脈抒降脂及改善急性酒精性肝損傷的作用

方歡樂 黃永剛 楊保德 許 毛 胡 浩 趙 銘

(1 西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安，710125； 2 青海睿元藥物研究所有限責(zé)任公司，西寧，810003； 3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安，710061)

脈抒降脂及改善急性酒精性肝損傷的作用

方歡樂1黃永剛2楊保德3許 毛3胡 浩3趙 銘3

(1 西安培華學(xué)院醫(yī)學(xué)院，西安，710125； 2 青海睿元藥物研究所有限責(zé)任公司，西寧，810003； 3 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部，西安，710061)

目的:研究脈抒降脂及對急性酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用。方法:采用高脂飼料喂養(yǎng)建立高脂動(dòng)物模型，將雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組，即對照組、模型組、陽性給藥組、脈抒高、中、低劑量組；除對照組外其余各組大鼠高脂喂養(yǎng)同時(shí)給藥，4周后測定血清總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。另取大鼠60只，分為對照組、模型組、硫普羅寧組及脈抒高、中、低劑量組，用白酒灌胃誘導(dǎo)、建立大鼠酒精性脂肪肝模型，各組動(dòng)物連續(xù)灌胃給藥28 d，測定血清中TG、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，ELISA法測定血清極低密度脂蛋白(VLDL)水平；進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查。結(jié)果：和模型比較，脈抒高、中、低劑量組均對高脂大鼠體重未見明顯影響；對高脂大鼠血清TC和HDL-C水平無明顯影響；但可顯著性降低高脂大鼠血清TG和LDL-C水平。同時(shí)能夠升高大鼠血液中SOD水平，降低MDA水平(P<0.05，P<0.01)?？擅黠@降低急性酒精性肝損傷大鼠血清ALT、AST、TG和VLDL水平，脈抒大劑量可改善急性酒精性肝損傷大鼠肝臟脂肪變性程度(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論：脈抒對高脂大鼠有明顯的輔助降血脂作用同時(shí)對急性酒精性肝損傷大鼠有明顯的輔助保護(hù)作用。

脈抒；高血脂；抗氧化；酒精性肝損傷

高脂血癥是由于脂肪代謝異常導(dǎo)致血漿中的脂質(zhì)水平高于正常的一種病癥。近年來,由于人們生活水平提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變其發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢[1]。高脂血癥可導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化、引發(fā)心腦血管疾病的發(fā)生[2]，因此預(yù)防高脂血癥對心腦血管疾病的發(fā)生具有重要意義。而近年來人們的飲酒量逐年增加，喝酒引發(fā)的肝損傷也成為一類常見的肝臟疾病[3]。脈抒由山楂、植物甾醇、枸杞、沙棘等多種藥食同源植物或者提取物為主要原料組成。本研究從藥物抗氧化、調(diào)節(jié)血脂，保護(hù)肝功能、抑制肝臟組織病理學(xué)改變等方面對該制劑進(jìn)行了藥效學(xué)研究，為藥物的研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性SD大鼠，體重(200±20)g，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(陜)2012-003。由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 藥物 脈抒，棕黃色粉末，由青海睿元藥物研究所有限責(zé)任公司提供(批號(hào)：20150401)，冷藏保存，備用；阿托伐他汀鈣片組，大連輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：H49101；硫普羅寧腸溶片，河南省新誼藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：P20141204-1。以上藥物臨用前用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液配制成所需濃度的混液備用。

1.1.3 試劑與儀器 血清三酰甘油(TG)、血清總膽固醇(TC)、血清高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和血清低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)試劑盒，丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，長春匯力生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20150211，20150207；血清極低密度脂蛋白(VLDL)檢測試劑盒，上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20150411;蘇丹Ⅲ染液，西安赫特生物科技有限公司，批號(hào)：ST085。Sartorius-BP210S電子天平，德國Sartorius公司；STAT FAX 2100酶標(biāo)儀，美國AWARENESS公司；微量移液器，德國Eppendorf公司；冰凍切片機(jī)，德國MICROM公司。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 高脂大鼠模型，按文獻(xiàn)[4]的方法，結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行改進(jìn)，飼料配方為在維持飼料中添加1.0%膽固醇、0.1%膽酸鈉、10%豬油、10%蛋黃粉，大鼠每周稱量體重1次。于喂養(yǎng)兩周后高脂大鼠斷尾取血，測定血清TC水平；酒精性肝損傷大鼠模型，根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理總局食藥監(jiān)保化函[2011]325號(hào)關(guān)于《對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能評價(jià)方法(征求意見稿)》的具體方法為實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)空白對照組大鼠一次性灌胃給予蒸餾水12 mL/kg，模型組、給藥組大鼠一次性灌胃給予50%的乙醇12 mL/kg。

1.2.2 分組與給藥 除空白對照組外，高脂模型大鼠根據(jù)TC水平將模型對照組隨機(jī)分成高脂模型組、陽性對照組、脈抒低、中、高劑量組5組，每組10只?？瞻讓φ战M給予同體積的相應(yīng)溶劑、高脂模型組高脂飼料繼續(xù)飼養(yǎng)并給予同體積的相應(yīng)溶劑、給藥組高脂飼料飼養(yǎng)的同時(shí)陽性對照組給予阿托伐他汀鈣溶液(5 mg/kg)、其他組分別給予脈抒低劑量溶液(2.5 g/kg)、脈抒中劑量溶液(5 g/kg)、脈抒高劑量溶液(7.5 g/kg)；酒精性肝損傷大鼠，取SD大鼠60只，隨機(jī)分為6組，每組10只，空白對照組給予蒸餾水10 mL/kg；模型組給予蒸餾水10 mL/kg；陽性對照組給予硫普羅寧500 mg/kg；脈抒低劑量組給予溶液為2.5 g/kg、脈抒中劑量組給予溶液為5 g/kg、脈抒高劑量組給予溶液為7.5 g/kg。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 高脂模型各組大鼠每周定期稱量體重，觀察大鼠活動(dòng)情況、攝食情況、皮毛光澤和顏色等。于給藥4周后，大鼠麻醉采用摘眼球法對動(dòng)物隨機(jī)取血，3 000 r/min，4 ℃下離心20 min收集上層血清，血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、SOD、MDA水平按照生物試劑盒(長春匯力生物技術(shù)有限公司)說明書方法測定，用酶聯(lián)免疫儀進(jìn)行吸光度分析。

酒精性肝損傷各組大鼠，連續(xù)灌胃給藥28 d后造模，實(shí)驗(yàn)結(jié)束所有動(dòng)物均禁食16 h后各組大鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉溶液麻醉后腹主動(dòng)脈采血，分離血清，采用酶法測定血清中三酰甘油(TG)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)水平，采用ELISA法測定極低密度脂蛋白(VLDL)水平；并取肝組織，進(jìn)行肝組織病理學(xué)檢查(肝細(xì)胞脂肪變性評分：0分，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴無或稀少；1分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/4；2分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/2；3分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/4；4分，肝組織幾乎被脂滴代替。

2 結(jié)果

2.1 大鼠活動(dòng)的一般情況 各組大鼠在實(shí)驗(yàn)全過程中均未出現(xiàn)死亡；活動(dòng)正常，未見攝食異常。

2.2 脈抒對高脂大鼠體重的影響 與對空白對照組比較模型組大鼠體重有增加的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陽性對照藥物有降低高脂大鼠體重的趨勢，脈抒3個(gè)劑量對高脂大鼠體重增加趨勢沒有顯著性改善。見表1。

2.3 脈抒對高脂大鼠血脂水平的影響 與空白對照組比較，高脂模型組大鼠血清TG和LDL-C水平明顯增高(P<0.01)。脈抒高、中、低3個(gè)劑量可明顯降低高脂大鼠血清TG和LDL-C水平(P<0.05，P<0.01)，陽性對照組藥物阿托伐他汀也明顯降低高脂大鼠血清TG和LDL-C水平(P<0.05)。同時(shí)結(jié)果顯示，脈抒高劑量組血清TG水平比陽性對照組血清TG水平低，脈抒食療組方3個(gè)劑量組血清LDL-C水平均比陽性對照組低。與空白對照組比較，高脂模型組大鼠血清TC水平明顯增高(P<0.05)，血清HDL-C水平明顯降低(P<0.05)。脈抒高、中、低3個(gè)劑量和陽性對照藥物均不能明顯降低高脂大鼠血清TC水平(P>0.05)，也不能明顯增高高脂大鼠血清HDL-C水平，但數(shù)據(jù)顯示脈抒高、中、低3個(gè)劑量和陽性對照藥物均有改善高脂大鼠血清TC和HDL-C水平異常的趨勢，且脈抒高劑量和中劑量對高脂大鼠血清HDL-C水平的改善作用高于陽性對照組。見表2。

表1 脈抒對高脂大鼠體重的影響

表2 脈抒對高脂大鼠血脂水平的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高脂模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.4 脈抒對高脂大鼠SOD、MDA的影響 實(shí)驗(yàn)表明，與對照組比較，模型組大鼠血清SOD活性顯著降低，MDA水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，脈抒中高劑量組均能顯著升高高脂大鼠SOD活性，降低血清MDA水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 6組大鼠血清SOD活性和MDA水平的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高脂模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.5 脈抒對乙醇所致大鼠急性肝損傷的血液ALT、AST的影響 與空白對照組比較，模型組的ALT、AST顯著升高(P<0.01)；脈抒組均可明顯抑制乙醇引起的ALT升高，其中脈抒高劑量組能降低AST的升高，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；表明藥物對乙醇所致急性肝損傷有保護(hù)作用。見表4。

表4 脈抒對乙醇所致大鼠肝損傷的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高脂模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

2.6 脈抒對酒精性肝損傷大鼠血脂水平的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后大鼠眼球后靜脈叢取血，測定血清TG和VLDL。模型組大鼠TG及VLDL水平明顯高于空白對照組(P<0.01)；與模型組比較，硫普羅寧組TG水平顯著降低(P<0.01)，脈抒各組大鼠TG及VLDL水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表5。

2.7 脈抒對酒精性肝損傷大鼠肝組織病理學(xué)水平的影響 處死后取大鼠肝臟中葉組織，液氮速凍后冰凍切片。用蘇丹紅Ⅲ染肝脂肪細(xì)胞呈橘紅色。肝細(xì)胞脂肪變性評分：0分，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴無或稀少；1分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/4；2分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過1/2；3分，含脂滴的肝細(xì)胞不超過3/4；4分，肝組織幾乎被脂滴代替。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對照組比較，酒精性肝損傷大鼠肝臟組織切片中含有大量橘紅色脂質(zhì)粒(見圖1，黑色箭頭所指方向)(P<0.01)。脈抒組(7.5 g/kg)和陽性對照藥物組肝臟組織切片中橘紅色脂質(zhì)粒與模型組比較明顯減少(P<0.05)，各組肝細(xì)胞脂肪變性評分見表6。

表5 脈抒對酒精性肝損傷大鼠TG及VLDL水平的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與高脂模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01

表6 脈抒對酒精性肝損傷大鼠肝臟病理組織學(xué)變化的影響分)

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05；△△P<0.01

圖1 各組大鼠肝臟組織病理切片(蘇丹紅Ⅲ染色)

注：黑色箭頭所指橘紅色組織為脂肪細(xì)胞

3 討論

高脂血癥可以直接損害并加速全身動(dòng)脈粥樣硬化，引起心腦血管疾病的發(fā)生[5]?？勺儸F(xiàn)為血清中TG、TC、LDL-C過高，或HDL-C過低[6]。正常人體血脂的來源主要由每天進(jìn)食的脂類物質(zhì)消化吸收入血液。還有由肝臟、脂肪細(xì)胞和其他組織合成釋放入血[7]。如何調(diào)節(jié)脂肪代謝平衡，成為預(yù)防和治療高脂血癥的關(guān)鍵所在。目前報(bào)道西藥降脂有很多弊端，而近年來隨著對降血脂中藥的不斷深入研究，證實(shí)中藥可以通過降脂改善高脂血癥，且不良反應(yīng)少[8]，尤其是藥食兩用的中草藥有很好的調(diào)節(jié)作用[9]。據(jù)研究報(bào)道[10-11]山楂為藥食同源的植物，具有抗氧化、降脂保護(hù)心血管的作用；枸杞果實(shí)中SOD的活性和比活性都很高，其具有很好的抗氧化，防衰老作用。研究還顯示，近幾十年來，隨著研究的進(jìn)一步深入，主產(chǎn)于西北地區(qū)的沙棘在心腦血管方面的保護(hù)作用也被發(fā)現(xiàn)，沙棘有很好的降脂、抗氧化、保肝等作用[12]。

脈抒是由山楂、枸杞、沙棘和植物甾醇等制得，內(nèi)含總黃酮、粗多糖、總植物甾醇、β-葡聚糖、番茄紅素和類胡蘿卜素等主要有效成分。本研究對其降脂、抗氧化作用進(jìn)行了研究結(jié)果顯示，脈抒對高脂大鼠體重和活動(dòng)無明顯影響?？娠@著性抑制高脂大鼠血清TG和LDL-C水平；一定程度上減少高脂大鼠血清TC水平，增加血清HDL-C水平，從而對高脂大鼠有一定的輔助降血脂作用。同時(shí)脈抒也顯示出顯著升高高脂大鼠SOD活性，降低血清MDA水平，具有很好的抗氧化的作用。

酒精性肝損傷是人類常見的致肝硬化的原因[13]，飲酒是引起脂肪肝的常見病因，酒精性脂肪肝是酒精性肝病早期的病理變化的一部分，當(dāng)肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞或者通透性改變時(shí)，AST，ALT可以大量釋放進(jìn)入血液，血清中AST和ALT的升高可以反映出肝細(xì)胞的壞死程度[14]。研究表明飲酒導(dǎo)致脂肪肝可能是乙醇對肝內(nèi)三酰甘油的代謝有直接的毒性作用，引起三酰甘油合成增多，導(dǎo)致脂肪肝的形成[15]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陽性藥物和脈抒能明顯降低ALT、AST的升高，抑制急性酒精性肝損傷大鼠血清TG及VLDL水平，同時(shí)組織病理學(xué)改變也表明藥物能改善急性酒精性肝損傷導(dǎo)致的肝細(xì)胞脂肪變性，從而對急性酒精性肝損傷有一定的輔助保護(hù)作用。

實(shí)驗(yàn)提示脈抒具有抗氧化改善高脂血癥大鼠血脂紊亂現(xiàn)象，保護(hù)肝臟。但其調(diào)血脂，保肝的功能的機(jī)制和相關(guān)有效成分的確認(rèn)需要做進(jìn)一步的研究工作，這一方面的保健功能開發(fā)利用值得重視。

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EffectsofMaishuonLipid-loweringandImprovingEthanolInducedAcuteLiverInjury

Fang Huanle1, Huang Yonggang2, Yang Baode3, Xu Mao3, Hu Hao3, Zhao Ming3

(1MedicalCollegeofXi′anPeihuaUniversity,Xi′an710125,China; 2QinghaiRuiyuanPharmaceuticalResearchInstituteCo.,Ltd,Qinghai810003,China; 3HealthScienceCenter,Xi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China)

Objective:To investigate the protective effects of Maishu on acute liver injury and lipid-lowering.MethodsHyperlipidemia model was induced by high-fat diet. Male SD rats were randomly divided into control group, model group, positive treatment group, Maishu high dose group, middle dose group and low dose group; Except control group, other groups were feeded with high-fat diet and drugs. At the end of 4 weeks, the levels of serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, SOD and MDA were determined. Another 60 rats were randomly divided into the control group, model group, tiopronin group, Maishu high dose group, middle dose group and low dose group. The model of alcoholic liver damage in mice was induced by intragastic administration of alcohol. Each group was given continuously by gavage 28 days. The serum levels of ALT, AST and TG were determined. The content of VLDL was determined by ELISA. Histopathological changes of the liver were observed by HE staining.ResultsComparing with the model group, Maishu high dose, middle dose and low dose had little or even no influence on mice′s weight, and had no adverse effects on the levels of TC and HDL-C of hyperlipidemic rats. But it can significantly decrease the levels of TG ang LDL-C, as well as increase SOD and reduce the MDA content (P<0.05,P<0.01). It could significantly reduce ALT, AST, TG and VLDL on acute alcoholic liver injure in rats. Mashu high dose can improve hepatocyte-steatosis (P<0.05,P<0.01).ConclusionMaishu is effective on blood-lipid regulation of the hyperlipidemia model rats and it has protective effects on ethanol-induced acute hepatic injury in mice.

Maishu; Hyperlipidemia; Antioxidant; Alcoholic liver damage

國家自然科學(xué)基金青年基金(81402924)；青海省科技廳基礎(chǔ)研究項(xiàng)目(J2015012)

方歡樂(1981.11—)，女，碩士，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail:yezi_1023@163.com

趙銘(1980.11—)，女，博士，講師，研究方向：心血管藥理學(xué)，E-mail：zhaomingxjtu@163.com

R284；R575

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.045

(2017-01-12收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄)