冷凍電鏡：四十年風(fēng)雨無阻路終得云開見月明
——2017年諾貝爾化學(xué)獎簡介

李承珉

中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101

冷凍電鏡：四十年風(fēng)雨無阻路終得云開見月明
——2017年諾貝爾化學(xué)獎簡介

李承珉?

中國科學(xué)院生物物理研究所，北京 100101

電子顯微鏡強大的分辨能力能幫助人類展示微觀世界的細(xì)節(jié)，在生命科學(xué)領(lǐng)域有著廣泛的用途。但是，由于生物樣品無法承受電子束的輻照損傷，電鏡技術(shù)一直很難在生物樣品上獲得高分辨率信息。冷凍電鏡技術(shù)的誕生以及近幾年的分辨率革命開啟了一個利用電鏡技術(shù)解析生物分子結(jié)構(gòu)的新紀(jì)元，該技術(shù)的幾位先驅(qū)科學(xué)家也因此獲得了2017年的諾貝爾化學(xué)獎。本文簡要回顧了電鏡三維重構(gòu)技術(shù)和冷凍技術(shù)的歷史和發(fā)展現(xiàn)狀，并對未來作出展望。

冷凍電鏡；三維重構(gòu)；單顆粒分析；高分辨率

2017年10月，瑞典皇家科學(xué)院將諾貝爾化學(xué)獎頒發(fā)給了Jacques Dubochet、Joachim Frank 和Richard Henderson三位科學(xué)家，以表彰他們在發(fā)展和研究冷凍電鏡技術(shù)方面的貢獻(xiàn)(圖1)。這是繼1986年諾貝爾物理學(xué)獎后，電鏡技術(shù)再次問鼎諾獎，只不過這一次頒給了化學(xué)領(lǐng)域。

1 電子顯微鏡的誕生

圖1 從左至右依次為獲得2017年度諾貝爾化學(xué)獎的Jacques Dubochet、Joachim Frank以及Richard Henderson(圖片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/)

人類肉眼能區(qū)分的最小距離，一般在0.1～0.2 mm。如果想要將視野拓展到微觀世界去識別更細(xì)微的物質(zhì)，我們就得借助于顯微鏡。17世紀(jì)后半葉，Antony van Leeuwenhoek(列文虎克) 用自制的光學(xué)顯微鏡成功觀察到細(xì)菌等微生物的存在，使人類對生命世界的認(rèn)知前進(jìn)了一大步。1872年，德國物理學(xué)家Ernst Karl Abbe和Carl Zeiss(蔡司，蔡司公司創(chuàng)始人)合作計算出顯微鏡領(lǐng)域劃時代的阿貝公式，指出所有光學(xué)儀器的分辨率都有一個物理理論極限，這個極限分辨率約為所用照明光波波長的一半。這意味著即使使用可見光譜中波長最短(約400 nm)的紫光，我們能得到的最好分辨率也不會超過200 nm(約700個原子的直徑)。19世紀(jì)末，光學(xué)顯微鏡的分辨率就已經(jīng)被推近到接近理論極限的200 nm，為人類打開了一個豐富多彩的微觀世界。但是，這個分辨率還遠(yuǎn)不足以讓人們看清原子層次的細(xì)節(jié)。事實上，阿貝公式所導(dǎo)出的極限分辨率的限制是如此強大，以至于該公式的提出者，那個時代最偉大的光學(xué)物理學(xué)家之一的阿貝本人，也不得不感嘆“人類的創(chuàng)造性已基本沒有希望找到方法和途徑來克服這個極限了(It is poor comfort to hope that human ingenuity will find means and ways to overcome this limit)”。某種程度上，阿貝的絕望是有道理的，在其離開這個世界近100年后，阿貝公式導(dǎo)出的光學(xué)顯微鏡分辨率的理論極限，才被新興的超高分辨熒光顯微術(shù)用特殊的方式打破(參考2014年諾貝爾化學(xué)獎)。不過阿貝沒有料到的是，在他逝世20年后，德布羅意的天才理論會推動一個比光學(xué)顯微鏡更加強大的工具——電子顯微鏡的誕生。這個工具將接過光學(xué)顯微鏡的火炬，幫助人類以前所未有的清晰度，從原子層次去窺探生命世界的神奇與奧秘。

電子顯微鏡，簡稱電鏡，是依據(jù)電子光學(xué)原理，利用電子束和電磁透鏡代替光束和光學(xué)透鏡，從而能放大觀察物質(zhì)的細(xì)微結(jié)構(gòu)的儀器。如果要追溯電鏡誕生的歷史，我們往往會從1897年英國科學(xué)家J. J. Thomson發(fā)現(xiàn)電子開始講起。1923年，法國科學(xué)家德布羅意首先提出電子的波粒二象性設(shè)想并成功推導(dǎo)出電子波長的正確表達(dá)式；1926年，奧地利物理學(xué)家薛定諤成功推導(dǎo)出電子波在電磁場中的運動方程；1926—1927年，德國科學(xué)家Hans Busch報道電磁透鏡對電子束的聚焦效應(yīng)；1927年，美國貝爾實驗室的Clinton J.Davisson和英國的G. P. Thomson (J. J. Thomson的兒子，父子倆一個發(fā)現(xiàn)電子粒子性，一個確認(rèn)電子波動性，都獲得了諾貝爾物理學(xué)獎，成為科學(xué)史上的一段佳話)分別獨立證實了電子的衍射性。這里每一項激動人心的發(fā)現(xiàn)與突破，都獲得了諾貝爾物理學(xué)獎，也使得用電子束代替光束、用電磁透鏡代替玻璃透鏡來制造超高分辨率顯微鏡的想法應(yīng)運而生。最終，德國工程師Ernst Ruska和Max Knoll于1931年成功制造出歷史上第一臺真正意義上的電子顯微鏡，而Ruska本人也因此獲得1986年的諾貝爾物理學(xué)獎。以我們后人的眼光來看，這是順理成章的事。不過有意思的是，很多年后Ruska回顧當(dāng)年，坦誠自己在電鏡研發(fā)之初，并不知道電子具有波動性，畢竟那屬于當(dāng)時物理學(xué)最前沿和最不可思議的量子力學(xué)領(lǐng)域。當(dāng)?shù)谝慌_電子顯微鏡制造成功后，Ruska才從別人處獲知電子的波動性并深感郁悶，因為他以為電鏡分辨率同光學(xué)顯微鏡那樣會受到阿貝成像理論的制約，不會太高。后來得知電子波長極短，所以電鏡分辨率理論上完全有分辨原子的潛力，他方才轉(zhuǎn)憂為喜。

2 電子顯微鏡在生物學(xué)領(lǐng)域的早期應(yīng)用

電子顯微鏡誕生的主要催化劑，是人們希望借助于一種具有比光學(xué)顯微鏡更高分辨率的儀器來觀測病毒。病毒的尺寸遠(yuǎn)小于細(xì)菌，一般只有100 nm或者更小，無法被光學(xué)顯微鏡所看到。18世紀(jì)末人類就已經(jīng)假設(shè)病毒的可能存在，直到1938年才使用電鏡獲得直接證據(jù)。將電鏡用于生物研究并獲得更高的分辨率，一直是生物學(xué)界的強烈渴求。然而，當(dāng)電鏡真正問世后，許多生物學(xué)家和物理學(xué)家都對其在生物研究領(lǐng)域的應(yīng)用持保守態(tài)度，即便是有些諾獎獲得者也不例外。他們的保守與懷疑并非沒有道理，因為將電鏡技術(shù)用于生物領(lǐng)域，有著巨大的困難和挑戰(zhàn)。

來自比利時布魯塞爾自由大學(xué)的Ladislaus Marton是用電鏡觀測生物樣品的先驅(qū)，并在1934年第一次獲得了生物樣品的電鏡照片后，在《Nature》上簡短地點評了電鏡對生物樣品研究的限制：“電鏡的高分辨能力并不能直接用于生物學(xué)研究，除非我們能開發(fā)出一種新的組織學(xué)技術(shù)來保護(hù)生物細(xì)胞不受電子束的破壞(This high resolving power cannot be applied in biological research, however, without developing a new histological technique to prevent the destruction of the organic cells by the intense electronic bombardment)?！盵1]事實上，電子束對生物樣品的破壞只是挑戰(zhàn)之一，更大的挑戰(zhàn)來自于為了保持電鏡真空的穩(wěn)定，生物樣品不能含有水分。同時，生物樣品本身在電鏡中的襯度極低，而生物樣品電鏡成像時所使用的極低電子劑量(為了防止電子損傷)、極薄樣品厚度(為了防止電子的多重散射)，以及電子和樣品相互作用帶來的漂移，等等都嚴(yán)重限制了生物樣品在電鏡下的分辨率。直到近10年前，電鏡技術(shù)早已在材料等領(lǐng)域開花結(jié)果、異常奪目，而生物學(xué)樣品的電鏡分辨率依然大部分在十幾埃到幾十埃徘徊，甚至被一度嘲笑為“blobology”(英文諷刺，即“一堆輪廓的技術(shù)”)。但是，依然有許多人堅定地認(rèn)為，電子顯微鏡必能在生物學(xué)研究領(lǐng)域大放光芒。這些人包括那些電鏡的發(fā)明者們、很多偉大的生物學(xué)家及物理學(xué)家們，如Marton、電鏡發(fā)明者Ernst Ruska的弟弟Helmut Ruska、電子晶體學(xué)及電鏡三維重構(gòu)理論的先驅(qū)Aaron Klug(1982年諾貝爾化學(xué)獎獲得者)，以及2017年獲獎的三位冷凍電鏡領(lǐng)域的奠基人等許多科學(xué)家。正是他們的堅持、努力和遠(yuǎn)見，才迎來今天冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域一騎絕塵的輝煌時代。

為了能使生物樣品不易被電子束破壞，并能增加樣品的襯度，人們開始在生物樣品制備上下功夫。最早對制備生物樣品展開研究的正是Marton。他首次提出使用銅網(wǎng)支撐切薄的生物組織樣品，并用重金屬對生物樣品染色增加襯度，同時在物鏡旁邊增加光闌來提高像襯度。這些方法非常有效并且一直沿用至今。后來Helmut Ruska改進(jìn)了Marton的重金屬原子“染色”法，并發(fā)明了生物顆粒的載體，在人類歷史上首次觀察到了直徑在60 nm左右的噬菌體的存在[2]。到了20世紀(jì)50年代，超薄切片生物樣品制備技術(shù)已經(jīng)成熟，電鏡也開始用來觀察比較復(fù)雜的生物結(jié)構(gòu)，比如染色體。那是一個激動人心的時代，基本上一幅電鏡圖像就是一篇重要研究論文的雛形，和后來在冷凍電鏡技術(shù)獲得突破后，一個重要分子復(fù)合物的高分辨三維電鏡結(jié)構(gòu)就有可能發(fā)表一篇重量級研究論文比較相似。

到了1959年，劍橋大學(xué)的S. Brenner和R. W.Horne在前人的基礎(chǔ)上開發(fā)出了著名的負(fù)染法(negative staining)，用金屬鹽對鋪在載網(wǎng)上的生物樣品進(jìn)行染色，使得在電鏡中生物樣品周圍變暗而突出樣品本身。同時，這種方法還能更好地對抗電子輻射損傷，防止樣品本身在真空環(huán)境里的塌縮。正是在負(fù)染色方法的幫助下，病毒、細(xì)菌、組織等生物樣品的顯微成像達(dá)到了前所未有的清晰程度[3]。雖然負(fù)染法有它的局限，無法展示被包埋的樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，分辨率也受到限制(目前通過負(fù)染法能得到的最高分辨率大約是1.5 nm)，但它依然是每一個電鏡研究人員用來檢查篩選樣品，以及快速獲得樣品低分辨率結(jié)構(gòu)的基本手段。

3 三維重構(gòu)技術(shù)的出現(xiàn)與電子晶體學(xué)的發(fā)展

當(dāng)負(fù)染色法開始成為電鏡樣品制備的主流方法后，同樣來自劍橋大學(xué)MRC分子實驗室的Aaron Klug教授很快意識到每一張電鏡照片都是樣品的三維結(jié)構(gòu)在某一個角度的投影，而如果想要解出這個三維結(jié)構(gòu)本身，就需要拍攝更多不同角度的二維照片。這可以通過傾轉(zhuǎn)樣品本身或者收集大量不同角度的樣品顆粒來實現(xiàn)[4]。利用這種思想，Klug教授和David DeRosier在1968年合作，成功解析了噬菌體T4的尾部三維結(jié)構(gòu)。之所以挑選噬菌體T4的尾部，是因為其結(jié)構(gòu)具有漂亮的螺旋對稱性。這篇劃時代的文章發(fā)表在了當(dāng)年的《Nature》上，標(biāo)志著電鏡三維重構(gòu)方法的正式誕生[5]。針對非螺旋對稱的樣品，Klug教授和他的同事們(Anthony Crowther和David DeRosier)提出了一種等價線理論，用于求解二維投影在三維結(jié)構(gòu)中對應(yīng)的角度，這也是電鏡三維重構(gòu)的理論基礎(chǔ)。這種方法對于擁有高度對稱的樣品，比如二十面體的病毒的三維重構(gòu)非常好用，但對于沒有對稱性的樣品，則需要額外收集一套帶傾轉(zhuǎn)的數(shù)據(jù)來幫助求解[6]。

然而負(fù)染色的樣品難以獲得更高分辨率的結(jié)構(gòu)，許多研究者努力想要改變這個局面，并作出了很多重要貢獻(xiàn)，比如來自德國馬普研究所的Walter Hoppe教授。他發(fā)展了一套電子晶體衍射的方法來測量蛋白結(jié)構(gòu)，敏銳地意識到電子損傷導(dǎo)致的樣品結(jié)構(gòu)的改變，促進(jìn)了最小劑量電子方法(minimal dose methodology)的發(fā)展，并提出了很多后來被證明行之有效的三維重構(gòu)基本思想[7]?？上缙诘某晒蠖喟l(fā)在德文期刊上，導(dǎo)致他的貢獻(xiàn)被大多數(shù)人忽視。2017年獲得諾獎的Joachim Frank教授，正是Hoppe當(dāng)年的學(xué)生，也正是在Hoppe教授的思想影響下，提出并完善了電鏡單顆粒三維重構(gòu)的算法，被公認(rèn)為電鏡單顆粒分析的鼻祖。

在這里不得不提及美國科學(xué)家Bob Glaeser的貢獻(xiàn)。在20世紀(jì)70年代早期，他意識到對于沒有染色的樣品，必須要保持極低的電子劑量來減少非彈性散射的電子帶來的損傷。這種損傷意味著電子將破壞樣品的化學(xué)鍵，改變原有結(jié)構(gòu)信息。因為這種損傷不可避免，所以人們無法測定單個分子結(jié)構(gòu)。由于低劑量電子帶來的信噪比極低，需要大量的顆粒平均來提高信噪比，所以他提出使用晶體樣品[8]。晶體中排列著數(shù)十萬個規(guī)則有序的分子，即使其中一部分結(jié)構(gòu)被電子破壞，我們依然可以得到足夠的結(jié)構(gòu)信息。在冷凍電鏡還沒有誕生的年代，電子晶體學(xué)確實是一種看起來可行的方法。后來在冷凍電鏡領(lǐng)域至關(guān)重要的人物——Richard Henderson教授，最開始選擇的正是這條道路。必須要提及的是，Glaeser教授也是最早開始嘗試?yán)美鋬鰜斫档洼椛鋼p傷的科學(xué)家。他們把樣品冷卻到了大約-120 ℃，這已經(jīng)是當(dāng)時所能達(dá)到的極限了[9-10]。

到了1975年，劍橋MRC實驗室的Richard Henderson教授和他的同事Nigel Unwin一起，開創(chuàng)了能在室溫條件下研究沒有染色的蛋白晶體的二維電子晶體學(xué)三維重構(gòu)技術(shù)。他們使用葡萄糖替代水來保持晶體在真空環(huán)境中的形狀，并成功解析了視紫紅質(zhì)蛋白的三維結(jié)構(gòu)，分辨率達(dá)到了7 ?，即0.7 nm[11]。這是人們第一次觀測到膜蛋白的跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，也是人類首次利用電鏡技術(shù)看清生物樣品的二級結(jié)構(gòu)。此時冷凍電鏡技術(shù)尚未誕生，沒有冷凍技術(shù)的幫助，只能依靠二維晶體中大量規(guī)則排列的分子平均效應(yīng)抵消輻射損傷的影響，這實在是一個讓人覺得不可思議的偉大創(chuàng)舉。15年后，在冷凍技術(shù)的幫助下，Henderson教授成功地將細(xì)菌視紫紅質(zhì)二維晶體結(jié)構(gòu)分辨率推至了3.5 ?[12](圖2)?？上У氖?，這樣一個劃時代的工作并沒有獲得膜蛋白結(jié)構(gòu)領(lǐng)域的諾貝爾獎，因為在更早一點的1984年，德國科學(xué)家米歇爾使用X射線晶體學(xué)方法成功得到了細(xì)菌光合作用中心蛋白質(zhì)復(fù)合物的3 ?分辨率的結(jié)構(gòu)，并獲得了1988年的諾貝爾化學(xué)獎。但是這絲毫不影響這些工作的重要性，因為這是人類真正意義上第一次利用電鏡技術(shù)獲得的生物樣品高分辨結(jié)構(gòu)，證明了電鏡技術(shù)在生物研究領(lǐng)域的潛力。Henderson教授和他的同事們跑遍了世界各個電鏡平臺來優(yōu)化他們的數(shù)據(jù)，并系統(tǒng)地分析研究了限制電鏡在生物樣品上分辨率的主要因素。雖然在那個年代X射線晶體學(xué)的光芒正如日初升，并在接下來20多年里一直是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域最主要的技術(shù)手段，吸引了大量的目光和資源；但是，Henderson并沒有因為X射線晶體學(xué)的強大技術(shù)壓力而放棄冷凍電鏡技術(shù)。相反，他深刻地洞察到了冷凍電鏡的潛力，并在這篇里程碑式的文章里總結(jié)道，隨著未來電鏡硬件性能的提升和制樣方法的改進(jìn)，冷凍電鏡一定會成為一項“常規(guī)的、快速的、可以獲得更多非常困難的樣品結(jié)構(gòu)的技術(shù)手段，即使不用晶體學(xué)的方法(This would then turn the technique we have been using into a routine and quick method,able to be used on many more difficult specimens,eventually including non-crystalline molecular assemblies)”[12]。他說的是Joachim Frank教授正在發(fā)展的冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)。此后，Henderson將全部精力和心血都投入到了冷凍電鏡相關(guān)理論和方法的研究中，并以他深厚的物理學(xué)和電子顯微學(xué)功底，加上非凡的洞察力，論證了冷凍電鏡三維重構(gòu)實現(xiàn)原子分辨率的可行性，并給出了一系列理論和實驗上的準(zhǔn)確預(yù)見[13]。毫不夸張地說，在冷凍電鏡這個當(dāng)時還只是小眾的、冷門的甚至很多人都不看好的領(lǐng)域里，正是Henderson用他的遠(yuǎn)見卓識，逆流而上，鼓舞著大家砥礪前行，最終在一場分辨率革命的狂風(fēng)暴雨后，開創(chuàng)了一個獨屬于冷凍電鏡的輝煌時代。在這場革命風(fēng)暴中，Henderson教授一直是重要的發(fā)起者、參與者和推動者。在他20世紀(jì)90年代諸多非凡預(yù)見性的文章里，他敏銳地提出了電子束導(dǎo)致的樣品漂移是制約生物樣品高分辨率的關(guān)鍵。后來直接引爆電鏡分辨率革命的直接電子探測器(direct electron device，簡稱DED；有時候也會命名為direct detection device，簡稱DDD)，正是解決樣品漂移問題的最佳方式之一，而他本人也直接投入到直接電子探測器的開發(fā)工作中并作出了重要貢獻(xiàn)。另一項革命性的重要因素在于高分辨圖像處理算法的改進(jìn)，以MRC實驗室的Sjors Scheres博士開發(fā)的Relion程序作為代表。

圖2 左圖為1975年Henderson等發(fā)表的細(xì)菌視紫紅質(zhì)的7 ?分辨率模型(來自文獻(xiàn)[11])；右圖為1990年Henderson等發(fā)表的細(xì)菌視紫紅質(zhì)3.5 ?分辨率模型(來自文獻(xiàn)[12])

4 冷凍電鏡技術(shù)的誕生與三維重構(gòu)技術(shù)的發(fā)展

電鏡技術(shù)用于生物學(xué)研究早在Ruska發(fā)明電鏡后就開始，然而它真正開始進(jìn)入佳境，應(yīng)該要算冷凍電鏡技術(shù)誕生之后。雖然前面提到Glaeser教授和他的學(xué)生Ken Taylor早在1974年就開始了冷凍方法的研究，但第一個發(fā)明真正意義上有效并實用化的樣品冷凍方法的是海德堡歐洲分子生物學(xué)實驗室(EMBL)的Jacques Dubochet教授和他領(lǐng)導(dǎo)的小組。Dubochet教授是位非常聰明幽默的科學(xué)家，這點可以從他在洛桑大學(xué)官網(wǎng)上寫的簡歷就可以看出來。從1978年開始，作為EMBL小組的領(lǐng)頭人，他系統(tǒng)研究了水在冷凍條件下的各種性狀，并最終在1981年12月發(fā)表了他如何在制備電鏡樣品時讓水成功進(jìn)入玻璃態(tài)的方法，就是迅速冷凍，跳過形成冰晶的階段，直接進(jìn)入玻璃態(tài)[14]。玻璃態(tài)是水在氣態(tài)、液態(tài)和固態(tài)外的另一種狀態(tài)。要使水進(jìn)入玻璃態(tài)，必須急速冷凍到-108 ℃。玻璃態(tài)水和冰不一樣，它沒有固定形狀，沒有晶體結(jié)構(gòu)，而且水在玻璃態(tài)下密度和液態(tài)密度相同。這對于生物樣品有著特殊意義，因為冰的密度比水要小10 %，水一旦結(jié)冰，生物樣品就會體積膨脹而破壞結(jié)構(gòu)，而如果能直接進(jìn)入玻璃態(tài)，就可以避免這個問題。在嘗試液氮失敗后，Dubochet和他的小組使用液態(tài)乙烷或丙烷成功實現(xiàn)了冷凍生物樣品的方法，并在1984年《Nature》雜志上展示了他們利用這種方法成功獲得的病毒照片[15](圖3)。通過這種方法冷凍后的樣品，完整地保持了其天然狀態(tài)，有效減少了電子對樣品的輻射損傷(能降低4～5倍)，還能提供非常不錯的襯度。該方法成功解決了自從電鏡誕生后的50年內(nèi)一直困擾生物學(xué)界的問題：“水是生命體組織最豐富的存在，卻一直被電鏡技術(shù)排除在外(The most abundant constituent of living things,water, has invariably been excluded) ”，所以一經(jīng)問世，便廣為流傳，一直到今天都是冷凍電鏡領(lǐng)域，包括單顆粒重構(gòu)技術(shù)和斷層掃描技術(shù)里最主要的樣品制備手段。冷凍電鏡真正的強大，正在于它可以“冷凍一切”，無論是生物組織、溶液中的大分子、病毒或者核糖體，只要有需求，冷凍電鏡都可以通過冷凍的手段來幫助我們觀察生物對象，并提供重要的結(jié)構(gòu)信息。

圖3 Dubochet和其小組開發(fā)的冷凍樣品制備流程(圖片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en17_dubochetspreparationmethod.pdf，最下方的冷凍病毒照片來自文獻(xiàn)[15] )

冷凍電鏡技術(shù)獲得生物學(xué)樣品結(jié)構(gòu)信息的最主要武器，在于三維重構(gòu)。正如前文所提，Joachim Frank正是開發(fā)這個武器的鼻祖。出身于德國的Frank師從電子顯微領(lǐng)域的先驅(qū)Hoppe教授，擁有非常好的數(shù)理基礎(chǔ)和德國人特有的嚴(yán)謹(jǐn)認(rèn)真。正如Hoppe教授主張的那樣，F(xiàn)rank也相信可以不通過結(jié)晶對任意形狀的樣品進(jìn)行直接三維重構(gòu)并獲得其空間結(jié)構(gòu)信息。想要做到這一點，就必須要準(zhǔn)確知道電鏡照片上每個顆粒的取向參數(shù)，包括兩個平移參數(shù)和三個空間角度參數(shù)。但是，這對于不染色、不結(jié)晶、沒有對稱性、隨機角度分布的冷凍樣品而言，是非常困難的。尤其是電鏡圖像的背景噪音非常嘈雜，想要從中準(zhǔn)確識別可用于顆粒對齊的特征，具有很大的挑戰(zhàn)性[16]。從20世紀(jì)70年代開始，F(xiàn)rank和他的同事們一起，開始嘗試使用互相關(guān)函數(shù)(crosscorrelation functions)來對齊顆粒，并在1977年通過理論分析表明，在非破壞性的電子劑量下獲得的隨機取向的多個顆?？梢酝ㄟ^互相關(guān)函數(shù)來準(zhǔn)確進(jìn)行對齊[17]。同時，他還提出了可以使用類平均技術(shù)來降低噪音，幫助求取正確的取向并最終獲得高分辨結(jié)構(gòu)[18]。雖然限于當(dāng)時的生物制樣技術(shù)和電鏡本身的瓶頸，所研究的負(fù)染色樣品的三維重構(gòu)還無法獲得高分辨率結(jié)構(gòu)，但這兩大基本思路成為了后來冷凍電鏡三維重構(gòu)技術(shù)最基本的概念(圖4)。非結(jié)晶生物樣品的單顆粒三維重構(gòu)還有另一重大困難，那就是樣品本身的不均一。電鏡單顆粒三維重構(gòu)的一個基本假設(shè)是電鏡照片上的每一個顆粒是來自于均一樣品的不同取向的投影，但絕對均一的樣品是不存在的，即使純化分離得再好，樣品本身也是有多種狀態(tài)的。為了解決這個問題，1981年Frank和Van Heel一起提出了分類的方法，依據(jù)顆粒本身的取向和特征，借助多元統(tǒng)計分析，分成諸多亞類[19]。為了確定這些二維亞類和自身在三維空間中的關(guān)系，F(xiàn)rank和Michael Radermacher提出了著名的RCT(random conical tilt)法[20]。這些圖像處理的算法都被集成到了他們開發(fā)的三維重構(gòu)軟件SPIDER中，供科學(xué)研究人員免費使用，并為電鏡三維重構(gòu)的推廣起了重要作用。除了電鏡三維重構(gòu)技術(shù)，F(xiàn)rank還一直致力于使用冷凍電鏡研究核糖體相關(guān)結(jié)構(gòu)，并做了很多開創(chuàng)性的工作，為核糖體研究作出了重大貢獻(xiàn)。在X射線晶體學(xué)還沒能獲得足夠高的核糖體分辨率的時候，F(xiàn)rank教授對核糖體的電鏡解析工作為核糖體的研究提供了巨大的幫助，而且后來被人廣泛使用的核糖體制樣方式也是Frank教授的研究組所完善的。可惜當(dāng)年核糖體結(jié)構(gòu)的諾貝爾獎授予的科學(xué)家沒有包括他，而是授予了采用X射線晶體學(xué)獲得核糖體原子分辨率的三位科學(xué)家。隨著冷凍電鏡的革命性突破，以前用X射線晶體學(xué)研究核糖體的實驗室如今也大量采用冷凍電鏡技術(shù)。Frank教授現(xiàn)在這個因冷凍電鏡三維重構(gòu)而獲得的諾貝爾化學(xué)獎，可謂實至名歸。

圖4 Joachim Frank開發(fā)的電鏡三維重構(gòu)基本策略(圖片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en_17_dubochetspreparationmethod.pdf)

5 冷凍電鏡分辨率革命

讓冷凍電鏡這個小眾領(lǐng)域突然成為一個熱門研究領(lǐng)域的，正是前面所提到的那場分辨率革命風(fēng)暴：直接電子探測器的使用以及三維重構(gòu)算法的突破。直接電子探測器早前在天文學(xué)領(lǐng)域就已率先開始使用。2005年前后，冷凍電鏡技術(shù)解析的結(jié)構(gòu)分辨率還較低，當(dāng)時能做到的最好分辨率是利用高對稱病毒顆粒求解的7.4 ?，如果是大一點的復(fù)合物，譬如核糖體，則只能做到11.5 ?左右。當(dāng)時電鏡照片的記錄載體是膠片或CCD(charged coupled device)。膠片比實時方便的CCD擁有更好的探測效率(detective quantum efficiency，簡稱DQE)，但非常費時。人們迫切需要一個全新的、能高效率探測到電子(提升信噪比)同時還能方便快速實時的相機。來自加州大學(xué)圣地亞哥分校(UCSD)、伯克利國家實驗室(LBNL)和加州大學(xué)歐文分校(UCI)的聯(lián)合小組，以及MRC實驗室Faruqi和Henderson領(lǐng)導(dǎo)的小組都將目光轉(zhuǎn)向了直接電子探測器，并分別獨立發(fā)表了他們的工作[21-22]。后來UCSD和UCI的小組開發(fā)了DE(direct electron)相機，MRC小組和FEI公司合作開發(fā)了Falcon相機，LBNL小組以及加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的David Agard教授則幫助Gatan公司開發(fā)了K2相機。2012年到2013年前后，這些直接電子探測器相機開始大范圍應(yīng)用到冷凍電鏡領(lǐng)域中。相比較傳統(tǒng)光電耦合的CCD相機，直接電子探測器可以精準(zhǔn)地計算出電子的位置來顯著地提高電鏡的圖像質(zhì)量，而且能用類似電影的方式快速記錄電鏡圖像，從而幫助我們追蹤并矯正樣品漂移軌跡，同時還可以矯正輻射損傷。這些優(yōu)勢都將冷凍電鏡的圖像質(zhì)量提高到了一個全新的臺階，使冷凍電鏡的分辨率因此得到了極大的提高，并達(dá)到可以和X射線相媲美的程度(圖5)。而且，冷凍電鏡技術(shù)不需要結(jié)晶，對樣品的質(zhì)量和使用量也遠(yuǎn)沒有晶體學(xué)需求的那么高，并且能利用三維分類等方法一次解出多種狀態(tài)的結(jié)構(gòu)，引起了研究者的極大關(guān)注，因此，許多傳統(tǒng)晶體學(xué)研究組也開始轉(zhuǎn)向并大量應(yīng)用冷凍電鏡技術(shù)。

除了直接電子探測器外，還有很多硬件上的突破，譬如高端場發(fā)射電子顯微鏡、更加穩(wěn)定的冷凍桿等，都促成了這一次分辨率的革命。隨著相位板技術(shù)的發(fā)展和球差矯正器的應(yīng)用，曾經(jīng)因為襯度極低而讓人們一籌莫展的小分子蛋白，利用電鏡技術(shù)解析其結(jié)構(gòu)也開始成為可能[23]。

在冷凍電鏡硬件技術(shù)不斷突破的時候，三維重構(gòu)算法也愈加完善和成熟。如何在強大的噪音干擾下對齊顆粒與分類，一直是冷凍電鏡三維重構(gòu)最艱難的挑戰(zhàn)。1998年，Sigworth開始將統(tǒng)計學(xué)領(lǐng)域久負(fù)盛名的最大似然估計法(maximumlikelihood estimators，簡稱ML算法)引入三維重構(gòu)算法中，用來對齊顆粒和二維分類[24]。來自西班牙國家生物技術(shù)中心的Jose Carazo教授和他的博士后Sjors Scheres一起將ML算法推廣到三維分類領(lǐng)域并集成到了他們的軟件包Xmipp中[25]。在ML算法基礎(chǔ)上，后來加入MRC的Sjors Scheres博士引入了貝葉斯方法，并開發(fā)了強大的Relion程序[26]。由于其交互頁面簡潔，不需要過多人工干預(yù)，對新手極其友好，加上強大的三維分類能力，很快便成為了冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)領(lǐng)域的流行軟件工具，幫助人們?nèi)〉靡粋€又一個漂亮而震撼的原子結(jié)構(gòu)。

圖5 冷凍電鏡分辨率革命：2013年后冷凍電鏡分辨率大幅提升，從此重構(gòu)出的電鏡生物樣品從圖左側(cè)變成了右側(cè)這樣(圖片摘自https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/fig_ke_en_17_blobology.pdf)

非常值得一提的是，在這一場冷凍電鏡技術(shù)革命中，一大批華人科學(xué)家作出了不可磨滅的貢獻(xiàn)。2013年底，加州大學(xué)舊金山分校(UCSF)的程亦凡教授和合作者首次利用冷凍電鏡技術(shù)解析了近原子分辨率的膜蛋白結(jié)構(gòu)，引起業(yè)內(nèi)轟動[27]。膜蛋白是結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域最具挑戰(zhàn)性的課題之一，一直以來人們都認(rèn)為冷凍電鏡很難對其有突破。然而，程亦凡教授領(lǐng)導(dǎo)的研究小組用

3.3 ?的分辨率告訴大家，冷凍電鏡的革命與輝煌已經(jīng)開始。除了程亦凡教授外，還有一大批華人學(xué)者在冷凍電鏡領(lǐng)域取得了諸多突破性成果。國內(nèi)這幾年在冷凍電鏡領(lǐng)域也獲得了許多意義重大、影響深遠(yuǎn)的成果。

6 回顧與展望

在冷凍電鏡取得輝煌成就的同時，更多的技術(shù)突破與驚喜正在前方等著我們。如今，冷凍電鏡已經(jīng)開始進(jìn)入自己的黃金年代，而這離電鏡問世，已經(jīng)過去了80多年，離冷凍電鏡技術(shù)誕生，也已經(jīng)過去了快40年。80年的風(fēng)雨與挑戰(zhàn)，40年的堅守與發(fā)展，終于迎來云開月明。這一切，沒有歷代先驅(qū)科學(xué)家們的努力，沒有Jacques Dubochet的冷凍制樣方法，沒有Joachim Frank的三維重構(gòu)技術(shù)，沒有Richard Henderson用事實和理論為整個領(lǐng)域指明方向與道路，是不可能做到的。得獎的是他們，榮譽卻屬于整個冷凍電鏡領(lǐng)域。雖然前方道路依然崎嶇，未來挑戰(zhàn)依舊，但冷凍電鏡的輝煌，才剛剛開始。

致謝 在本文的寫作中，要特別感謝劍橋大學(xué)MRC實驗室的張凱博士為本文提供的重要的史實資料和提出的寶貴意見。

(2017年11月16日收稿)

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科學(xué)家或發(fā)現(xiàn)地球最古老生命痕跡

一項新的研究表明，加拿大東北部的古代巖石中可能含有超過39.5億年的生命化學(xué)物質(zhì)。如果得到證實，這一發(fā)現(xiàn)將成為地球上已知最早的生命跡象，并將最古老生命的紀(jì)錄往前推了1億多年。

對一些科學(xué)家來說，這項研究增加了越來越多的證據(jù)，表明年輕的地球曾充滿了許多不同種類的生物體?！敖邮芩?！”英國倫敦大學(xué)學(xué)院的地球化學(xué)家Dominic Papineau說。他在2017年3月發(fā)表了一項研究成果，報告來自魁北克的至少可以追溯到距今37.7億年前的微生物化石。

但也有人對這項最新的工作是否經(jīng)得住推敲表示懷疑。許多之前宣稱的最古老生命形式一直存在激烈的爭論，這部分緣于數(shù)十億年前形成的巖石往往經(jīng)歷了嚴(yán)重的加熱和擠壓，使其地質(zhì)背景通常難以解釋，同時也緣于生命的化學(xué)痕跡在不涉及生物體的反應(yīng)中很難加以區(qū)分。

“當(dāng)讀到這篇文章的時候我想，‘我們要重新來過’?！比鸬渌沟赂鐮柲ψ匀粴v史博物館地質(zhì)學(xué)家Martin Whitehouse說。他在2002年發(fā)表了一篇研究報告，批評了有關(guān)格陵蘭島的一篇類似的古生物研究報告。

這項最新的研究調(diào)查了一組來自北拉布拉多的巖石，這些巖石被統(tǒng)稱為“薩格里克組”。由日本東京大學(xué)Tsuyoshi Komiya和Yuji Sano領(lǐng)導(dǎo)的一個研究團(tuán)隊在2011—2013年期間訪問了該地區(qū)，并在巖石的露頭中收集了樣本，而與此同時，武裝警衛(wèi)則一直在提防北極熊。

在2017年9月28日出版的《自然》雜志上，研究人員分析了巖石上的碳同位素和來自薩格里克組的石墨顆粒。在一些樣品中，他們發(fā)現(xiàn)與C-12相比，同位素C-13的含量相對較低。C-12是一種較輕的同位素，其原子核中含有較少的中子。生物體更喜歡用C-12來制造有機化合物，因此微生物曾經(jīng)生活過的物質(zhì)——比如薩格里克巖石——在較輕的同位素中變得更加豐富。

研究小組認(rèn)為，這些石墨顆粒源于古代生活在海中的細(xì)菌。它們能夠利用溶于海水的二氧化碳，隨著環(huán)境變化，這些細(xì)菌在海底慢慢成為巖石的一部分，最終殘留下這些石墨顆粒。

Komiya表示，在這些古老的、高度變形的巖石中找到生命的證據(jù)“令人驚訝和興奮”。他說，他和他的團(tuán)隊排除了其他可能的解釋，比如碳同位素的傾斜比例，比如礦物鐵元素的分解。而石墨似乎與其周圍的巖石在擠壓和加熱時所經(jīng)歷的溫度大致相同，這意味著石墨并非是后來被污染的。

在之前的論文中，Komiya的團(tuán)隊描述了“薩格里克組”的地質(zhì)歷史，并在一種叫做片麻巖的變質(zhì)巖中使用了鈾鉛進(jìn)行測年研究，結(jié)論是這種巖石已有39.5億年。研究人員說，含有生命跡象的石墨至少也應(yīng)該有這么古老。

科學(xué)界通常認(rèn)為地球誕生于約46億年前，此前發(fā)現(xiàn)的最早生命痕跡是在格陵蘭島，約有38億年歷史。新發(fā)現(xiàn)將地球生命的歷史前推了約1.5億年。但是也有一些科研人員表示，還需要更多證據(jù)才能讓新發(fā)現(xiàn)更有說服力。

Whitehouse表示:“這篇論文的其他內(nèi)容都是基于地質(zhì)年表，而地質(zhì)年表尚沒有被很好地建立起來。”他說，“這是一間用紙牌造的房子。”而Komiya則說，他支持自己團(tuán)隊的解釋。

研究格陵蘭島巖石中可能的生命化學(xué)物質(zhì)的丹麥哥本哈根自然歷史博物館地質(zhì)學(xué)家Minik Rosing對Komiya的研究團(tuán)隊表示贊揚，但也指出還有很多的工作需要完成。Rosing說：“這是一項很棒的研究，進(jìn)行了大量復(fù)雜且高質(zhì)量的分析工作?！彼瑫r認(rèn)為，這些巖石太復(fù)雜了，被研究的石墨“可能只有27億年的歷史，但依然能夠通過所有的測試”。

[關(guān)毅 編譯]

Cryo-EM in the past 40 years: A brief introduction to the Nobel Prize in Chemistry 2017

LI Chengmin
Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100101, China

Electron microscopes have a high resolving power to reveal the details of the micro world and are used to investigate the ultrastructure of a wide range of biological specimens. However, they were long believed to not suitable for imaging biological specimens to achieve high resolution structures, because the powerful electron beam would destroy biological material and some other challenges, until the advent of cryo-electron microscopy. In this paper, we briefly reviewed the history and methodological development of electron microscopy and cryo-electron microscopy in biological specimens.

cryo-EM, three-dimensional reconstruction, single particle analysis, high resolution

10.3969/j.issn.0253-9608.2017.06.004

?通信作者，E-mail: xinzhiguyu@gmail.com

(編輯：沈美芳)