posadasii球孢子菌國(guó)內(nèi)首例報(bào)告

梁官釗 符美華 呂桂霞 沈永年 梅嬛 劉維達(dá)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)真菌保藏中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所真菌科，南京 210042)

·病例報(bào)告·

posadasii球孢子菌國(guó)內(nèi)首例報(bào)告

梁官釗 符美華 呂桂霞 沈永年 梅嬛 劉維達(dá)

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)真菌保藏中心 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所真菌科，南京 210042)

自1例肺部感染患者成功分離到1株球孢子菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定為posadasii球孢子菌 (C.posadasii)，文獻(xiàn)查新至今國(guó)內(nèi)尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。

球孢子菌??；粗球孢子菌；posadasii球孢子菌

球孢子菌病 (Coccidioidomycosis)是一種真菌感染性疾病，主要是由于吸入粗球孢子菌 (C.immitis)或posadasii球孢子菌 (C.posadasii)的孢子而發(fā)病[1]。本病主要流行于美國(guó)西南部地區(qū)、墨西哥部分地區(qū)以及中美洲和南美洲，在中國(guó)較為少見(jiàn)。球孢子菌病因常發(fā)生于美國(guó)的圣華金山谷且伴有發(fā)熱，故又稱山谷熱 (Valley fever)；也可發(fā)生于沙漠地帶，又稱沙漠熱 (Desert fever)。近年，由于國(guó)際人口流動(dòng)、器官移植及HIV患病的增加，非流行區(qū) (如亞洲的中國(guó)、日本、印度等)球孢子菌病報(bào)道日漸增加[2]。我院于2016年12月自1例肺部感染患者分離到1株球孢子菌，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為posadasii球孢子菌 (C.posadasii)，系國(guó)內(nèi)首次分離并鑒定出該菌。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

患者男，29 歲，北京某大學(xué)學(xué)生。2013年9月赴美國(guó)亞利桑那州 (Arizona)留學(xué)，自2013年12月至就診 (2016年11月)，反復(fù)咳嗽、咳痰，偶有血痰。胸部CT檢查顯示右下肺空洞性病變，病變周圍有少許滲出性改變。

1.2 痰液檢查

痰液呈黏稠白色，間雜黃綠色膠凍塊，涂片染色檢查:見(jiàn)少許革蘭陽(yáng)性無(wú)莢膜的球菌,未檢出抗酸菌。痰液10%KOH直接鏡檢未見(jiàn)菌絲與孢子。

1.3 真菌DNA提取及PCR

DNA提取 取SDA上培養(yǎng)3 d的新鮮菌落適量于MP公司的研磨管中，采用FUNGI DNA KIT試劑盒 (OMEGA)提取菌株的基因組DNA。具體操作方法參見(jiàn)說(shuō)明書，對(duì)真菌大亞基 (26S) rRNA D1/D2的可變區(qū)序列進(jìn)行測(cè)定。

PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件 總反應(yīng)體系為50 μL。具體為：模板DNA 2 μL;引物NL1 (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3')和NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3')各1 μL;2×Hot Start PCR MasterMix (NEB) 25 μL;無(wú)菌雙蒸水21 μL。同時(shí)設(shè)置不加模板的陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為預(yù)變性95℃ 5 min；95℃ 30 s、55℃ 90 s、72℃ 1 min共35個(gè)循環(huán)；總延伸72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳80 V 30 min后紫外燈下觀察結(jié)果，顯示PCR產(chǎn)物大小約為600 bp。

1.4 球孢子菌球囊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)

待鑒定菌接種于球囊培養(yǎng)基分別于26℃和37℃ 10%CO2培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)，并進(jìn)行直接鏡檢。球囊培養(yǎng)基配方：葡萄糖4.0 g、醋酸銨1.53 g、NaCl 0.014 g、CaCl20.002 g、KH2PO40.5 g、Tamol 0.5 g、K2HPO40.52 g、NaHCO30.012 g、MgSO40.4 g、ZnSO40.002 g、瓊脂15 g，蒸餾水加至1 000 mL。參考《現(xiàn)代醫(yī)學(xué)真菌檢驗(yàn)手冊(cè)》有關(guān)章節(jié)。

1.5 真菌形態(tài)學(xué)鑒定

我們對(duì)該患者進(jìn)行4次痰培養(yǎng)，1次顯示為細(xì)菌生長(zhǎng)，3次均為真菌生長(zhǎng)。①真菌培養(yǎng)：痰液接種于含放線菌酮和不含放線菌酮SDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)，2～3 d表現(xiàn)為白色絨毛菌落，基底產(chǎn)色素不明顯；7～10 d時(shí)表現(xiàn)為藍(lán)灰色菌落，并可見(jiàn)淡粉色色素滲透入培養(yǎng)基；痰液于PDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)，4～5 d可見(jiàn)明顯紅色色素產(chǎn)生，鏡下見(jiàn)帚狀枝，單輪生，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并分子學(xué)鑒定，最后鑒定為鮮紅青霉 (Penicilliumchermesinum,見(jiàn)圖1～2)。②將痰液接種于大試管含放線菌酮和不含放線菌酮SDA培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)，3～4 d可見(jiàn)白色膜狀菌落形成，緊貼培養(yǎng)基表面，并于邊緣生出菌絲，7 d后發(fā)現(xiàn)菌落呈灰白色絨毛改變，14 d發(fā)展為灰白棉花樣菌落 (見(jiàn)圖3)，菌落甲醛熏蒸滅活并挑去適量進(jìn)行鏡檢，發(fā)現(xiàn)大量關(guān)節(jié)孢子 (見(jiàn)圖4)；菌株純化并接種于大試管PDA培養(yǎng)基，26℃培養(yǎng)約兩周，發(fā)現(xiàn)棉花樣菌落較35℃時(shí)更為明顯 (見(jiàn)圖5)；球囊轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)：菌株接種于球囊培養(yǎng)基，分別置于37℃普通培養(yǎng)箱 (見(jiàn)圖6)和37℃ 10%CO2培養(yǎng)箱 (見(jiàn)圖7)，培養(yǎng)2周，發(fā)現(xiàn)該菌在兩種環(huán)境均可生長(zhǎng)，但37℃ 10%CO2培養(yǎng)條件下趨向于酵母樣菌落,鏡下可見(jiàn)大量球囊 (見(jiàn)圖8)，球囊內(nèi)見(jiàn)大量?jī)?nèi)孢子 (見(jiàn)圖9)。

1.6 真菌分子生物學(xué)鑒定

菌株滅活并提取基因組DNA，對(duì)核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū) (Internally Transcribed Spacer，ITS)和大亞基 (26S) rRNA D1/D2的可變區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序，序列在NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中通過(guò)Blast進(jìn)行同源序列比對(duì)：①結(jié)果與登錄號(hào)為KJ767051.1的Penicilliumchermesinum同源性均為99%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及分子生物學(xué)，該菌鑒定為鮮紅青霉。②結(jié)果與登錄號(hào)為ATCC KC469983.1的Coccidioidesposadasii同源性均為100%。根據(jù)形態(tài)學(xué)特點(diǎn)及分子生物學(xué)，該菌鑒定為posadasii球孢子菌。

圖1SDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)10 d，灰色菌落，深紅色素滲入培養(yǎng)基圖2PDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)4～5 d，鏡下見(jiàn)帚狀枝，單輪生，僅有瓶梗，無(wú)?；?，孢子橢圓形 (×400)圖3灰白棉花樣菌落圖4鏡檢見(jiàn)分節(jié)菌絲及關(guān)節(jié)孢子 (×400)圖5PDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)兩周，棉花樣菌落較35℃更明顯圖6菌株接種于球囊轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)，見(jiàn)灰色毛刺狀菌落圖7菌株接種于球囊培養(yǎng)基35℃于10%CO2條件培養(yǎng)，見(jiàn)酵母樣菌落圖8酵母樣菌落進(jìn)行直接鏡檢，見(jiàn)大量球囊 (×200)圖9球囊內(nèi)可見(jiàn)大量?jī)?nèi)孢子 (×400)

Fig.1Cultured in SDA medium at 26℃ for 10 days,gray colony,deep red pigment in the medium was seenFig.2Cultured in PDA medium 26℃ for 4-5 days,typical broom-shaped,monoverticillate,conidia ellipsoidal to subspherical (×400) under microscopeFig.3Gray cotton-like coloniesFig.4Arthroconidia and septate mycelia (×400)Fig.5Cultured in PDA medium at 26℃ for two weeks,cotton-like colonies was formed more obviously than 35℃Fig.6Cultured in Spherules medium at 35℃,grey burr-shaped colonies was seenFig.7Cultured in Spherules medium at 35℃and 10% CO2condition,yeast-like colonies was observedFig.8Spherules were seen under microscope (×200)Fig.9Spherules with endospores (×400)

2 討 論

2.1 球孢子菌生物學(xué)基本特征

球孢子菌的生物學(xué)分類[3]：子囊菌門 (Ascomycota)，雙核菌綱 (Dikaryomycota)，子囊菌亞綱 (Ascomycotina)，爪甲團(tuán)囊菌目 (Onygenales)，爪甲團(tuán)囊菌科 (Onygenaceae)，球孢子菌屬 (Coccidioides)，粗球孢子菌 (immitis)和posadasii種。

球孢子菌為雙相真菌，其在自然界腐生階段以菌絲相、關(guān)節(jié)孢子形式存在；侵入人體 (或動(dòng)物體)后以球囊、內(nèi)孢子形式存在。球孢子菌在自然界適宜溫度和濕度條件下，以菌絲型生長(zhǎng)，并分枝分隔；當(dāng)環(huán)境干燥，濕度降低后，生長(zhǎng)條件惡劣，形成厚壁關(guān)節(jié)孢子 (2～8 μm)，關(guān)節(jié)孢子是球孢子菌的主要致病相，其傳染性很強(qiáng)，可通過(guò)風(fēng)或泥土傳播。關(guān)節(jié)孢子可被吸入至肺或外傷接種到皮膚，在機(jī)體進(jìn)入其寄生階段，形成厚壁球形直徑為10～100 μm (甚至可達(dá)200 μm)的小球體，即為孢子囊，孢子囊內(nèi)含幾十至數(shù)百個(gè)內(nèi)孢子 (2～5 μm)；孢子囊破裂，被釋放出來(lái)的內(nèi)孢子可進(jìn)一步形成孢子囊，并無(wú)限循環(huán)[4]。

球孢子菌病分為兩個(gè)種，粗球孢子菌 (C.immitis)或posadasii球孢子菌 (C.posadasii)，此兩個(gè)種存在一定差異，其對(duì)比如下[3,5]。①自然界生長(zhǎng)環(huán)境相似：對(duì)土壤溫度、濕度、土質(zhì)等要求基本一樣。②C.immitis地理分布較局限，而C.Posadasii廣泛。C.immitis主要存在于美國(guó)加利福尼亞州 (California)，而C.Posadasii主要分布美國(guó)亞利桑那州 (Arizona)、德克薩斯州 (Texas)、墨西哥州等州及中美洲、南美洲等其他國(guó)家。③在高濃度NaCl培養(yǎng)基 (0.034或0.136摩爾)：C.immitis較C.Posadasii生長(zhǎng)速度快。④關(guān)節(jié)孢子大小：C.immitis較大，C.Posadasii相對(duì)較小。⑤基因差異：二者均含幾丁質(zhì)合成酶、雙加氧酶、乳清酸核苷脫羧酶、絲氨酸蛋白酶、幾丁質(zhì)酶及其他13個(gè)基因，但同C.Posadasii對(duì)比，C.immitis缺少富含脯氨酸抗原-2 (Ag2/PRA)基因。⑥此外，二者一些等位基因分布也存在差異。

2.2 該菌鑒定過(guò)程及思考

球孢子菌為非人體常駐菌群，如果分離出該菌，結(jié)合臨床即可診斷球孢子菌病。實(shí)際上，本文該菌鑒定過(guò)程較為復(fù)雜。①患者就診提供外院痰培養(yǎng)結(jié)果，顯示“青霉生長(zhǎng)”，實(shí)際上青霉屬真菌除馬內(nèi)菲藍(lán)狀菌外較少引起感染致病，多引起呼吸系統(tǒng)過(guò)敏致病[6-7]。②無(wú)放線菌酮和有放線菌酮SDA培養(yǎng)基26℃培養(yǎng)：均顯示青霉生長(zhǎng)，最初產(chǎn)紅色色素不明顯，據(jù)鏡下結(jié)構(gòu)考慮“青霉”，此菌雖為環(huán)境菌，但亦有深部組織感染報(bào)道，如可形成脊旁膿腫及系統(tǒng)感染[8-9]；隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，發(fā)現(xiàn)紅色色素滲透入培養(yǎng)基，把該菌轉(zhuǎn)移至35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)緩慢，并無(wú)發(fā)生酵母相轉(zhuǎn)化，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為鮮紅青霉，判斷為環(huán)境污染真菌。③SDA培養(yǎng)基35℃培養(yǎng)：發(fā)現(xiàn)灰白色絨毛/棉花樣菌落生長(zhǎng)，此時(shí)培養(yǎng)基并無(wú)紅色色素滲入，其生長(zhǎng)良好。④這引起我們高度注意：35℃生長(zhǎng)的致病真菌為數(shù)眾多，常見(jiàn)有雙相真菌，如馬內(nèi)菲藍(lán)狀菌、組織胞漿菌、球孢子菌、副球孢子菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等；一些暗色真菌，如班替枝孢霉、皮炎外瓶霉、甄氏外瓶霉、棘狀外瓶霉；毛霉目真菌，如小孢根霉、少根根霉、微小根毛霉等；曲霉屬，如煙曲霉等；其他菌，如伊蒙菌、念珠菌等。但結(jié)合菌落形態(tài)及臨床致病特點(diǎn)，我們懷疑球孢子菌。⑤由普通實(shí)驗(yàn)操作平臺(tái)轉(zhuǎn)移至Ⅲ級(jí)生物安全操作臺(tái)，甲醛熏蒸滅活，鏡檢發(fā)現(xiàn)大量關(guān)節(jié)孢子，隨后我們使用球囊培養(yǎng)基進(jìn)行雙相轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合分子生物學(xué)信息，鑒定為posadasii球孢子菌。⑥此病例值得反思和警惕，痰液直接鏡檢并未發(fā)現(xiàn)球囊或孢子，因痰液直接鏡檢具有局限性，痰液中菌量較少或無(wú)典型結(jié)構(gòu)時(shí)很難發(fā)現(xiàn)，即使經(jīng)驗(yàn)豐富者亦可能存在遺漏。臨床真菌培養(yǎng)溫度多為26℃，但此時(shí)環(huán)境菌 (青霉屬等)會(huì)占有明顯優(yōu)勢(shì)，致病菌 (球孢子菌病)生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)處于劣勢(shì)，這對(duì)培養(yǎng)鑒定造成極大干擾；35℃培養(yǎng)，環(huán)境菌生長(zhǎng)受到明顯抑制，致病菌 (球孢子菌)生長(zhǎng)逐漸處于優(yōu)勢(shì)，并形成特征菌落，為此，一定情況下35℃培養(yǎng)條件應(yīng)該得到重視，并及時(shí)應(yīng)用；在此，我們深入分析并結(jié)合臨床，認(rèn)為鮮紅青霉為環(huán)境菌 (污染菌)，不是致病菌，而是否為致病菌的準(zhǔn)確判斷對(duì)真菌鑒定至為關(guān)鍵。⑦實(shí)驗(yàn)室和臨床緊密結(jié)合有助于真菌及時(shí)準(zhǔn)確鑒定，少走彎路。鑒定過(guò)程，要嚴(yán)密觀察真菌生長(zhǎng)特點(diǎn)，并應(yīng)及時(shí)判斷和鑒別，以確保準(zhǔn)確。⑧形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物鑒定要緊密結(jié)合。重視形態(tài)學(xué)觀察，這是真菌鑒定的基礎(chǔ)，同時(shí)進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定以進(jìn)行更細(xì)微準(zhǔn)確鑒定，并確證形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果。

3 小 結(jié)

球孢子菌病在我國(guó)較為少見(jiàn)，1958年首次報(bào)道過(guò)1例皮膚球孢子菌病[10]。國(guó)內(nèi)很多單位沒(méi)有開(kāi)展真菌培養(yǎng)，且此菌為甲類真菌，傳染性極強(qiáng)，人們談虎色變。球孢子菌的培養(yǎng)一般很難進(jìn)行，更缺少分子生物學(xué)鑒定信息，主要依靠病理診斷，這影響該菌的及時(shí)鑒定[11]。經(jīng)文獻(xiàn)查新，至此，國(guó)內(nèi)尚無(wú)報(bào)道。

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FirstreportofCoccidioidesposadasiiinChina

LIANG Guan-zhao,FU Mei-hua,LV Gui-xia,SHEN Yong-nian,MEI Huan,LIU Wei-da

(ChineseAcademyMedicalSciencesFungicultureCollectionCentreDepartmentofMycology,InstituteofDermatology,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Nanjing210042,China)

We separated a strain ofCoccidioidesspp.from a patient with lung infection and it was identified asCoccidioidesposadasii(C.posadasii) by both morphological features and molecular biology methods.After literature search,it has not been reported in China,up to now.

Coccidioidomycosis;Coccidioidesimmitis;Coccidioidesposadasii

[Chin J Mycol，2017，12(5):288-290]

R 519.8

A

1673-3827(2017)12-0288-03

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)基金 (2013FY113700)

梁官釗，男 (漢族)，博士研究生在讀.E-mail:guanzhaoguan@126.com

劉維達(dá),E-mail:liumyco@hotmail.com

2017-06-02本文編輯王 飛