小鼠急性心梗模型建立學(xué)習(xí)曲線及專業(yè)實(shí)驗(yàn)技能培養(yǎng)

趙璧君，譚延振，楊 劍，金振曉，熊紅燕，俞世強(qiáng)

·教學(xué)訓(xùn)練·

小鼠急性心梗模型建立學(xué)習(xí)曲線及專業(yè)實(shí)驗(yàn)技能培養(yǎng)

趙璧君，譚延振，楊 劍，金振曉，熊紅燕，俞世強(qiáng)

目的總結(jié)本實(shí)驗(yàn)室建立小鼠急性心肌梗死模型的學(xué)習(xí)曲線，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員在醫(yī)學(xué)研究生培養(yǎng)中的作用。方法4名有理論基礎(chǔ)無(wú)外科基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，進(jìn)行小鼠急性心肌梗死模型建立的培訓(xùn)，從術(shù)前死亡率、冠脈結(jié)扎準(zhǔn)確度及模型建立所需時(shí)間及穩(wěn)定性角度進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果經(jīng)過(guò)至少1個(gè)月培訓(xùn)，可以將術(shù)前小鼠死亡率降低至合理范圍(小于5%)；經(jīng)過(guò)至少六個(gè)月訓(xùn)練，心肌梗死模型可以在(20±2)min完成，穩(wěn)定性較好[四周后，左室射血分?jǐn)?shù)為(18±2)%]。結(jié)論實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員在研究生培養(yǎng)中起到重要作用，尤其是一些對(duì)時(shí)間、技能要求較高的平臺(tái)型技術(shù)，更是不可或缺。

實(shí)驗(yàn)室；技術(shù)人員；小鼠模型；急性心肌梗死

實(shí)驗(yàn)室是醫(yī)學(xué)研究的重要開(kāi)展場(chǎng)所，是研究生進(jìn)行課題研究的重要基地。實(shí)驗(yàn)室除了研究生，往往還有實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，他們肩負(fù)協(xié)助研究生完成課題、協(xié)助課題負(fù)責(zé)人實(shí)施課題和實(shí)驗(yàn)室管理等任務(wù)。作為具有一定科研經(jīng)歷的技術(shù)人員，他們?cè)谘芯可囵B(yǎng)中起到不可或缺的作用[12]。訓(xùn)練有素的專職技術(shù)人員，能從科研態(tài)度、科研思維及實(shí)際動(dòng)手能力等方面對(duì)研究生產(chǎn)生積極影響，將涉及科研的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)及實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)傳授給研究生，使其少走彎路。而缺乏專職技術(shù)人員時(shí)，研究生往往不得不在實(shí)驗(yàn)操作細(xì)節(jié)上花費(fèi)大量時(shí)間，以至于耽誤課題進(jìn)展[1]。

小鼠急性心肌梗死/心肌缺血再灌注模型是心血管內(nèi)外科和循環(huán)病理生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室常用的動(dòng)物模型，通過(guò)對(duì)冠狀動(dòng)脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎(心肌缺血)或結(jié)扎再松開(kāi)(心肌缺血再灌注)實(shí)現(xiàn)。該模型難點(diǎn)在于：①小鼠心臟表面可見(jiàn)血管全是靜脈，所要結(jié)扎的動(dòng)脈均走行于肌肉中，難以目視，只能憑借左心耳、心尖等部位憑經(jīng)驗(yàn)大致確定，準(zhǔn)確找到冠狀動(dòng)脈所在位置較為困難；②該模型所造成的心肌損傷與結(jié)扎相對(duì)位置直接相關(guān)，為保證結(jié)果準(zhǔn)確可靠，必須保證每次所扎位置一致，而結(jié)扎位置需要憑經(jīng)驗(yàn)確定，所以這也是缺血模型的一個(gè)難點(diǎn)。本文簡(jiǎn)要總結(jié)了本實(shí)驗(yàn)室4名技術(shù)人員訓(xùn)練和掌握這一專用動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)曲線，以期為心血管內(nèi)外科研究生培養(yǎng)和專業(yè)技術(shù)人員的訓(xùn)練提供參考。

1 材料與方法

1.1材料 無(wú)特定病原(SPF)級(jí)雄性健康C57BL/6J小鼠，體重約20 g，8周齡，購(gòu)買于空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物中心，普通喂養(yǎng)。

1.2參加培訓(xùn)人員 本研究室固定工作人員四名，均已獲得醫(yī)學(xué)及相關(guān)專業(yè)碩士學(xué)位，對(duì)本研究涉及器官、組織解剖結(jié)構(gòu)熟悉，無(wú)小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。

1.3小鼠心肌梗死模型建立訓(xùn)練 小鼠心肌梗死模型建立訓(xùn)練分三部分進(jìn)行：氣管插管、開(kāi)胸及模型建立。

1.3.1氣管插管訓(xùn)練 對(duì)小鼠進(jìn)行稱重后，通過(guò)腹腔注射按照400 μl/20 g體重給予25 mg/ml的2,2,2-三溴乙醇。待小鼠麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，脫去胸部左前區(qū)毛，連接心電監(jiān)護(hù)儀，檢測(cè)小鼠心電活動(dòng)。小鼠頭部朝向操作者，光源照射頸部凹陷以下位置，用鑷子輕輕夾住舌頭，用壓舌板輕壓舌根，可以看到一個(gè)明顯亮的圓點(diǎn)，另一手持軟導(dǎo)管輕輕送入，完成氣管插管，連接呼吸機(jī)。記錄一次插管成功率。

1.3.2開(kāi)胸訓(xùn)練 從左肋第3/4肋間，剪開(kāi)皮膚，外層肌肉由內(nèi)向外斜著打開(kāi)，內(nèi)層肌肉由外向內(nèi)斜著打開(kāi)，使用拉鉤，將開(kāi)口固定好，打開(kāi)心包膜，暴露心臟，從顯微鏡下觀察，看以看到鮮紅的冠脈。然后縫合，記錄小鼠死亡率。

1.3.3模型建立訓(xùn)練 用6-0絲線在小鼠冠脈左前降支距根部2～3 mm處打外科結(jié)造成心肌梗死。擠出胸腔內(nèi)空氣，將肌肉依次縫合，最后將皮膚縫合。等待小鼠有自主呼吸以后，撤掉呼吸機(jī)。待小鼠清醒后，正常飼養(yǎng)4周。記錄所需時(shí)間及準(zhǔn)確率。通過(guò)伊文氏藍(lán)染色和心臟功能測(cè)定評(píng)價(jià)模型建立穩(wěn)定性。

1.4小鼠心臟伊文氏藍(lán)染色 在麻醉狀態(tài)下，從左心室腔注入伊文氏藍(lán)(1%)1～2 ml。迅速摘取心臟，凍存于-20℃。該部分由是操作熟練專人完成。

1.5小鼠心臟功能測(cè)定 小鼠放入小動(dòng)物氣體麻醉機(jī)，給予含有2%異氟烷的氧氣進(jìn)行吸入麻醉，使用脫毛膏進(jìn)行胸前區(qū)脫毛。脫毛后，利用Vevo770小動(dòng)物超聲儀(VisualSonics，Toronto，Canada)檢測(cè)小鼠心臟功能。使用儀器自帶軟件通過(guò)測(cè)量收縮及舒張期時(shí)，心肌厚度計(jì)算小鼠心臟左室射血分?jǐn)?shù)(ejection fraction，EF)。該部分由是操作熟練專人完成。

2 結(jié) 果

2.1小鼠手術(shù)前準(zhǔn)備訓(xùn)練 本研究采用的是開(kāi)胸方式進(jìn)行模型制備，在開(kāi)胸前，需要進(jìn)行氣管插管。由于在模型建立后，還需要再喂養(yǎng)四周，所以氣管插管宜采用直視法，將插管直接送入氣管(圖1 A)。經(jīng)過(guò)一周氣管插管訓(xùn)練，一次成功率顯著提高(圖1 B)。在研究初期，由于操作不熟練，器械會(huì)多次造成肺損傷或者引發(fā)心臟停跳，導(dǎo)致小鼠死亡。經(jīng)過(guò)1周的開(kāi)胸訓(xùn)練，可以將小鼠手術(shù)前的死亡率顯著下降(圖1 C)，可以穩(wěn)定的控制在5%以下。

2.2準(zhǔn)確結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支 小鼠冠狀動(dòng)脈走行于心肌組織中，很難準(zhǔn)確判斷其準(zhǔn)確位置。為準(zhǔn)確結(jié)扎冠脈，需要進(jìn)行專門(mén)的訓(xùn)練。采用6-0絲線結(jié)扎之后，從左心室注入1%伊文式藍(lán)，結(jié)扎正確時(shí)，心臟被染成藍(lán)色，而左心室部分不會(huì)被染成藍(lán)色；不正確時(shí)，整個(gè)心臟都是藍(lán)色或者非左室區(qū)域不被染成藍(lán)色。經(jīng)過(guò)一個(gè)月的訓(xùn)練，準(zhǔn)確率提高明顯(P<0.05)，從第一周的(70±10)%升高到(94±2)%(圖2)。

2.3模型建立熟練程度及穩(wěn)定性 在能夠熟練完成氣管插管、打開(kāi)胸腔并暴露心臟及準(zhǔn)確結(jié)扎在冠脈位置后，進(jìn)一步進(jìn)行培訓(xùn)。目的是提高模型的穩(wěn)定性及縮短模型建立所需的時(shí)間。模型建立的時(shí)間包括小鼠麻醉后固定于手術(shù)臺(tái)、插管、開(kāi)胸、結(jié)扎及關(guān)胸縫合等一系列操作。經(jīng)過(guò)為期半年的培訓(xùn)，參加培訓(xùn)的人員基本都可以將所需時(shí)間從最初的(50±8)min縮短到(20±2)min(P<0.05)，這與文獻(xiàn)結(jié)果相似[3]。小鼠進(jìn)行心梗手術(shù)后飼養(yǎng)四周，通過(guò)小動(dòng)物心臟超聲，計(jì)算EF后，計(jì)算組內(nèi)EF%的誤差，評(píng)估模型的穩(wěn)定性，穩(wěn)定性明顯提高(P<0.05)：從第一個(gè)月心臟超聲EF值(28±10)%降低到(18±2)%，說(shuō)明心梗模型穩(wěn)定性較好[4-5]。見(jiàn)圖3。

注： A 小鼠氣管直視；B 氣管插管一次成功率；C 術(shù)前死亡率；與7 d相比*P<0.01。圖1 小鼠手術(shù)前準(zhǔn)備訓(xùn)練

注：與1week相比*P<0.05。圖2 結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支準(zhǔn)確率

注：A:模型建立時(shí)間變化；B:模型穩(wěn)定性變化；與1 month相比*P<0.05；#與5 m相比P<0.05。圖3 小鼠急性心肌梗死模型建立熟練程度及穩(wěn)定性變化趨勢(shì)

3 討 論

筆者曾赴美國(guó)天普大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)心臟領(lǐng)域著名實(shí)驗(yàn)室交流學(xué)習(xí)。最大的感受就是美國(guó)實(shí)驗(yàn)室的專業(yè)化：一項(xiàng)研究，被劃分為若干個(gè)小的研究，由擅長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)室專職人員協(xié)助展開(kāi)實(shí)施，相互之間緊密配合，保證了研究的順利實(shí)施，也保證了結(jié)果的可靠性。以某個(gè)藥物在心臟功能方面的研究為例，轉(zhuǎn)基因鼠的制備與繁育、動(dòng)物模型的制備、心臟超聲測(cè)定與分析和壓力-容積導(dǎo)管的測(cè)定及分析等重要環(huán)節(jié)均有擅長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)室專職人員進(jìn)行操作或者指導(dǎo)操作，保證最終得到的結(jié)果真實(shí)可靠。

反觀國(guó)內(nèi)，與這些著名的實(shí)驗(yàn)室還具有一定差距。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室，所配備專職人員，多進(jìn)行研究設(shè)計(jì)或者從事大型儀器操作為主。研究多需要博士生或者碩士生全程進(jìn)行操作及分析。在研究生階段，需要進(jìn)行文化課學(xué)習(xí)、研究實(shí)施、文章準(zhǔn)備及畢業(yè)論文準(zhǔn)備等過(guò)程，真正可以用于研究的時(shí)間有限，對(duì)于較為復(fù)雜及需要訓(xùn)練很多的技能，難以做到熟練掌握。

為了解決這個(gè)困境，筆者的解決辦法是挑選1～2名實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員，悉心指導(dǎo)，使其熟練掌握并精通其中一項(xiàng)耗時(shí)耗力的技能，建立一個(gè)可靠的技術(shù)平臺(tái)。充分利用實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員穩(wěn)定的特點(diǎn)，將一些關(guān)鍵的實(shí)驗(yàn)技術(shù)規(guī)范化，既保證給研究生提供有力的技術(shù)支持又保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的真實(shí)、可靠及可重復(fù)性。

醫(yī)學(xué)研究生的導(dǎo)師和輔導(dǎo)老師，大多具有繁重的醫(yī)療任務(wù)和教學(xué)任務(wù)，限于有限的精力，往往只能給出課題計(jì)劃、思路等較為宏觀的指導(dǎo)，在細(xì)節(jié)方面則很難抽出足夠的精力，給予指導(dǎo)。相反，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員與研究生的相處時(shí)間很多，可以從科研思維、理論知識(shí)及動(dòng)手能力等方面給予其較大影響[6]。

實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員大多具有碩士及以上學(xué)位或者長(zhǎng)期從事科研的經(jīng)歷，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的科研訓(xùn)練，具有良好的發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題和解決問(wèn)題的能力，在科研思維、課題規(guī)劃、理論知識(shí)儲(chǔ)備、實(shí)際操作等方面對(duì)研究生產(chǎn)生重要影響，增強(qiáng)其創(chuàng)新能力，保障研究順利進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員分工明確，積極推動(dòng)各項(xiàng)規(guī)章制度的制定和執(zhí)行，營(yíng)造一個(gè)良好的科研氛圍，無(wú)疑會(huì)對(duì)研究生的科研活動(dòng)產(chǎn)生積極的結(jié)果[2, 6-9]。科研工作需要嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì)，更需要良好的實(shí)踐才能得到可靠的結(jié)果。研究生經(jīng)過(guò)本科階段的學(xué)習(xí)和研究生階段的學(xué)習(xí)，對(duì)本專業(yè)相關(guān)知識(shí)掌握良好，而動(dòng)手能力卻是不可避免的短板。研究生在開(kāi)始課題研究之后，需要經(jīng)過(guò)大量訓(xùn)練并認(rèn)真總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)后，才能掌握良好的實(shí)驗(yàn)技能，順利開(kāi)展課題研究。

研究生在理論學(xué)習(xí)階段，實(shí)踐機(jī)會(huì)有限，所學(xué)實(shí)驗(yàn)技能不能滿足課題研究需要。實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員在實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期工作于科研一線，對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備性能及使用具有深入了解，對(duì)實(shí)驗(yàn)操作熟悉，積累了豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。研究生在科研過(guò)程中，具體實(shí)驗(yàn)遇到問(wèn)題，實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員可以從試劑、儀器、操作步驟、注意事項(xiàng)和操作技巧等角度給予指導(dǎo)，傳授自己的“獨(dú)家”經(jīng)驗(yàn)，保證其得到真實(shí)可靠的數(shù)據(jù)和結(jié)果，提高研究生的實(shí)驗(yàn)技能，推動(dòng)研究的進(jìn)展。

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Thelearningcurveofestablishinganacutemyocardialinfarctioninmiceandthetrainingoflaboratorytechnicians

Zhao Bi-jun, Tan Yan-zhen, Yang Jian, Jin Zhen-xiao, Xiong Hong-yan, Yu Shi-Qiang

DepartmentofCardiothoracicSurgery,Xi'anCentralHospital,Xi'an710003,China

XiongHong-yan,Email:xionghy000@163.com

ObjectiveTo analyze the learning curve of establishing an acute myocardial infarction (AMI) in mice, with an eye on the importance of laboratory technicians in the training of medical postgraduates.MethodsFour volunteers with no operation basis were involved to establish AMI models of mice which were evaluated from the preoperative mortality, accuracy, the required time and stability.ResultsAfter at least 1 months of training, the preoperative mortality of mice was reduced to a reasonable range (less than 5%); after at least six months of training, operations can be done in (20±2) min.ConclusionLaboratory technicians play an important role in the training of medical postgraduates, especially in some of demanding platform techniques.

Laboratory; Technician; Mouse model; Acute myocardial infarction

10.13498/j.cnki.chin.j.ecc.2017.04.10

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81570231，81570230，81570232)

710032 西安，空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管外科(趙璧君，譚延振，楊 劍，金振曉，熊紅燕，俞世強(qiáng))；710003 西安，西安市中心醫(yī)院心胸外科(熊紅燕)

熊紅燕，E-mail：xionghy000@163.com

2017-07-04)

2017-08-17)