附子品種的抗病性及根表真菌多樣性研究

高繼海 王 偉 謝曉芳 曹小玉 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

附子品種的抗病性及根表真菌多樣性研究

高繼海 王 偉 謝曉芳 曹小玉 彭 成

(成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地,成都,611137)

目的:在系統(tǒng)中藥思想指導(dǎo)下,研究附子品種的抗病能力及與外界真菌系統(tǒng)多樣性的關(guān)系。方法:使用高通量技術(shù)構(gòu)建附子品種的根表真菌文庫(kù),分析其多樣性指數(shù)與附子抗病品質(zhì)形成的關(guān)系。結(jié)果:小花葉與瓜葉子型附子之間,以及健康與病害附子之間,其根表土壤的優(yōu)勢(shì)真菌種類、群落多樣性均存在差異,附子根系影響了土壤真菌的結(jié)構(gòu)組成,阿太菌、總狀毛霉等是附子根腐病的致病菌群,而被孢霉屬、青霉菌屬等又組成病害菌的拮抗菌群。結(jié)論:本結(jié)果為附子農(nóng)業(yè)的良好品質(zhì)管理提供理論指導(dǎo),也豐富了附子品種品質(zhì)形成的系統(tǒng)學(xué)理論與分析方法。

系統(tǒng)中藥學(xué);附子;根腐病;土壤真菌;高通量測(cè)序

附子是毛茛科植物烏頭(AconitumCarmichaelii)的子根加工品,一種典型的道地性中藥材,具有回陽(yáng)救逆,助陽(yáng)補(bǔ)火,散寒止痛之功效[1]。附子又是烏頭植物、生藥材等的統(tǒng)稱,其野生資源生長(zhǎng)于川藏高原東緣起,向東遍歷長(zhǎng)江中、下游以及珠江流域上游各省區(qū)的丘陵、高山地區(qū),還分布于江蘇向北經(jīng)過山東達(dá)到遼寧南部的廣闊區(qū)域[2];而作為中藥農(nóng)業(yè)作物,其栽培歷史逾1 300多年,主產(chǎn)于四川、陜西、云南、貴州、重慶等地區(qū),近年于四川地區(qū)的人工種植規(guī)模在2～3萬畝,產(chǎn)量占全國(guó)70%以上,“江油附子”“布拖附子”均獲得國(guó)家地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)[3-4]。

系統(tǒng)中藥理論認(rèn)為,品種是中藥品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)和內(nèi)部系統(tǒng)要素,而生境又與中藥品種相互影響,環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)與生物內(nèi)部系統(tǒng)的相互作用是決定中藥品質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)因素[5]。附子的品種按葉形區(qū)分為南瓜葉、大花葉、小花葉、鵝掌葉、莓葉子、油葉子和冒氏苗等。目前,附子栽培品種又以瓜葉子為主,混雜少量小花葉型。瓜葉附子以單產(chǎn)量高的優(yōu)勢(shì),受到附農(nóng)偏愛,所謂“江油附子個(gè)大質(zhì)優(yōu)”即指瓜葉子品種[3],但瓜葉附子對(duì)植物系統(tǒng)外界的真菌更為敏感,極易受到根腐病等的侵染,以四川江油為例,2014—2016年有農(nóng)田根腐病感染面積比例達(dá)50%之多,附農(nóng)減收嚴(yán)重,經(jīng)濟(jì)損失巨大。相較于瓜葉子品種,小花葉附子雖然產(chǎn)量小,其對(duì)外界系統(tǒng)根腐菌類的抗性能力較高,農(nóng)田感染比例也較小。我國(guó)目前針對(duì)附子品種與根腐病抗性關(guān)系的科學(xué)研究與學(xué)術(shù)報(bào)道不多,甚至附子根腐病的致病原因尚未清楚,這種現(xiàn)狀使得根腐病的預(yù)防以及附子農(nóng)業(yè)管理無所適從,影響了附農(nóng)增產(chǎn)增收,也制約了附子產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)代化、標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化發(fā)展。

本研究從品種內(nèi)在系統(tǒng)與外部生境系統(tǒng)2個(gè)角度,在整理附子主要栽培品種抗病能力的基礎(chǔ)上,使用HiSeq 2500高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)其根表真菌群落的生物多樣性,以期從外部系統(tǒng)闡釋附子品種的抗病性差異以及致病原因,為附子良好農(nóng)業(yè)品質(zhì)的管理提供理論指導(dǎo),同時(shí)也豐富了附子品種品質(zhì)形成的系統(tǒng)學(xué)理論與分析方法。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 附子植株樣品采集 本研究所涉附子主要栽培品種有南瓜葉、大花葉、小花葉,于2016年06月中旬采集于四川省江油市河西鄉(xiāng)普照村GAP基地(N31°44′′,E104°42′)。按照葉形,對(duì)附子品種分別進(jìn)行拍照,根系帶土采挖,并編號(hào)。

1.1.2 根表土樣品采集 附子植株樣品采挖后,小心刮取每株附子根系的根表土約100 g,多個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)附子植株的土壤樣品混合后烘干,通過四號(hào)篩過濾掉木屑、石塊等雜質(zhì),取約10 g樣品用于總DNA提取和高通量測(cè)序。采集樣品包括正常附子根表土壤(編號(hào)T1、T2、T3、T4、T5,統(tǒng)稱G1)、大花葉型附子根表土壤(編號(hào)D1、D2、D3、D4,統(tǒng)稱G2)、患病大花葉型附子根表土壤(編號(hào)DV1、DV2、DV4,統(tǒng)稱G3)、小花葉型附子根表土壤(編號(hào)X1、X2、X3、X4、X5,統(tǒng)稱G4)。

1.2 土壤DNA提取與PCR擴(kuò)增 采用SDS-CTAB法[7]提取土壤樣品總DNA,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度。以稀釋后的基因組DNA為模板,使用帶Barcode的ITS特異引物進(jìn)行PCR,其反應(yīng)體系為30 μL:Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix(New England Biolabs,2×)15 μL,Primer(2 μM)3 μL(6 μM),gDNA(1 ng/μL)10 μL(5～10 ng),ddH2O 2 μL。ITS引物為:(ITS5-1737F)5′-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3′、(ITS2-2043R)5′-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3′。PCR反應(yīng)程序?yàn)?98 ℃預(yù)變性1 min,30個(gè)循環(huán)(98 ℃,10 sec;50 ℃,30 sec;72 ℃,30 sec),72 ℃延伸5 min。

1.3 真菌cDNA文庫(kù)構(gòu)建與物種注釋分析 根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等濃度混樣,充分混勻后使用1×TAE濃度2%的瓊脂糖膠電泳純化PCR產(chǎn)物,選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列,割膠回收目標(biāo)條帶。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建,構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量,文庫(kù)合格后,使用HiSeq2500 PE250進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序結(jié)果參照Qiime(Version 1.7.0)的Tags質(zhì)量控制流程[8],進(jìn)行Tags截取和長(zhǎng)度過濾。Tags序列通過UCHIME Algorithm[9]與數(shù)據(jù)庫(kù)Unite database進(jìn)行比對(duì)檢測(cè)嵌合體序列,去除嵌合體序列得到最終有效數(shù)據(jù)[10]。利用Uparse對(duì)所有樣品的有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行聚類成為OTUs(Operational Taxonomic Units)[12],并對(duì)OTUs代表序列進(jìn)行物種注釋,并分別在各個(gè)分類水平(界,門,綱,目,科,屬,種)統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用MUSCLE進(jìn)行快速多序列比對(duì)[12],得到所有OTUs代表序列的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。將OTU數(shù)值生成相對(duì)豐富度(%)進(jìn)行物種分類樹統(tǒng)計(jì),并使用SPSS(v 19)統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.4 群落多樣性與結(jié)構(gòu)分析 利用α多樣性分析土壤樣品內(nèi)真菌的豐富度[13],用β多樣性指數(shù)分析土壤樣品組間差異。本文重點(diǎn)研究了病態(tài)土壤與健康土壤真菌多樣性的差異,用Qiime軟件以Weighted Unifrac距離矩陣做UPGMA聚類分析,并將聚類結(jié)果與各樣品在門、屬、種水平上的物種相對(duì)豐度整合展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 附子主要栽培品種及根腐病抗性 在四川江油、布拖等主產(chǎn)地,附子栽培品種主要有南瓜葉、大花葉與小花葉3種。同等苗齡的這3種附子,南瓜葉型的附子葉形似南瓜葉般寬厚、油亮,葉齒平緩,莖桿粗壯;小花葉型附子莖桿細(xì)弱易,有較多分蘗出于葉腋中,葉面小、葉基狹長(zhǎng)、葉尖尖銳,其形狀如菊科植物艾,故又稱艾葉型(圖1A);大花葉型附子的莖桿也較粗,葉片規(guī)格介于南瓜葉與小花葉之間,葉尖端也較尖銳,附農(nóng)將之與南瓜葉型附子統(tǒng)稱瓜葉子或花葉子(圖1B)。

瓜葉附子容易感染根腐病,其發(fā)病從根外至根內(nèi)、自地下而地上,根表皮初為水浸狀病斑,逐漸擴(kuò)大至根組織內(nèi)部,附子塊根最后完全腐爛(圖1F、H),而整個(gè)植株受害初期葉片萎蔫、下垂,似水燙狀,嚴(yán)重時(shí)患病植株葉片自下而上變黃褐色或紅紫色枯焦,甚至根莖結(jié)合處土面可見白色菌絲體與黑褐色似油菜籽大小的菌核(圖1D)。瓜葉附子生病后,其病菌蔓延速度迅速,極難控制。相對(duì)于瓜葉子型品種,小花葉附子對(duì)根腐病的抵抗能力強(qiáng),大田栽培時(shí)其植株少有生病(圖1A、C、E、G)。瓜葉子與小花葉型附子對(duì)根腐病的明顯抗性差異,為其優(yōu)良品質(zhì)的培育提供了篩選材料,而根腐病的致病真菌群落也是附子土壤生境系統(tǒng)的較佳研究對(duì)象。

圖1 小花葉附子(左)與瓜葉子附子(右)

注：A、B,正常植株葉形;C、D,小花葉附子莖基與染病瓜葉附子莖基;E、F,小花葉附子與染病瓜葉附子;G、H,小花葉附子與染病瓜葉附子橫切

2.2 土壤真菌數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建與測(cè)序注釋 本研究通過分析土壤真菌ITS高通量測(cè)序技術(shù),成功構(gòu)建了4組數(shù)據(jù)庫(kù),分別為對(duì)照正常土壤G1、大花葉附子根表土壤G2、患病大花葉附子根表土壤G3和小花葉附子根表土壤G4,共17個(gè)土壤樣品。4組數(shù)據(jù)庫(kù)包含996 653條序列,去除條形碼引物后獲得975 213條序列。根據(jù)QC和Nochime分析,最終獲得總有效序列948 843條(95.25%),核苷酸195 583 495個(gè),平均每個(gè)片段含核苷酸206個(gè)。Q30值達(dá)到99.36%,說明測(cè)序質(zhì)量良好。

所有土壤樣品共獲得12266個(gè)OTUs,各樣品平均OTUs數(shù)722個(gè),表明附子生境系統(tǒng)中存在復(fù)雜的共生真菌群落。經(jīng)過注釋分析,99.03%的真菌序列可以注釋到界、門、綱、目、科、屬、種7個(gè)分類等級(jí),如在門水平上(圖2A),土壤真菌主要分布在接合菌門(Zygomycota)、子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)等,而在屬水平上(圖2B,表1),土壤真菌主要為被孢霉屬(Mortierella)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、青霉菌屬(Penicillium)、阿太菌屬(Athelia)和毛霉屬(Mucor)等。

2.3 土壤真菌的多樣性差異分析 對(duì)附子根表真菌做物種豐富度、多樣性分析,并構(gòu)建聚類樹,圖2結(jié)果顯示,瓜葉子與小花葉型附子品種的根表土壤系統(tǒng)中,真菌群落結(jié)構(gòu)存在較明顯的差異。由圖2A可見,在門的水平上,正常健康土壤(G1)中接合菌門、子囊菌門和擔(dān)子菌門等分布比較均衡,而附子根表的真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,如小花葉品種(G4)以接合菌門為顯著的根表優(yōu)勢(shì)菌群,瓜葉子品種(G2、G3)以擔(dān)子菌門為主,其次為接合菌門(或子囊菌門)。同樣為瓜葉子品種,健康附子與生病附子的根表真菌系統(tǒng)也發(fā)生較顯著的變化(P<0.05),表現(xiàn)為接合菌門和擔(dān)子菌門在染病土壤系統(tǒng)中含量增加,而子囊菌門的豐度減小?？梢?附子各品種的根系均影響了周圍正常土壤的真菌群落結(jié)構(gòu)組成。

由圖2B和表1可見,在屬的水平上,對(duì)照土壤組的真菌群落也最為均衡,物種豐富度也最高(shannon指數(shù)=5.32)。瓜葉子品種的根表真菌豐富度有所降低,shannon指數(shù)分別為4.91、4.76,在小花葉附子土壤中,被孢霉屬真菌含量顯著升高,達(dá)到36.4%,這導(dǎo)致其真菌系統(tǒng)的豐富度最低。同樣為瓜葉子品種,生病土壤(G3)中阿太菌屬真菌含量達(dá)到10.3%,約為健康組(G2)的2.6倍,而且G3組含有更多毛霉屬、被孢霉屬類真菌,所占比例分別約為G2組的1.6和5.4倍,表明生病附子的土壤生境中存在更大的真菌群落結(jié)構(gòu)失衡情況。

在物種水平上,本研究依據(jù)附子根表真菌序列構(gòu)建了UPGMA樹(圖2),并將物種相對(duì)豐度、各附子品種的該物種占比進(jìn)行標(biāo)注,圖3和表2顯示,除了分類級(jí)別屬水平上的群落結(jié)構(gòu)差異,各附子品種、健康與染病附子根表系統(tǒng)之間,其真菌的物種水平也發(fā)生了較大的變化。如患病瓜葉子(G3)土壤中,阿太菌(A.rolfsii)、總狀毛霉(Mucorracemosus)、被孢霉屬的M.chlamydospora、青霉菌屬的P.simplicissimum等含量,相較于對(duì)照土壤與小花葉土壤均顯著增加,并且成為G3組的優(yōu)勢(shì)真菌。阿太菌又稱白絹病菌(Sclerotiumrolfsii),主要分布于溫暖潮濕地區(qū),是導(dǎo)致土豆、向日葵、大豆和一些觀賞花卉植物根部腐爛的主要病菌[14-15],江油地區(qū)夏季平均溫度為30～33 ℃,雨水充沛,恰好適宜該菌生長(zhǎng)。有研究表明,總狀毛霉可以導(dǎo)致小番茄根部軟化,是根腐疾病的致病菌之一[16]。此外,某些豐度較小的真菌,其在染病土壤系統(tǒng)中也明顯改變。如莖點(diǎn)霉屬Phomaadonidicola的含量在G3組中升高到G2組的4倍,研究表明該屬許多真菌可以造成苜蓿、大豆感染嚴(yán)重根腐病[17]。

圖2 4組土壤真菌的UPGMA聚類樹及其在不同水平的相對(duì)豐富度

注：A,左側(cè)是UPGMA聚類樹結(jié)構(gòu),右側(cè)的是各樣品真菌在門水平上的相對(duì)豐度分布;B,各樣品中真菌在屬水平的相對(duì)豐富度

表1 附子根表土壤真菌在屬水平分布的相對(duì)豐富度

圖3 附子根表土壤真菌的系統(tǒng)分類樹及其在不同土壤的分布比例

注：分類樹繪制選擇使用附子根表真菌數(shù)據(jù)庫(kù)中含量豐度最高的20種真菌物種,以圓圈表示,其圓圈直徑與其在真菌群落中的相對(duì)豐度成正比,期在4組樣品的相對(duì)比例又以圓圈中不同顏色標(biāo)示

表2 附子根表土壤部分真菌在種水平的相對(duì)豐富度

有意思的是,在染病附子根表真菌群落(G3)中,被孢霉屬的豐度也有較大的提高,該屬是一類廣泛存在于熱帶雨林和溫帶農(nóng)業(yè)地區(qū)的真菌,主要分布于植物根表土壤,它們能夠適應(yīng)不同溫度,可以拮抗(抑制)阿太菌這類利用土壤傳播的真菌[18]。同時(shí),小花葉附子根表真菌群落(G4)中,被孢霉屬含量超過36%,可見其對(duì)小花葉附子的抗根腐菌能力起到重要作用。另外,P.simplicissimum于抗病品種小花葉附子土壤中含量相對(duì)較高,研究發(fā)現(xiàn)其是一種促進(jìn)植物生長(zhǎng),提高植物抗性的真菌[19],因此它也應(yīng)與該附子品種的抗病性狀有關(guān)聯(lián)。G4樣品中紅酵母屬的Rhodotorulaingeniosa,也高于其他品種,該屬真菌可以幫助甜菜抵御土壤立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)等的侵害[20-21],也是小花葉附子品種抵抗根腐病的因素之一。

3 討論

系統(tǒng)中藥理論是研究中藥材種質(zhì)資源的理想理論,它認(rèn)為品種是中藥品質(zhì)形成的物質(zhì)基礎(chǔ)和內(nèi)部要素,土壤、微生物等生境條件是其外界系統(tǒng)要素,而多維評(píng)價(jià)、自組織分析方法又兼顧到內(nèi)外要素的相互協(xié)同、突變與有序演化過程,而本文針對(duì)中藥材附子的實(shí)驗(yàn)研究及數(shù)據(jù)分析,從實(shí)踐上闡釋了該理論。研究所涉的小花葉、瓜葉子等多品種抗病性狀,是其優(yōu)良品質(zhì)形成的客觀內(nèi)在要素,而附子自身及該農(nóng)業(yè)性狀品質(zhì)又與外在的土壤真菌系統(tǒng)存在相互作用,一方面附子植物改變了對(duì)照土壤中平衡的接合菌門、子囊菌門和擔(dān)子菌門比例組成,致使小花葉、瓜葉子根表土壤系統(tǒng)中出現(xiàn)了明顯的優(yōu)勢(shì)菌群(圖2,表1)。另一方面,這些外在的真菌系統(tǒng)又影響著附子品質(zhì)變化,阿太菌等優(yōu)勢(shì)菌群導(dǎo)致G3組附子發(fā)生根腐病害,被孢霉屬菌類保護(hù)小花葉附子免受致病菌感染(圖3,表2)。此外,本研究結(jié)果還顯示附子外界生境的真菌系統(tǒng)中也存在著協(xié)同與拮抗作用,如阿太菌外的其他致病菌也參與植物根腐病的發(fā)生,而青霉菌屬“有益菌”物種隨著G3組附子根腐病的發(fā)生也有所增加,可能在附子抗病性方面發(fā)揮著重要的外部作用。

本文主要外部系統(tǒng)入手,使用HiSeq 2 500高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)附子根表真菌群落的多樣性,以期闡釋附子品種的抗病性差異以及致病原因,為附子良好農(nóng)業(yè)品質(zhì)的管理提供理論指導(dǎo),發(fā)現(xiàn)阿太菌等可能為附子根腐病的主要致病菌之一,課題組后期已從病害材料中純化獲得該菌株,侵染實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了其致病性,這為附子根腐病的預(yù)防以及農(nóng)業(yè)良好品質(zhì)管理工作奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ),同時(shí)也豐富了附子品種品質(zhì)形成的系統(tǒng)學(xué)理論于分析方法。然而,附子內(nèi)在品質(zhì)的遺傳物質(zhì)與藥效物質(zhì)成分,在與外界系統(tǒng)的相互關(guān)系中發(fā)揮著怎樣的主導(dǎo)作用,以及附子生命系統(tǒng)內(nèi)部存在哪些協(xié)同、拮抗與演化因素,還需要后續(xù)進(jìn)一步研究。

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StudyonDiseaseResistanceofRadixAconitiLateralisPraeparataVarietiesandtheirRhizoplaneFungalDiversities

Gao Jihai, Wang Wei, Xie Xiaofang, Cao Xiaoyu, Peng Cheng

(CollegeofPharmacy,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine;KeyLaboratoryofChineseHerbsStandardizationofMinistryofEducation;Co-constructKeyLaboratoryofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicinalResources,Chengdu611137,China)

Objective:To study the relationship between the disease resistance of Radix Aconiti Lateralis Praeparata and the diversity of fungi system under the guidance of systematic theory of Chinese herbal medicine.MethodsHigh-throughput technology was used to build the rhizoplane fungus library of different types of Radix Aconiti Lateralis Praeparata, and then the relationship between the diversity index and the anti-disease capacity was analyzed.ResultsThere were differences in the dominant strains and the diversity of fungi community for the rhizoplane soils between the Xiao-Hua Radix Aconiti Lateralis Praeparata and the Gua-Ye Radix Aconiti Lateralis Praeparata, the healthy and pathogenic Radix Aconiti Lateralis Praeparata; The root system of Radix Aconiti Lateralis Praeparata affect the structure of soil fungi. Atheli arolfsii，Mucor racemosus were the pathogenic fungi, while the Mortierella, Penicillium are antagonistic fungi to root rot pathogens.ConclusionThe results provide theoretical guidance for good quality management of Radix Aconiti Lateralis Praeparata agriculture, and enrich the theory and analysis methods for the system science of Chinese herbal medicine.

System science of Chinese herbal medicine; Radix Aconiti Lateralis Praeparata; Root rot; Soil fungus; High-throughput sequencing

國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(81630101);國(guó)家發(fā)改委標(biāo)準(zhǔn)化項(xiàng)目(ZYBZH-C-SC-51);國(guó)家自然科學(xué)基金國(guó)家基礎(chǔ)科學(xué)人才培養(yǎng)基金(J1310034);四川省中醫(yī)藥管理局“川產(chǎn)道地藥材綜合開發(fā)與區(qū)域發(fā)展”項(xiàng)目(2016ZY008);四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃(2016JY0089)

高繼海(1983.11—),男,博士,講師,研究方向：分子生藥學(xué)研究,E-mail:gaojihaiwuwei@163.com

彭成(1964.03—),男,博士,教授,博士研究生導(dǎo)師,研究方向：中藥毒效的系統(tǒng)評(píng)價(jià)與整合研究,E-mail:pengchengchengdu@126.com

R282.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.11.004

(2017-10-09收稿 責(zé)任編輯：王明)