新型動(dòng)物精子上游分離器的研究

李井春，李 琦，黃大鵬，李雁冰，魏國生

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

新型動(dòng)物精子上游分離器的研究

李井春，李 琦，黃大鵬，李雁冰，魏國生*

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319）

本研究旨在為動(dòng)物體外受精提供具有活力的精子，運(yùn)用新型精子上游分離器篩選出高活性的精子。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3、4.5、6 mm 3種不同上浮高度的精子分離器對(duì)豬精子進(jìn)行篩選，并檢測(cè)3種不同高度精子分離器對(duì)分離豬精子質(zhì)量的影響，篩選出最理想的篩選高度的精子分離器。結(jié)果表明：上浮高度為4.5 mm精子分離器的精子活率（85.11%）顯著優(yōu)于篩選高度為3 mm的分離器（74.60%）和普通上游法（62.83%）（P<0.05），但與篩選高度為6 mm的分離器差異不顯著（P>0.05）；4.5 mm 精子分離器的畸形率（7.49%）顯著低于對(duì)照組和3 mm的分離器（P<0.05）； 4.5 mm精子分離器的精子直線速度和路徑速度最高（P<0.05），但分離精子的密度較普通上游法要低；各組之間豬精子其他質(zhì)量參數(shù)差異不顯著（P>0.05）。綜合可知，上游高度為4.5 mm的精子分離器優(yōu)于其他高度的分離器及普通上游法，應(yīng)用上游高度為4.5 mm的精子分離器能夠分離出具有活力的豬精子。

精子上游分離器；上游高度；豬精液；精子質(zhì)量

近年，隨著體外受精技術(shù)的不斷發(fā)展，活力精子的分離和篩選成為體外受精過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一?，F(xiàn)在通常采用的方法有密度梯度離心法、上游法等[1-2]。Percoll密度梯度離心法經(jīng)過離心處理對(duì)精子造成損傷，操作時(shí)間長并且有活力精子回收率低等缺點(diǎn)，而上游法存在回收率低、回收精子長時(shí)間上浮培養(yǎng)導(dǎo)致精子質(zhì)量差的缺點(diǎn)[3-4]。如何簡化活力精子的篩選，提高活力精子的分離效率和質(zhì)量成為研究的熱點(diǎn)。普通的上浮法分離精子容易使活力精子和死精子或弱精混合，導(dǎo)致精子活力低，質(zhì)量差[5-6]。

針對(duì)這一問題，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)一款新型精子上游分離器，將精子置于2個(gè)腔室中一個(gè)小室的底部，有活力的精子想要游出這個(gè)小室必須得跨越一道“圍墻”——與另一個(gè)小室相通的屏障，而死或弱的精子因不能跨越而留在原小室，以此將有活力的精子和其他精子進(jìn)行有效分離。本實(shí)驗(yàn)利用豬精子對(duì)3種不同上游高度的精子分離器進(jìn)行測(cè)試，檢測(cè)不同上浮高度的精子分離器對(duì)分離精子質(zhì)量的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 精子上游分離器實(shí)物圖及示意圖見圖1（自主設(shè)計(jì)及制作）。豬精液采自黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)養(yǎng)豬場的4頭健康長白系種公豬（精子的活力大于80%，畸形率低于20%）。試劑沒有特殊說明均購自西格瑪公司（上海）， 精液稀釋液為Modena稀釋液[7]（實(shí)驗(yàn)室按照配方自己配制）。

圖1 精子上游分離器示意圖

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 精液的處理 將10 mL新鮮豬精液置于15 mL離心管中，700×g離心3 min，棄上清，將精子用含0.4%（w/v）BSA的Modena稀釋液懸浮，調(diào)整精子密度為1×108個(gè)/mL，將懸浮后的精液放入培養(yǎng)箱中，備用。

1.2.2 精子上游分離器的操作方法 在高度為3、4.5、6 mm的上游分離器每個(gè)孔中加入1.2 mL培養(yǎng)液，每次添加都要超過中間小室的壁高，同時(shí)要排除空氣。然后在分離器中間小室底部緩慢加入0.2 mL備用精液（注意切勿將精液混淆到上層的培養(yǎng)液），置于37℃恒溫箱中上游20 min。上游完成后，將內(nèi)倉以外的精子上游液全部取出，轉(zhuǎn)移到2 mL離心管中，然后，取10 μL回收液進(jìn)行精子質(zhì)量檢測(cè)（邁朗全自動(dòng)精子質(zhì)量分析儀）。

1.2.3 普通上游法操作方法 吸取1.2 mL培養(yǎng)液加到普通上游器圓底試管內(nèi)，然后用移液器將0.2 mL預(yù)分離的精液從液滴底部緩慢加入，置37℃恒溫培養(yǎng)20 min，然后取液面以下1/3上游液到2 mL離心管中，取上懸液10 μL利用邁朗豬精子分析儀進(jìn)行精子質(zhì)量檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Stat View 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用方差分析中的多重比較分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著。數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2 結(jié) 果

2.1 3、4.5、6 mm上游高度的分離器對(duì)精子活率、密度、畸形率、線性度的影響 由表 1可以看出，上游高度為4.5 mm的分離器的精子活率（85.11% ）顯著高于普通上游法和3 mm的分離器（P<0.05），但與6 mm分離器的精子活率差異不顯著（P>0.05）。在精子密度上，普通上游法分離出的精子密度顯著高于上浮高度為4.5、6 mm的分離器（P<0.05），但與3 mm的分離器的差異不顯著（P>0.05）。在精子畸形率上，4.5、6 mm分離器組要顯著低于普通上游法和3 mm分離器組（P<0.05），但4.5、6 mm分離器組之間差異不顯著（P>0.05）。此外，在線性度上，各組之間差異均不顯著（P>0.05）。

2.2 不同高度分離器對(duì)精子各種速度及前向性的影響 由表2可見，在精子的直線速度（VSL）和路徑速度（VAP）上，4.5 mm的分離器組顯著高于其他各組（P<0.05），而普通上游法的最低。各組之間精子的曲線速度（VCL）及前向性（STR）參數(shù)不存在顯著差異（P>0.05）。

2.3 不同高度分離器對(duì)精子側(cè)擺幅值、鞭打頻率及移動(dòng)角度的影響 由表3可知，上游高度為4.5 mm的分離器的側(cè)擺幅值（ALH）、鞭打頻率（BCF）及移動(dòng)角度（MAD）與高上游高度為3、6 mm以及普通上游法差異都不顯著（P>0.05），但上游高度為4.5 mm分離器的精子的ALH、BCF及MAD的數(shù)值在各組中最高。

3 討 論

上游法分離活力精子是比較常用的精子篩選法之一。Mahadevan等[8]描述，上游法的基本工作原理是基于精子在精漿中自主移動(dòng)并進(jìn)入上層介質(zhì)中實(shí)現(xiàn)分離的，可顯著提高精子活力。本實(shí)驗(yàn)中，上游高度的設(shè)計(jì)是根據(jù)Li等[9]在用孕酮誘導(dǎo)精子和Zhao等[10]在上游法篩選精子這兩種方法得出的。上游高度為4.5 mm的精子上游分離器分離出的精子活率達(dá)到85.11%，顯著高于普通上游法（62.83% ）。其原因在于只有活力的精子才能越過設(shè)置的高度的“圍墻”，然而死的或弱的精子不能上浮到這個(gè)高度，從而分離出有活力的精子，進(jìn)而提高了分離活力精子的效率。

表1 3、4.5、6 mm高度分離器對(duì)精子活率、密度、畸形率、線性度的影響

表2 不同高度分離器對(duì)精子各種速度及前向性的影響

表3 不同高度分離器對(duì)精子側(cè)擺幅值、鞭打頻率及移動(dòng)角度的影響

上游法對(duì)精液密度的影響目前認(rèn)識(shí)不一，蔣敏等[5]報(bào)道處理后精子密度顯著增大，劉新雄等[11]則認(rèn)為處理前后精子密度無顯著差別。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，高度為4.5 mm的精子分離器分離出的精子密度為1.30×104個(gè)/mL，而普通上游法分離出的精子密度為8.68×104個(gè)/mL。其主要原因可能普通上游法吸取回收精液時(shí)，將死精或弱精一起回收，從而導(dǎo)致精子密度較大，但活率較低。本實(shí)驗(yàn)中4.5 mm的分離器回收精液時(shí)，是在獨(dú)立的小室回收，不至于導(dǎo)致死精或弱精與活力精子混合，使得回收的精子相對(duì)密度較低，但活率較原精液要高。此外，隨著上浮高度的增加，精子的密度出現(xiàn)減小的趨勢(shì)，主要是由于能夠跨越“圍墻”的精子數(shù)量應(yīng)該呈現(xiàn)遞減的趨勢(shì)。

精子畸形率與受精率密切相關(guān)，是常規(guī)精液分析中重要的形態(tài)學(xué)指標(biāo)。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用嚴(yán)格精子形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)精子形態(tài)對(duì)預(yù)測(cè)體外受精率很有意義，在精子優(yōu)選方面，通過精子分離處理提高正常形態(tài)精子數(shù)目，可以大大提高受精率[12]。本實(shí)驗(yàn)中，這種精子上游分離器分離后的精子的畸形率呈下降的趨勢(shì)，可提高精子質(zhì)量。

一種良好的精液分離技術(shù)首先要能保證獲得足夠數(shù)量的活動(dòng)精子。從精子運(yùn)動(dòng)速度和方式判斷，尤其是前向運(yùn)動(dòng)精子的平均速度，是預(yù)測(cè)動(dòng)物體外受精成功率的重要指標(biāo)。王利紅等[13]認(rèn)為，改良上游法可顯著增加前向運(yùn)動(dòng)精子的比例。本實(shí)驗(yàn)中，上浮高度為4.5 mm的分離器STR為1.1，而對(duì)照組STR為0.93，結(jié)果達(dá)到了精子進(jìn)一步優(yōu)化的效果，證明此上游分離器比普通上游器篩選更有效。精子的VAP與VSL也是評(píng)判精子質(zhì)量的重要指標(biāo)。Donnelly等[14]應(yīng)用計(jì)算機(jī)輔助精液自動(dòng)分析研究結(jié)果表明，精子動(dòng)態(tài)性參數(shù)與精子活率顯著相關(guān)。從本研究結(jié)果可以看出，高度為4.5 mm的精子分離器活率最高，畸形率最低，分離前后精子的VSL和VAP有明顯改善和提高，且明顯高于對(duì)照組，說明這種新型的精子上游分離器可分離出運(yùn)動(dòng)能力強(qiáng)的活力精子。

在本實(shí)驗(yàn)中，各組精子的ALH、BCF、MAD、LIN均沒有顯著差異，但是上游高度為4.5 mm分離器的精子的ALH、BCF、MAD的數(shù)值在各組中最高。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上游高度為4.5 mm的精子分離器優(yōu)于其他高度的分離器及普通上游法，應(yīng)用上游高度4.5 mm 分離器能夠分離出具有活力較高的豬精子。

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Study on a New Sperm Separator by Sperm Flowing Upstream in Animals

LI Jing-Chun, LI Qi, HUANG Da-peng, LI Yan-bing , WEI Guo-sheng*

(College of Animal Science&Veterinary Medicine, Heilongjiang Bayi Agricultural University, Heilongjiang Daqing 163319, China)

In order to isolate high motility sperm for in vitro fertilization, to screen out the highly effective selection method of viable sperm. In this study, we used three different sperm separators (3, 4.5, 6 mm) to isolate high motility sperm, and test that the effect of three different sperm separators on quality of separated boar sperm. The results showed that 4.5 mm sperm separator in sperm motility (85.11%) was signi fi cantly better than the 3 mm sperm separator (74.60%) and (62.83%) swimup method (P<0.05), but no difference between 6 mm and 4.5 mm sperm separator (P>0.05); However, malformation rate of 4.5 mm sperm separator (7.49%) was signi fi cantly lower than that of the other groups (P<0.05). In addition, 4.5 mm sperm separator in sperm VSL and VAP in all groups was the highest (P<0.05), but the separation of sperm density is lower than swim-up group; In the other quality parameters, there were no signi fi cant difference among the groups (P>0.05). Above the results showed that the sperm separator with a height of 4.5 mm was superior to the other sperm separator and the common swim-up method, and it could separate viable sperm for IVF.

Sperm separator; Upstream height; Boar semen; Sperm quality parameter

S828.3

A

10.19556/j.0258-7033.2017-12-049

2017-03-06；

2017-05-17

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31402136）；黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2017053）；黑龍江省農(nóng)墾總局科研計(jì)劃項(xiàng)目（HNK135-04-06）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)博士啟動(dòng)基金（B2012-06、XYB-2016-04）；大慶市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目（zd-2016-087）；黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)青年創(chuàng)新人才項(xiàng)目（CXRC2017004）

李井春（1979-），男，吉林長春人，講師，博士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖技術(shù)，E-mail: ljchun112@163.com

*通訊作者：魏國生（1963-），男，黑龍江青岡人，教授，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖技術(shù)，E-mail: weigs63@163.com