Zn2+對青蛤的脅迫效應(yīng)

梁 健，李永仁，郭永軍，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

Zn2+對青蛤的脅迫效應(yīng)

梁 健，李永仁，郭永軍，邢克智

( 天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384 )

在鹽度25和水溫26～28 ℃下，將殼長為(35.32±0.89) mm的青蛤暴露于Zn2+質(zhì)量濃度10.00、19.95、39.81、79.43、158.49、316.23 mg/L試驗(yàn)組及空白對照組，得出Zn2+的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度；之后又研究了Zn2+在青蛤鰓和內(nèi)臟團(tuán)中的蓄積和血淋巴液中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶的活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+的96 h半致死質(zhì)量濃度為191.56 mg/L，安全質(zhì)量濃度為1.92 mg/L；96 h半致死質(zhì)量濃度下， Zn2+在青蛤鰓中蓄積速度快于內(nèi)臟團(tuán)，血淋巴液中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和酸性磷酸酶活性呈先誘導(dǎo)再抑制的趨勢，安全質(zhì)量濃度下無明顯變化，但均高于對照組；兩種組織中的Zn2+質(zhì)量濃度與處理時間呈正相關(guān)。本研究結(jié)果為青蛤健康養(yǎng)殖和毒理學(xué)研究提供了參考。

青蛤；Zn2+；急性毒性；蓄積過程；生化指標(biāo)

青蛤(Cyclinasinensis)別稱赤嘴仔，外殼青黑色，外緣有紫色環(huán)，因而得名赤嘴蛤，主要分布于朝鮮半島、日本、中國大陸及臺灣海區(qū)，常棲息于近高潮區(qū)和中潮區(qū)的泥沙灘中[1-2]。青蛤營濾食性埋棲生活, 埋棲深度與規(guī)格、季節(jié)及底質(zhì)有關(guān)。青蛤的水管較長，濾食硅藻及浮游生物和有機(jī)碎屑[2]，對重金屬等污染物有極強(qiáng)的吸附積累作用，極易受污染。近年來隨著沿海經(jīng)濟(jì)的發(fā)展, 工廠水以及生活污水大量排入, 海水環(huán)境污染日益嚴(yán)重,給沿海貝類養(yǎng)殖業(yè)帶來嚴(yán)重危害，重金屬污染導(dǎo)致的海洋貝類死亡引起了廣泛關(guān)注，已報道有長牡蠣(Crassostreagigas)[3]、海灣扇貝(Argopectenirradias)[4]、櫛孔扇貝(Chlamysfarreri)[5]、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[6]、毛蚶(Scapharcasubcrenata)[7]、紫貽貝(Mytilusedulis)[8]等。對青蛤的研究主要集中在監(jiān)測養(yǎng)殖或自然環(huán)境中其體內(nèi)重金屬的含量[9]，對重金屬的毒性、蓄積及免疫機(jī)能的研究較少，僅見Zn2+、Cd2+對幼貝的影響[10]，而Zn2+對青蛤成貝的毒性及在不同組織中的蓄積研究則未見報道。鋅是生物體所必需的微量元素之一,對生物的生長、發(fā)育、遺傳、免疫和內(nèi)分泌等重要生理過程起重要作用。但攝入過量的鋅會威脅到生物的生存，通過食物鏈的蓄積作用間接威脅人類的健康。本研究利用水生生物急性毒性試驗(yàn)方法測定了Zn2+對青蛤的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度，在此基礎(chǔ)上研究了青蛤不同組織對Zn2+的蓄積能力及血淋巴液中免疫相關(guān)酶的活性變化，以探明青蛤的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

于2014年7月，從天津獨(dú)流減河河口處采捕的青蛤中，選擇個體完整，規(guī)格相近，活力良好的個體作為試驗(yàn)用貝，放入室內(nèi)沙濾海水中暫養(yǎng)5 d，海水鹽度25，水溫26～28 ℃，pH 8.20～8.32，連續(xù)充氣，日換水一次，投喂小球藻(Chlorellavulgaris)，暫養(yǎng)后挑選閉殼反應(yīng)迅速、平均殼長為(35.32±0.89) mm的個體進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2 Zn2+對青蛤的急性毒性試驗(yàn)

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果和等對數(shù)間距法[11]，本試驗(yàn)設(shè)置Zn2+離子質(zhì)量濃度為10.00、19.95、39.81、79.43、158.49、316.23 mg/L的試驗(yàn)組及空白對照組，每組設(shè)3個平行。使用40 L藍(lán)色塑料箱進(jìn)行試驗(yàn)，每組放青蛤30枚，試驗(yàn)期間不投餌、不充氣，日半量換水1次，及時挑出死亡個體。試驗(yàn)開始后24、48、72、96 h統(tǒng)計(jì)各組青蛤死亡數(shù)。貝殼張開，外套膜收縮，用玻璃棒輕觸碰長時間未反應(yīng)視為死亡。

1.3 青蛤?qū)n2+的蓄積試驗(yàn)

在前面試驗(yàn)得出的Zn2+的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度下，養(yǎng)殖健康青蛤，每組10枚，設(shè)3個平行，6、12、36、72、96、120 h和168 h，各試驗(yàn)組解剖青蛤5枚，分離鰓和內(nèi)臟團(tuán)，稱量質(zhì)量后加入到放有消化液(硝酸和高氯酸4∶1)的消化試管中加熱消化至液體澄清，用天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)分析測試中心的原子吸收分光光度計(jì)(上海普析，型號TAS-990super)測定Zn2+質(zhì)量濃度。試驗(yàn)期間不投餌、不充氣，日半量換水1次，及時挑出死亡個體。

1.4 免疫指標(biāo)測定

在蓄積試驗(yàn)的6、12、24、36、48、72、96、120、144、168 h，自圍心腔抽取血淋巴液，并混合。每組隨機(jī)取青蛤5枚，4 ℃、6000 r/min，離心10 min，取上清液，用南京建成生物工程公司提供的試劑盒測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶的活性及總蛋白的含量。

1.5 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 17.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸分析，檢驗(yàn)顯著性(P<0.05)，計(jì)算96 h半致死質(zhì)量濃度(LC50)、95%置信區(qū)間和相關(guān)系數(shù)r2。

安全質(zhì)量濃度按下式計(jì)算[12]：

安全質(zhì)量濃度=96 h LC50×AF

式中，AF為應(yīng)用系數(shù)，設(shè)為0.01。

2 結(jié) 果

2.1 Zn2+對青蛤的急性毒性

不同質(zhì)量濃度Zn2+對青蛤的毒性見表1。采用SPSS 17.0軟件線性回歸統(tǒng)計(jì)分析表明，死亡率概率單位與Zn2+質(zhì)量濃度對數(shù)的相關(guān)方程為y= -5.518+2.418x，相關(guān)系數(shù)r2=0.865。96 h半致死質(zhì)量濃度為191.56 mg/L，95%置信區(qū)間為149.79～266.31 mg/L，安全質(zhì)量濃度為1.92 mg/L。

表1 不同質(zhì)量濃度Zn2+對青蛤的急性毒性

2.2 青蛤?qū)n2+的蓄積

在96 h半致死質(zhì)量濃度脅迫下，Zn2+在青蛤鰓和內(nèi)臟團(tuán)的含量隨時間延長而升高，在鰓中的平均蓄積量為2.16 μg/(g·h)；在內(nèi)臟團(tuán)中的平均蓄積量為0.86 μg/(g·h)。整個試驗(yàn)過程中，鰓中的Zn2+含量始終高于內(nèi)臟團(tuán)(表2)。

表2 96 h半致死質(zhì)量濃度(191.56 mg/L)脅迫下青蛤各組織內(nèi)Zn2+含量

安全質(zhì)量濃度脅迫下， Zn2+在鰓中的平均蓄積量為0.22 μg/(g·h)，內(nèi)臟團(tuán)中平均蓄積量為0.15 μg/(g·h)，鰓組織中Zn2+的含量在初期低于內(nèi)臟團(tuán)，36 h后超過內(nèi)臟團(tuán)(表3)。

表3 安全質(zhì)量濃度脅迫(1.92 mg/L)下青蛤各組織內(nèi)Zn2+含量

2.3 Zn2+對青蛤血淋巴生化指標(biāo)的影響

96 h半致死質(zhì)量濃度處理組超氧化物歧化酶活性變化呈“誘導(dǎo)—抑制”趨勢，在36 h達(dá)峰值95.06 U/mg，隨后下降，144 h后與對照組差異不顯著(P>0.05)。安全質(zhì)量濃度處理組超氧化物歧化酶活性穩(wěn)定，顯著高于對照組(P<0.05)(圖1)。

兩試驗(yàn)組的過氧化氫酶活性高于對照組，呈“誘導(dǎo)—抑制”的變化趨勢，只是達(dá)到峰值的時間不同。96 h半致死質(zhì)量濃度處理組在48 h達(dá)到峰值12.03 U/mg，安全質(zhì)量濃度處理組在72 h時達(dá)到峰值11.17 U/mg(圖2)。

整個試驗(yàn)期間，96 h半致死質(zhì)量濃度處理組的酸性磷酸酶活性均處于較高水平，顯著高于對照組(P<0.05)，在24 h時達(dá)到峰值3.15 U/mg。而安全質(zhì)量濃度處理組的酸性磷酸酶活性較為穩(wěn)定，略高于對照組，峰值(2.38 U/mg)出現(xiàn)在48 h(圖3)。

圖1 不同Zn2+質(zhì)量濃度下青蛤血淋巴液中超氧物歧化酶的活性同一時間點(diǎn)上字母相同的表示差異不顯著(P>0.05)，下同.

圖2 不同Zn2+質(zhì)量濃度下青蛤血淋巴液中過氧化氫酶的活性

圖3 不同Zn2+質(zhì)量濃度下青蛤血淋巴液中酸性磷酸酶的活性

3 討 論

3.1 Zn2+對青蛤的毒性

本試驗(yàn)中，Zn2+對青蛤的96 h半致死質(zhì)量濃度為191.56 mg/L，安全質(zhì)量濃度為1.92 mg/L。有研究指出，Zn2+對青蛤幼貝的96 h半致死質(zhì)量濃度為160 mg/L[10]，略低于本試驗(yàn)的結(jié)果，這可能是由于試驗(yàn)貝類的規(guī)格差異所導(dǎo)致[本試驗(yàn)為2齡成貝，平均殼長(35.32±0.89) mm]。由劉瓊玉等[13]研究結(jié)果得知，菲律賓蛤仔對Zn2+的安全質(zhì)量濃度為0.87 mg/L，這表明青蛤抵御Zn2+毒性的能力要遠(yuǎn)高于菲律賓蛤仔。

本試驗(yàn)中青蛤Zn2+安全質(zhì)量濃度(1.92 mg/L)，高于1997年頒布的海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(0.50 mg/L)[14]，但考慮到貝類對重金屬具有很強(qiáng)的累積作用，因此若發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖海區(qū)或池塘水體中的Zn2+質(zhì)量濃度接近或超過其安全質(zhì)量濃度時，應(yīng)及時采取措施，減少不必要的損失。

3.2 Zn2+在青蛤體內(nèi)的蓄積

重金屬一般是通過以下兩種方式進(jìn)入貝類體內(nèi)并蓄積：一、由表皮滲透入組織中，通過血液循環(huán)被輸送到其他組織器官；二、攝食消化過程中間接地被貝類所攝入。在半致死質(zhì)量濃度脅迫下，各組織對Zn2+的蓄積能力順序?yàn)椋忽w>內(nèi)臟團(tuán)，這可能與鰓作為呼吸器官直接接觸高質(zhì)量濃度Zn2+的海水，通過滲透作用進(jìn)入鰓組織中有關(guān)。安全質(zhì)量濃度脅迫下，在72 h之前各組織對Zn2+的蓄積能力順序?yàn)椋簝?nèi)臟團(tuán)>鰓，這可能與內(nèi)臟團(tuán)的解毒作用和金屬硫蛋白的誘導(dǎo)作用有關(guān)。金屬硫蛋白是一種低分子量、能被金屬誘導(dǎo)表達(dá)的金屬結(jié)合蛋白[15]，廣泛存在于生物體內(nèi)。脅迫初期進(jìn)入體內(nèi)的Zn2+達(dá)到一定質(zhì)量濃度后便誘導(dǎo)內(nèi)臟團(tuán)組織啟動金屬硫蛋白的合成，并被金屬硫蛋白結(jié)合以減輕其毒性[16]。但隨著脅迫時間的增加，體內(nèi)Zn2+的質(zhì)量濃度不斷增加，與金屬硫蛋白的結(jié)合達(dá)到飽和而溢出，通過滲透作用進(jìn)入鰓組織的Zn2+便無處可去而停留在鰓中，這可能就是本試驗(yàn)72 h后鰓組織的蓄積能力超過內(nèi)臟團(tuán)的原因。

3.3 Zn2+對青蛤抗氧化酶活性的影響

重金屬進(jìn)入生物體后會誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生大量的H2O2、·OH等活性氧自由基，破壞生物體內(nèi)的活性氧平衡，造成多種類型的氧化損傷[17-18]，而超氧化物歧化酶、過氧化氫酶往往是生物體防御氧化應(yīng)激的第一道防線。這兩種酶組成超氧化物歧化酶—過氧化氫酶系統(tǒng)以清除體內(nèi)因污染脅迫產(chǎn)生的過多活性氧自由基[19]。本研究中，在Zn2+96 h半致死質(zhì)量濃度脅迫初期，青蛤血淋巴液中的超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性均顯著高于對照組(P<0.05)，表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)。但隨著高質(zhì)量濃度重金屬脅迫時間的增加，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性降低甚至受到抑制，生物體內(nèi)出現(xiàn)大量氧自由基，損傷機(jī)體，總體表現(xiàn)出“先誘導(dǎo)—后抑制”趨勢。不同種類的貝類對不同重金屬脅迫也出現(xiàn)相似結(jié)果。如陳琳琳等[20]的研究結(jié)果表明，Hg能夠在短期內(nèi)增加紫貽貝抗氧化酶的活性，但隨著脅迫時間的延長，會明顯抑制相關(guān)抗氧化酶的活性。丁鑒峰等[21]發(fā)現(xiàn)，隨著不同地區(qū)的污染程度加重，菲律賓蛤仔的超氧化物歧化酶活性逐漸升高，但當(dāng)污染程度達(dá)到一定時，超氧化物歧化酶活性急劇下降。筆者在做Cu2+對青蛤的脅迫效應(yīng)影響的試驗(yàn)中也證實(shí)了上述觀點(diǎn)(待發(fā)表)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因可能為，重金屬進(jìn)入生物體后激活體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)合成抗氧化酶以清除活性氧自由基，形成脅迫初期抗氧化酶活性升高的現(xiàn)象。但長時間脅迫下超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性大幅度降低，表明高質(zhì)量濃度金屬離子長時間脅迫下抑制了抗氧化酶的活性。

本試驗(yàn)中，在Zn2+安全質(zhì)量濃度(1.92 mg/L)脅迫下，青蛤的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性顯著高于對照組，Stebbing[22]將這種低質(zhì)量濃度重金屬脅迫下出現(xiàn)的增益現(xiàn)象，稱為“毒物興奮效應(yīng)”。這也說明Zn2+脅迫對超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性的誘導(dǎo)與質(zhì)量濃度和脅迫時間有關(guān)，在較低質(zhì)量濃度時，表現(xiàn)出誘導(dǎo)效應(yīng)，高質(zhì)量濃度下，誘導(dǎo)效應(yīng)加強(qiáng)，隨時間的增加達(dá)峰值后，抑制效應(yīng)顯著。

酸性磷酸酶廣泛存在于貝類血細(xì)胞的溶酶體中，當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化或有異物進(jìn)入體內(nèi)時，可以催化有機(jī)磷酸水解釋放磷酸根離子，以清除和殺傷進(jìn)入體內(nèi)的異物以及病原[20]。本研究中，酸性磷酸酶活性的變化趨勢與抗氧化酶超氧化物歧化酶、過氧化氫酶基本一致，Zn2+96 h半致死質(zhì)量濃度脅迫下酸性磷酸酶活性呈現(xiàn)“誘導(dǎo)—抑制”的趨勢，誘導(dǎo)效應(yīng)可能與抗氧化酶機(jī)制一致，但抑制效應(yīng)可能由以下兩條途徑所導(dǎo)致：一是毒物造成的血細(xì)胞溶解，導(dǎo)致溶酶體活性降低；二是毒物改變了血細(xì)胞內(nèi)溶酶體的膜通透性，導(dǎo)致酸性磷酸酶滲漏[23]。

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EffectsofZn2+onClamCyclinasinensis

LIANG Jian, LI Yongren, GUO Yongjun, XING Kezhi

( Tianjin Key Laboratory of Aqua-ecology and Aquaculture, Department of Fishery Sciences, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China )

LC50and safe concentrations were determined in clamCyclinasinensiswith shell length of (35.32±0.89) mm exposed to six gradient concentrations of Zn2+(10.00,19.95, 39.81,79.43,158.49, and 316.23 mg/L) and accumulation of Zn2+in gill and visceral mass and activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and acid phosphatase (ACP) in hemolymph of the clam were investigated under LC50and safe concentrations of Zn2+at water temperature of 26—28 ℃ and a salinity of 25.It was found that the LC50of Zn2+was 191.56 mg/L, and safe concentration 1.92 mg/L for 96 h. There was more rapid accumulation of Zn2+in gill than that in the visceral mass during the experiment. The activities of SOD, CAT and ACP in hemolymph showed a trend of first induction and then inhibition under the LC50concentration, higher than that in the control group, even though without significant change under safe concentration during the experiment. The findings provide certain significance in healthy breeding and the study of toxicology of clamCyclinasinensis.

Cyclinasinensis; Zn2+; acute toxicity; accumulation process; biochemical indicator

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.02.008

2015-11-08；

2016-05-16.

國家貝類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項(xiàng)目(CARS-48)；天津市高等學(xué)校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金資助項(xiàng)目(TD12-5018)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(15JCYBJC30400)；天津市科技特派員項(xiàng)目(14JCTPJC00521).

梁健(1988—)，男，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士；研究方向：貝類遺傳育種. E-mail: liangjian1230123@126.com. 通訊作者：邢克智(1956—)，男，教授；研究方向：水產(chǎn)動物增養(yǎng)殖.E-mail:kzxing8886@126.com.

S968.31

A

1003-1111(2017)02-0167-05