，加入等量的sevage試劑(三氯甲烷：正丁醇4∶1)混合，充分震蕩，離心，取最上層水液，重復上述步驟數(shù)次，直至離心時中間層無蛋白出現(xiàn)，合并水層，同樣的醇沉方法，4 ℃放置24 h后抽濾，得沉淀。取適量用95%乙醇浸泡過夜的大孔樹脂裝層析柱，用少量蒸餾水溶解黃連多糖沉淀，蒸餾水洗脫，用α-奈酚反應(yīng)檢測流出液體至無紫色環(huán)生成，合并洗脫液用乙醇再次沉淀，抽濾，沉淀放烘箱中烘干。

精密稱取多糖樣品20 mg于具塞中試管中，加入2 mol/L的TFA 2 mL，密封，沸水浴加熱水解8 h后，冷卻至室溫，離心，水浴揮干TFA，然后加入氨水溶解并定容至5 mL容量瓶，取500 μL，按2.2中方法進行PMP衍生化操作，得供試品溶液，進行HPLC-MSn分析。

2.4 樣品測定結(jié)果

2.4.1 單糖對照品衍生化裂解規(guī)律 由圖1的單糖對照品總離子流圖可以看出利用液相色譜結(jié)合高分辨質(zhì)譜技術(shù)，且在負離子模式下單糖衍生物能夠獲得較高的響應(yīng)值，說明了該方法適合于衍生化后單糖的分析。通過觀察負離子模式下PMP標記的單糖標準品質(zhì)譜數(shù)據(jù)(見表1、圖2)發(fā)現(xiàn)單糖衍生物均顯示出強烈的分子離子峰[M-H]-；而二級碎片離子峰則出現(xiàn)相同的碎片離子[M-PMP-H]-，推斷二級斷裂應(yīng)為單糖衍生物掉落一分子PMP的結(jié)果；三級碎片離子均出現(xiàn)了強峰m/z 215，且推斷m/z 215碎片離子的生成可能是C2—C3鍵斷裂的結(jié)果，具有一致的裂解規(guī)律。具體裂解過程以葡萄糖衍生物為例見圖3。從單糖標準品衍生物總離子流圖可以看出保留時間為52 min時，僅有一個峰，但其峰端并沒有呈現(xiàn)尖狀，可能是由于阿拉伯糖和木糖極性較為相近，導致2個單糖衍生物不能很好的分開。

2.4.2 黃連多糖的單糖組成 通過對酸水解黃連多糖的衍生化產(chǎn)物總離子流圖的各離子峰分析發(fā)現(xiàn)，在不同的保留時間處，出現(xiàn)了8個與單糖裂解規(guī)律相同的離子峰(圖4)。根據(jù)各個離子峰的質(zhì)譜裂解數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)其二、三級碎片離子均與標準品一致，更加驗證了上述推導的單糖裂解規(guī)律，因此可初步判定黃連多糖由8種成分組成。根據(jù)已有標準品對照，可以得出峰1、3、5、6、7、8分別為甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)/木糖(Xyl)、巖藻糖(Fuc)，進一步，依據(jù)現(xiàn)有參考文獻[36-38]及各單糖保留時間(極性順序)，確定峰2、4分別為核糖(Rib)和半乳糖醛酸(Gal UA)，其中核糖、巖藻糖為首次在黃連多糖中發(fā)現(xiàn)的單糖，葡萄糖為黃連多糖中的主要成分。見表2。

圖1 PMP標記的單糖標準品在負離子模式下的總離子流

No.保留時間(min)MSMS2MS3分子量單糖(標品)126.05509.21335.13215.08180甘露糖232.74493.21319.13215.08164鼠李糖347.40509.21335.13215.08180葡萄糖449.24509.20335.12215.08180半乳糖552.29479.19305.11215.08150阿拉伯糖652.29479.19305.11215.08150木糖756.26493.21319.13215.08164巖藻糖

圖2 負離子模式下PMP標記的葡萄糖標準品的MS1-3碎片離子

3 討論

本實驗采用PMP作為單糖的衍生化試劑,借助液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)闡述了單糖與PMP衍生化過程的反應(yīng)機理及裂解規(guī)律,從而根據(jù)標準品再依據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)推斷出黃連多糖中的單糖類成分，證明了該方法的可行性，并且首次從黃連多糖中鑒定出了核糖、巖藻糖，表明了糖類衍生物在所建立的質(zhì)譜條件下呈現(xiàn)出專一性，且醛酸類和非醛酸類單糖均符合該裂解途徑，為分析中藥多糖的成分奠定了良好的基礎(chǔ)。

表2 黃連多糖中單糖PMP衍生化產(chǎn)物的識別

圖3 負離子模式下PMP標記的葡萄糖標準品衍生物的質(zhì)譜裂解途徑

圖4 負離子模式下黃連多糖中單糖衍生物總離子流

通過以上實驗及數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)標準品阿拉伯糖和木糖衍生化產(chǎn)物在總離子流圖上不能很好的分開，可能是由于二者結(jié)構(gòu)、極性相近導致，黃連多糖樣品成分分析中，發(fā)現(xiàn)在保留時間50～51 min出現(xiàn)一個尖峰，但不能確定其為阿拉伯糖或木糖，亦或二者都存在。將多糖酸水解，再對水解的多糖進行衍生化，利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對其衍生化物分析，能夠準確的辨別其單糖組成，該方法準確、可靠，在醫(yī)藥、食品、生命科學等領(lǐng)域也可廣泛應(yīng)用。

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MonosaccharideCompositionAnalysisofPolysaccharidesfromRhizomaCoptidisBasedonHPLC-MSn

Zhang Yali, Gao Jian, Miao Xiangzhen, Zhang Xiao, Liu Yonggang, Tan Peng

(SchoolofChineseMateriaMedica,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China)

Objective:To explore a rapid identification of monosaccharide composition of polysaccharide from Rhizoma Coptidis through HPLC-MSn.MethodsAfter being extracted, separated, removed of protein and pigment, Rhizoma Coptidis polysaccharide was obtained from Rhizoma Coptidis. Polysaccharides of Rhizoma Coptidis was hydrolyzed with the TFA of 2 mol.L-1. 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) was used as derivatization reagent. And high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-MSn) was used to identify the composition of monosaccharide, and the resolve fragmentation regularity of its derivatives was analyzed.ResultsThrough analysis, the monosaccharides of polysaccharides from Rhizoma Coptidis were mannose, ribose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, arabinose/ xylose, fucose, among which ribose and fucose were the first reported monosaccharides that obtained from polysaccharide of Rhizoma Coptidis.ConclusionHPLC-MSnhas a guiding significance in analyzing the monosaccharide composition of polysaccharides from Chinese materia medica.

Rhizoma Coptidis polysaccharide; PMP; Monosaccharide; HPLC-MSn

青年科學基金項目(81102807)

張亞麗(1993.03—)，女，碩士研究生，中藥炮制學方向，E-mail:Ali857@163.com

譚鵬(1980.02—)，男，博士，副教授，講師，中藥炮制研究，E-mail:tanpengtcm@163.com；劉永剛(1981.02—)，男，博士，副教授，講師，中藥化學研究，E-mail:liuyg0228@163.com

R284

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.053

(2016-12-28收稿 責任編輯：楊覺雄)