山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及核型*

徐川梅 黃堅欽 王正加 夏國華 張啟香 黃有軍 張守攻(. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京0009; . 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州3300)

山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及核型*

徐川梅1,2黃堅欽2王正加2夏國華2張啟香2黃有軍2張守攻1
(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京100091; 2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 杭州311300)

【目的】 研究山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程中染色體行為變化及其染色體核型特征，進(jìn)而確定山核桃染色體數(shù)目及倍性水平，探索山核桃無融合生殖現(xiàn)象與其倍性水平的關(guān)系，豐富山核桃生殖生物學(xué)等相關(guān)研究內(nèi)容，同時也為山核桃雜交育種及系統(tǒng)分類等研究提供一些細(xì)胞學(xué)資料?！痉椒ā?1)以山核桃雄花序?yàn)檠芯坎牧?，采用DAPI熒光染色技術(shù)對山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程進(jìn)行研究。2)以山核桃根尖為材料，采用核型分析技術(shù)分析山核桃染色體核型?！窘Y(jié)果】 1)山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂分2次進(jìn)行。第1次為減數(shù)分裂，所形成的子細(xì)胞染色體數(shù)目減半，分為前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ和末期Ⅰ4個階段，其中前期Ⅰ最為復(fù)雜，分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期和終變期5個時期，所經(jīng)歷時間最長，占整個分裂周期的70%； 第2次為有絲分裂，形成的子細(xì)胞染色體數(shù)目不再減半，同樣分為前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ4個階段，歷時較短。2)在減數(shù)分裂同步性方面，同一小花的不同花藥間及同一花序軸的不同小花間表現(xiàn)較為一致。3)山核桃大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中染色體行為正常，配成16個二價體，有一定比例的異?；ǚ勰讣?xì)胞出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為中期Ⅰ出現(xiàn)落后染色體，異常率為8.86%，中期Ⅱ表現(xiàn)為不對稱分裂，異常率為15.79%。4)山核桃核型公式為2n=32=20m+12sm，染色體相對長度變化范圍為4.006(±0.449)～9.559(±1.175)，臂比大于2的染色體比例為25.000%，最長染色體與最短染色體之比為2.417±0.456，核型不對稱系數(shù)為62.875，核型分類屬于2B?！窘Y(jié)論】 1)山核桃雖然存在無融合生殖現(xiàn)象，但是其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂仍遵循大多數(shù)被子植物減數(shù)分裂規(guī)律，在整個減數(shù)分裂進(jìn)程中，前期Ⅰ所需時間最長。2)山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂同步性程度較高，不利于山核桃散粉期的延長。3)山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂異常情況主要出現(xiàn)在中期Ⅰ及中期Ⅱ 2個階段。4)山核桃核型屬于比較對稱的類型，其染色體數(shù)目為2n=32，減數(shù)分裂配對成16個二價體，在倍性水平上屬于二倍體。

山核桃； 減數(shù)分裂； 花粉母細(xì)胞； 染色體； 核型； 無融合生殖

山核桃(Caryacathayensis)屬于胡桃科(Juglandaceae)山核桃屬(Carya)，是珍貴的經(jīng)濟(jì)林樹種和世界性著名干果，具有極高的經(jīng)濟(jì)價值，主要分布于浙江西部及安徽部分地區(qū)，目前已成為山核桃產(chǎn)區(qū)農(nóng)民經(jīng)濟(jì)收入的主要來源(Huangetal., 2015)?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂是植物進(jìn)行有性生殖必不可少的階段，通過減數(shù)分裂，實(shí)現(xiàn)遺傳重組及染色體數(shù)目減半，在保持物種穩(wěn)定性及創(chuàng)造遺傳變異等方面具有重要意義。染色體核型是一個物種的固有屬性，已成為一些物種系統(tǒng)進(jìn)化及分類研究的關(guān)鍵參數(shù)，在一些植物的系統(tǒng)分類及進(jìn)化研究中發(fā)揮了重要的作用(Klosetal., 2009; Chramiec-G?biketal., 2012; Sánchez-Jiménezetal., 2012)。

目前在山核桃細(xì)胞學(xué)研究方面，主要集中在花芽分化、花器官構(gòu)造、柱頭可授性、雌配子體發(fā)育及開花生物學(xué)特性等方面(黎章炬等， 1986； 黃有軍等， 2006； 2007； 張斌等， 2008)，一些研究證實(shí)，山核桃可能存在無融合生殖現(xiàn)象，但是無融合生殖類型及比例目前尚不清楚(張斌等， 2008； Zhangetal., 2012)。一些研究者認(rèn)為，植物的無融合生殖特性與其倍性水平有著特殊的關(guān)系，一般高倍體進(jìn)行無融合生殖，低倍體進(jìn)行有性生殖(劉傳虎等， 2007)。山核桃的無融合生殖特性與其倍性水平之間是否存在聯(lián)系，無融合生殖對山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂中的染色體行為是否會造成一定影響，目前僅有山核桃染色體數(shù)目的報道(Chenetal.,1993)，尚無關(guān)于其倍性水平的深入研究，在減數(shù)分裂進(jìn)程方面，甚至整個山核桃屬沒有1個種被報道。為了探索以上問題，本研究對山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程進(jìn)行了研究，同時利用根尖制片進(jìn)行了核型分析，以期進(jìn)一步明確山核桃的倍性水平，闡明山核桃減數(shù)分裂過程，豐富山核桃生殖生物學(xué)研究內(nèi)容，為山核桃雜交育種及系統(tǒng)分類等研究提供一些細(xì)胞學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 山核桃雄花序采集 山核桃雄花序采自于浙江農(nóng)林大學(xué)山核桃苗圃地， 2015年4月初—5月初，每天8:00—11:00點(diǎn)采集1次山核桃雄花序，采集的雄花序用FAA固定液進(jìn)行固定，放入冰箱中備用。

1.1.2 山核桃根尖材料準(zhǔn)備 9月中旬，從山核桃苗圃地采集山核桃新種子放入細(xì)沙中，23 ℃條件下進(jìn)行催芽，待種子萌發(fā)至3～5 cm時，剪取根尖部分，用0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉溶液室溫條件下處理4.5 h，之后轉(zhuǎn)入固定液中固定(甲醇∶乙酸體積比為3∶1)，用于后續(xù)制片。

1.2 方法

1.2.1 山核桃花粉母細(xì)胞制片及觀察 固定后的雄花序，經(jīng)70%、90%及100%的酒精進(jìn)行梯度脫水，然后用50%酒精和二甲苯的混合液及純二甲苯對材料進(jìn)行透明處理，透明后的材料再經(jīng)過50%酒精和二甲苯的混合液、100%酒精、90%酒精、70%酒精、50%酒精及蒸餾水進(jìn)行復(fù)水處理，每個梯度各處理30 min。復(fù)水后的材料再利用濃度為2 μg·mL-1的熒光染料DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole， 4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚)進(jìn)行染色，染色后的材料用50%的甘油進(jìn)行壓片，利用Zeiss公司的激光共聚焦顯微鏡(LSM510)進(jìn)行觀察和掃描，不同時期的細(xì)胞觀察數(shù)目均在20個以上。

1.2.2 山核桃根尖染色體制片及核型分析 1)山核桃根尖染色體制片 染色體標(biāo)本制備參照陳瑞陽等(2002)的方法略進(jìn)行改進(jìn)。固定后的幼嫩根尖，用雙蒸水沖洗數(shù)遍，去除固定液，之后用2.5%的纖維素酶和果膠酶的混合液37 ℃酶解3.5 h，酶解后的材料去除酶液，加入固定液，用鑷子夾碎，進(jìn)行滴片。相差顯微鏡下(Olympus BX 51)選取染色體分散較開、形態(tài)較好的中期染色體制片，利用Giemsa染色液進(jìn)行染色，染色后的制片在熒光顯微鏡(Olympus BX 60)100倍油鏡下拍照，染色體放大倍數(shù)為200倍。

2)山核桃核型分析 根據(jù)染色體形態(tài)大小等特征，采用Adobe Photo Shop 7.0圖像處理軟件對染色體進(jìn)行剪貼、排列和同源染色體配對分析，并利用Motic Images Advanced 3.2高級圖像處理軟件進(jìn)行染色體數(shù)據(jù)測量，共計分析5個染色體中期分裂相。核型分析參照陳瑞陽等(2002)和李懋學(xué)等(1985)的方法， 核型分類參照Stebbins(1971)的分類標(biāo)準(zhǔn)。染色體排列順序按照由長到短的順序進(jìn)行排列，并依次命名為1-16。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

前期Ⅰ： 從4月4號開始，山核桃雄花序進(jìn)入減數(shù)分裂階段。圖1a為進(jìn)入減數(shù)分裂階段的山核桃花粉母細(xì)胞，其細(xì)胞核已經(jīng)開始膨大，膨大后的細(xì)胞核，其中的染色質(zhì)開始凝集濃縮，染色質(zhì)纖維逐漸折疊螺旋化，進(jìn)入細(xì)線期(圖1b)，此時染色體和染色單體形態(tài)尚不清晰，細(xì)胞核清晰可見。隨著染色質(zhì)的進(jìn)一步濃縮，進(jìn)入偶線期(圖1c1,c2)，細(xì)長的染色體和染色單體開始出現(xiàn)，同源染色體開始進(jìn)行聯(lián)會，此時細(xì)胞核依然存在。染色體進(jìn)一步螺旋化，濃縮變短，進(jìn)入粗線期(圖1d)。粗線期結(jié)束后，染色體進(jìn)一步螺旋化，進(jìn)入雙線期(圖1e)，此階段部分同源染色體之間仍然存在交叉，同源染色體完成聯(lián)會。雙線期結(jié)束后，進(jìn)入終變期(圖1f1, f2)，此階段，染色體進(jìn)一步凝集，形成短棒狀結(jié)構(gòu)，交叉向染色體端部移動，發(fā)生端化，形成二價體和多價體，核仁逐漸消失。

中期Ⅰ： 約4月11號開始，山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)入減數(shù)分裂中期，該時期核膜、核仁已消失，所有的中期染色體配對成二價體聚集到赤道板上(圖1g1, g2, g3)，圖1g1, g2為極面觀察結(jié)果，圖1g3為垂直面觀察結(jié)果，可以看出有16個環(huán)狀二價體排列在赤道板上。中期Ⅰ共觀察了79個細(xì)胞，其中有 7個細(xì)胞出現(xiàn)了落后染色單體(圖1h)，異常率約為8.86%(表1)。

后期Ⅰ和末期Ⅰ： 在紡錘絲的牽引下，同源染色體開始分開并向兩極移動，圖1i1是中后期，同源染色體剛剛分開，隨著紡錘絲的繼續(xù)牽引，同源染色體逐漸被分開，直至完全分開，進(jìn)入到減數(shù)分裂后期(圖1i1,i2,i3)。2條同源染色體完全移到兩級后，進(jìn)入減數(shù)分裂末期Ⅰ(圖1j1,j2)，染色體開始解螺旋，回到染色質(zhì)狀態(tài)(圖1k1)，為第2次分裂做準(zhǔn)備。通過第1次減數(shù)分裂，形成2個子細(xì)胞，其染色體數(shù)目是體細(xì)胞染色體數(shù)目的一半。

前期Ⅱ： 移向兩極的細(xì)胞核體積開始增大，其中的細(xì)胞質(zhì)不斷濃縮和螺旋化，染色體形態(tài)開始出現(xiàn)，進(jìn)入第2次減數(shù)分裂的前期(圖1k2)。

中期Ⅱ： 染色體進(jìn)一步濃縮和螺旋化，進(jìn)入第2次減數(shù)分裂的中期，此時期染色體形態(tài)清晰可見，2組染色體均分布在各自的赤道板上，呈垂直分布(圖1L1)或平行分布(圖1L2,L3)。此時期觀察到一些減數(shù)分裂不平衡的細(xì)胞(圖1m)，共觀察了38個細(xì)胞，有6個細(xì)胞出現(xiàn)異常，異常率約為15.79%(表1)。

后期Ⅱ： 著絲點(diǎn)一分為二，姊妹染色體單體逐漸分開，并分別向兩極移動，形成4組染色體(圖1n1,n2)。

末期Ⅱ： 4組染色體移動到4極末端，進(jìn)入末期Ⅱ(圖1o)，染色體解螺旋，形成染色質(zhì)，細(xì)胞壁出現(xiàn)，形成四分體(圖1p)。約從4月14號開始，可以在山核桃花藥中觀察到大量四分體，山核桃所形成的四分體構(gòu)型以四面體型為主(圖1q)，少量為十字交叉型(圖1p)，共計觀察了110個細(xì)胞，其中四面體型所占比例為81.82%，十字交叉型所占比例為18.18%。山核桃雄花序?yàn)槿彳杌ㄐ颍?朵小花中有4～6枚花藥，在研究過程中，發(fā)現(xiàn)同一朵小花中的幾個花藥在減數(shù)分裂進(jìn)程上是一致的，同一個花序軸的不同小花間在減數(shù)分裂進(jìn)程上相差也不是很大。

2.2 山核桃核型分析

山核桃具體染色體數(shù)目、核型及核型模式如圖2A1-A3所示。其核型公式為2n=32=20m+12sm，主要由20條中部著絲粒染色體和12條近中部著絲粒染色體組成，具有1對隨體染色體，隨體位于第11對染色體的短臂上。表2為山核桃核型的具體參數(shù)，其染色體相對長度為4.006(±0.449)～9.559(±1.175)，臂比大于2的染色體比例為25.000%，最長染色體與最短染色體之比為2.417±0.456，平均臂比為1.765±0.144，核型不對稱系數(shù)為62.875； 根據(jù)Stebbins(1971)的核型分類標(biāo)準(zhǔn)，山核桃在核型分類上屬于2B類型。

圖1 山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程Fig.1 Pollen mother cells meiosis of Carya cathayensis標(biāo)尺 Bar: 5 μm.a.花粉母細(xì)胞； b.細(xì)線期； c1.偶線期； c2.偶線期三維圖； d.粗線期； e.雙線期； f1.終變期早期； f2.終變期后期； g1-g3.赤道板不同角度觀察的中期Ⅰ； h.中期Ⅰ，存在1個落后單體； i1-i3.后期Ⅰ，處在不同分裂階段； j1, j2.末期Ⅰ，處在不同分裂階段； k1, k2.前期Ⅱ, 處在不同分裂階段； L1-L3.中期Ⅱ，不同極面觀察結(jié)果； m.中期Ⅱ，2個子細(xì)胞分裂不對稱； n1, n2.后期Ⅱ，處在不同分裂階段； o.末期Ⅱ； p.十字交叉型四分體； q.四面體型四分體。a. Pollen mother cells; b. Leptotene; c1. Zygotene; c2. Three-dimensional picture of zygotene; d. Pachytene; e. Diplotene; f1. Early stage of diakinesis; f2. Late stage of diakinesis; g1-g3. MetaphaseⅠ, observations from different angles of the equatorial plate; h. MetaphaseⅠ, one lagged univalent; i1-i3. AnaphaseⅠ, at different division stages; j1,j2. TelophaseⅠ, at different division stages; k1,k2. ProphaseⅡ, at different division stages; L1-L3. MetaphaseⅡ, different polar view of the equatorial plate; m. MetaphaseⅡ, asymmetric division of two cells; n1,n2. AnaphaseⅡ, at different division stages; o. TelophaseⅡ; p. Cross type tetrad; q. Tetrahedral tetrad.

表1 減數(shù)分裂不同時期的花粉母細(xì)胞數(shù)量及頻率Tab.1 Number and frequency of pollen mother cells in each stage of meiosis

圖2 山核桃的中期染色體(A1)、染色體配對(A2)及核型模式(A3)Fig. 2 The metaphase chromosomes(A1), karyotypes(A2) and ideograms(A3) of Carya cathayensis

表2 山核桃核型參數(shù)Tab.2 Chromosome parameters of Carya cathayensis

3 討論

本研究首次對山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程進(jìn)行研究，結(jié)果表明，山核桃花粉母細(xì)胞經(jīng)過2次分裂，形成4個子細(xì)胞，其中第1次分裂是真正意義上的減數(shù)分裂，分為前期Ⅰ、中期Ⅰ、后期Ⅰ和末期Ⅰ4個時期。前期Ⅰ最為復(fù)雜，歷時最長，約為7天，占到整個分裂周期的近70%(從減數(shù)分裂開始到四分體形成)； 根據(jù)染色體的不同表現(xiàn)形式又可進(jìn)一步分為細(xì)線期、偶線期、粗線期、雙線期、終變期5個時期，終變期結(jié)束后染色體間遺傳物質(zhì)的交換工作已完成，同源染色體開始配對。中期Ⅰ，配對的同源染色體在紡錘絲的牽引下開始逐漸分開，進(jìn)入后期Ⅰ和末期Ⅰ，形成2個子細(xì)胞，此時形成的子細(xì)胞染色體數(shù)目為體細(xì)胞染色體數(shù)目的一半。所形成的子細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行第2次分裂，此次分裂，染色體數(shù)目不再變化，同樣經(jīng)歷前期Ⅱ、中期Ⅱ、后期Ⅱ和末期Ⅱ4個時期，最后形成四分體，減數(shù)分裂過程結(jié)束。中期Ⅰ開始至四分體形成，約需3天，占整個分裂周期的近30%。山核桃這一分裂規(guī)律與多數(shù)植物分裂周期規(guī)律吻合，各時期染色體行為也與多數(shù)物種類似(康向陽等， 2000； 王君等， 2006； 祁傳磊等， 2009)。由此可見，雖然山核桃植物中存在無融合生殖現(xiàn)象，但是其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程并未受到影響。

另外，在減數(shù)分裂過程中，山核桃也有部分細(xì)胞表現(xiàn)出一定的異常，主要表現(xiàn)為中期Ⅰ出現(xiàn)落后染色體，中期Ⅱ出現(xiàn)不對稱分裂等。一些研究者認(rèn)為，在減數(shù)分裂過程中，著絲粒對染色體的行為起著重要的控制作用，來自于父母本的2條同源染色體配對成二價體，同源染色體的2條姊妹染色單體間由連接復(fù)合物(由減數(shù)分裂特異蛋白Rec8亞單位組成)緊密連接； 第1次分裂是2條同源染色體的分裂，此時具有同一著絲粒的2條姊妹染色單體間在行為上必需高度協(xié)調(diào)； 第2次分裂是2條姊妹染色單體的分離，2條姊妹染色單體間的協(xié)調(diào)性需要逐漸被打破，其中的連接復(fù)合物逐漸消失，以保證姊妹染色單體的著絲粒在赤道板上具有正確的方向和位置，以便與兩極的紡錘體互作，進(jìn)而保證2條姊妹染色單體從著絲粒部位準(zhǔn)確分開(Lukaszewski, 2010； Cliftetal., 2011)?，F(xiàn)存的一些植物中，特別是一些雜交種，由于染色體組組成類型復(fù)雜，一些同源染色體不能很好配對，姊妹染色單體間協(xié)調(diào)性也很差，因此在減數(shù)分裂過程中往往會出現(xiàn)各種異常，如四倍體提莫非維小麥(Triticumtimopheevi)與野燕麥(Avenafatua)的雜交后代(Anetal., 2015)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)的種間雜交種等(Fukuharaetal., 2016)。除此之外，還有一些物種雖然不是雜交種，但是由于受到外界環(huán)境或者自身遺傳因素等方面的影響，在減數(shù)分裂過程中也有一部分細(xì)胞表現(xiàn)出一定的異常，如杉木(Cunninghamialanceolata)、紅皮云杉(Piceakoraiensis)、柑橘(Citrussinensis)、白菜(Brassicacampestrisssp.chinensis)、關(guān)蒼術(shù)(Atractylodesjaponica)等(徐進(jìn)等， 2007； 張守攻等， 2009； 崔群香等， 2010； 高娟等， 2010； 樸錦等， 2015)。本研究中，山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂也出現(xiàn)一定比例的異常，推測可能與以上物種有一定的相似之處，由于受到外界環(huán)境或自身遺傳因素的影響，部分細(xì)胞中的染色體結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，因而導(dǎo)致部分同源染色體的姊妹染色單體間在協(xié)調(diào)性方面出現(xiàn)問題，或者是部分染色體的著絲粒受到影響，不能與兩極的紡錘體正?；プ?，因此一些細(xì)胞在減數(shù)分裂過程中出現(xiàn)異常，猶如小麥(Triticumaestivum)(Lukaszewski, 2010)及小麥背景下的一些黑麥(Secalecereale)染色體的表現(xiàn)(Xieetal., 2013)。

在減數(shù)分裂同步性方面，一些物種表現(xiàn)出了明顯的不同步現(xiàn)象，同一花芽的不同部位，同一部位的不同小花，甚至是同一小花的不同花藥在減數(shù)分裂進(jìn)程上均表現(xiàn)出不一致，如歐洲黑楊(Populusnigra)、龍眼(Dimocarpuslongan)、關(guān)蒼術(shù)等。一些研究者認(rèn)為，這種不同步性可以在一定程度上延長花期，避免外部惡劣環(huán)境對散粉的影響而增加授粉幾率，對種群繁殖有利，是一種適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化機(jī)制(許雯婷等， 2011； 劉麗琴等， 2011； 樸錦等， 2015)。本研究表明，山核桃同一小花中的不同花藥在減數(shù)分裂進(jìn)程上是一致的，同時，同一花序軸上的不同小花間在同步性方面相差也不明顯。作者曾對山核桃散粉期進(jìn)行觀察，其散粉期較短，可持續(xù)5～7天，幾乎是集中散粉，這與其細(xì)胞學(xué)發(fā)育特性基本上是吻合的，從進(jìn)化角度分析，這種散粉機(jī)制對山核桃種群繁育是極為不利的。

關(guān)于山核桃屬染色體基數(shù)及倍性問題，山核桃屬約有18個種，部分種的細(xì)胞學(xué)結(jié)果表明，一部分種染色體數(shù)目為2n=32，還有一部分種染色體數(shù)目為2n=64，因目前在山核桃屬植物中尚未發(fā)現(xiàn)染色體數(shù)目更低的種，因此一些研究者認(rèn)為山核桃屬植物染色體基數(shù)可能為X=16，染色體數(shù)目為32的種為二倍體(Chenetal.,1993; 呂芳德等, 2002； Stone, 1997)。本研究中，山核桃核型分析結(jié)果表明，其核型公式為2n=32=20m+12sm，在染色體組成類型上，主要以中部著絲粒染色體和近中部著絲粒染色體2種類型為主，屬于比較對稱的核型； 在減數(shù)分裂中期Ⅰ觀察到16個二價體，同源染色體配對良好。綜合核型分析和減數(shù)分裂試驗(yàn)結(jié)果，可以進(jìn)一步確定山核桃為二倍體。一些研究者認(rèn)為，無融合生殖植物中大多存在不同的倍性類型，一般高倍性的物種進(jìn)行無融合生殖，低倍性的物種進(jìn)行有性生殖(劉傳虎等， 2007)。在本研究中，由于目前還不能確定哪一株山核桃樹或種子具有無融合生殖的特性，因此在試驗(yàn)材料選擇上做不到精準(zhǔn)選擇，依據(jù)目前的研究結(jié)果，還無法揭示山核桃無融合生殖現(xiàn)象與其倍性水平的具體關(guān)系，以及山核桃是否存在倍性不同的群體或單株等，這些問題還有待于進(jìn)一步擴(kuò)大群體，通過深入的細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)研究去揭示。

4 結(jié)論

山核桃雖然存在無融合生殖現(xiàn)象，但是其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過程并未受到影響，仍然遵循大多數(shù)被子植物減數(shù)分裂規(guī)律，在整個減數(shù)分裂進(jìn)程中，前期Ⅰ所需時間最長，約占整個分裂周期的70%，其他幾個時期所經(jīng)歷時間較短，約占整個分裂周期的30%。山核桃花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂同步性程度較高，這不利于延長山核桃散粉期，從進(jìn)化角度上分析，不利于山核桃種群繁衍。山核桃體細(xì)胞染色體數(shù)為2n=32，在染色體組成類型上主要為中著絲粒染色體和近中著絲粒染色體2種，屬于比較對稱的核型，在減數(shù)分裂中期Ⅰ，32條染色體配對成16個二價體，可以進(jìn)一步確定在倍性水平上山核桃屬于二倍體。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

MeiosisofPollenMotherCellandKaryotypeofCaryacathayensis

Xu Chuanmei1, 2Huang Jianqin2Wang Zhengjia2Xia Guohua2Zhang Qixiang2Huang Youjun2Zhang Shougong1
(1.StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestryBeijing100091;2.StateKeyLaboratoryofSubtropicalSilvicultureZhejiangAamp;FUniversityHangzhou311300)

【Objective】 This study was aimed to observe the meiosis of pollen mother cell and the karyotype ofCaryacathayensis, to determine the chromosome number and ploidy level ofC.cathayensisaccording to these results, to explore the relationship between the apomixis and the ploidy level ofC.cathayensis, and to enrich reproductive biology data ofCaryaspecies, meanwhile, to provide some cytological data for cross breeding and systematic classification ofC.cathayensis.【Method】 1)Male inflorescence ofC.cathayensiswas selected as material, DAPI fluorescent staining was used to study the meiosis of pollen mother cell ofC.cathayensis. 2)C.cathayensisroot tip was selected to prepare chromosome and make karyotype analysis.【Result】 1)The meiosis of pollen mother cells ofC.cathayensiswas divided into two stages, the chromosome number of daughter cells was reduced by half during the first division and not changed again during the second division. The first and second division were divided into prophase, metaphase, anaphase and telophase respectively, however, the prophaseⅠwas most complex among these stages and was further divided into leptotene, zygotene, pachytene, diplotene and diakinesis. The prophaseⅠwas the longest one among these stages, accounting for nearly 70% of the whole division cycle. The second division was relatively a shorter period. 2) In terms of meiosis synchronization, different anthers from the same floret are the same, there was no significant difference among different flowers from the same inflorescence axis. 3)The chromosome behavior of most pollen mother cells inC.cathayensiswas normal and paired as 16 bivalents at metaphaseⅠ. However, there was a certain proportion of abnormal pollen mother cells in the meiosis, such as appearing lagging chromosome in metaphase Ⅰ, which accounted for 8.86%, showing asymmetry division in metaphase Ⅱ, which accounted for 15.79%. 4) The karyotype formula ofC.cathayensiswas 2n=32=20m+12sm，and the range of its chromosome relative length was from 4.006(±0.449) to 9.559(±1.175), chromosome numbers whose arm ratio was more than 2 accounted for 25.000%, the ratio of chromosome length (L/S) and the karyotype asymmetry index were 2.417±0.456 and 62.875, respectively. The karyotype type was 2B.【Conclusion】 1) Although there is the phenomenon of apomixis inC.cathayensis, it still follows the law of meiosis of pollen mother cells in most angiosperms. In the whole process of meiosis, the prophase Ⅰ is the longest, other stages are short. 2)C.cathyensispollen mother cell meiosis synchronization degree is very high, which is unfavorable to prolong its pollination period. 3) The abnormal mother cell ofC.cathyensismainly appears in the two stages of metaphase Ⅰ and metaphase Ⅱ. 4) The karyotype ofC.cathyensisbelongs to a symmetrical type with the chromosome number of 2n=32 and paired as 16 bivalents at meiosis metaphaseⅠ, thus it is a diploid species.

Caryacathayensis； meiosis； pollen mother cell； chromosome； karyotype； apomixis

10.11707/j.1001-7488.20171109

2017-02-09；

2017-03-20。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)“特色林木功能基因組研究與應(yīng)用”(2013AA102605)； 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470682)； 分析測試科技計劃項(xiàng)目(2016C37081)。

*張守攻為通訊作者。

S718.46

A

1001-7488(2017)11-0077-08