宮頸癌中STING的表達(dá)及意義

鐘柏林，蔡璐，劉二秀，張功亮，王志

（江西省瑞金市婦幼保健院，江西 瑞金 342500；2.贛州市人民醫(yī)院，江西 瑞金 342500）

宮頸癌中STING的表達(dá)及意義

鐘柏林1，蔡璐2，劉二秀2，張功亮2，王志2

（江西省瑞金市婦幼保健院，江西 瑞金 342500；2.贛州市人民醫(yī)院，江西 瑞金 342500）

目的 對(duì)宮頸癌患者的癌變部位及其正常的癌旁組織中進(jìn)行檢測(cè)干擾素刺激基因（STING）水平，探討分析對(duì)其表達(dá)情況及其臨床影響。方法 對(duì)醫(yī)院篩選納入的60例宮頸癌患者的癌組織及其相應(yīng)的癌旁組織（癌旁組），采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)及熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分別對(duì)其組織中STING及下游通路相關(guān)基因表達(dá)情況進(jìn)行分析。結(jié)果 與矮胖組織相比，在癌變組織中STING表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在癌部組織中STING下游基因TBK-1及IRF-3的表達(dá)均明顯降低于其相應(yīng)的癌旁正常組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 在癌病灶組織內(nèi)STING及下游通路相關(guān)基因較正常上皮細(xì)胞者呈現(xiàn)出低表達(dá)狀態(tài)，其變化水平可能與癌病變程度有一定相關(guān)，在臨床治療中具有參考價(jià)值。

STING；基因；宮頸癌；表達(dá)；意義

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤，我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)地區(qū)，每年新增約13.15萬(wàn)例，其中約5.3萬(wàn)例死于該病，因此宮頸癌是我國(guó)重點(diǎn)研究的疾病之一。人乳頭瘤病毒（HPV）是一種重要的致瘤DNA病毒，可引起人生殖道和肛門皮膚、黏膜產(chǎn)生良性和惡性腫瘤，其中與宮頸癌發(fā)病密切相關(guān)的有HPV16、18等。在對(duì)宮頸癌發(fā)生和發(fā)展因素研究中發(fā)現(xiàn)，HPV在宮頸癌發(fā)生過(guò)程中起著重要作用。干擾素（IFN）一般被認(rèn)為參與機(jī)體的抗病毒固有免疫反應(yīng)，也可以通過(guò)IFN刺激基因在抗微生物感染、抗腫瘤過(guò)程中發(fā)揮重要作用[1]。而干擾素刺激基因（STING）作為DNA感受路中的重要分支，能夠感受胞質(zhì)游離的dsDNA，進(jìn)而調(diào)控IFN和多種炎性因子及趨化因子的分泌[2]。

目前國(guó)內(nèi)暫沒(méi)有對(duì)宮頸癌中STING的研究，故本課題研究探討STING在宮頸癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)及其臨床診斷意義，為宮頸癌早期診斷提供良好標(biāo)記物檢測(cè)。對(duì)STING及下游IFN通路相關(guān)基因TBK-1和IRF-3在宮頸癌組織中的表達(dá)情況分析，探討STING作為宮頸癌腫瘤標(biāo)記物的潛在診斷意義[3]。因此本文通過(guò)測(cè)定STING及下游基因在宮頸癌患者體內(nèi)中的表達(dá)狀態(tài)，對(duì)其臨床治療提供積極的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 依據(jù)臨床資料確定為宮頸癌，入選患者均符合診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理科對(duì)其病理類型證實(shí)，經(jīng)篩選后納入女性患者60例，年齡19～65歲，平均（53.1±7.3）歲，收集宮頸癌組織和對(duì)應(yīng)癌旁黏膜上皮組織。所有患者經(jīng)院倫理委員會(huì)通過(guò)審批，并在知情同意書(shū)簽字。本次研究所選取患者均需符合以下要求：研究組患者經(jīng)取材活檢病理檢查確診為宮頸癌；研究組患者未經(jīng)手術(shù)、放化療。滿若有以下幾項(xiàng)中任一項(xiàng)者均需排除：合并心肝腎等其他系統(tǒng)疾病者；有精神疾患的患者；不愿意參加本次研究的患者。

1.2 方法[4-5]采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)其中STING的表達(dá)；

培養(yǎng)宮頸癌細(xì)胞系hela細(xì)胞和正常角細(xì)胞HaCaT細(xì)胞；提取其RNA，采用熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)其中STING及下游IFN通路相關(guān)基因TBK-1和IRF-3的表達(dá)，具體操作如下。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 宮頸癌細(xì)胞系hela細(xì)胞和正常角細(xì)胞HaCaT細(xì)胞在DMEM/F12培養(yǎng)基，10%的胎牛血清中于37℃、含體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳（CO2）飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察生長(zhǎng)情況。待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期并傳代至足夠數(shù)量時(shí)，凍存一管，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)（IHC）染色 收集標(biāo)本采用對(duì)其STING免疫組織化學(xué)染色。采用免疫組化法檢測(cè)基因的表達(dá)。所有標(biāo)本均采用10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片，對(duì)切片進(jìn)行免疫組化，所有操作步驟均嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 熒光-定量PCR術(shù) 切取1～2 mm大小組織，利用通用型免疫組化試劑盒（上?；蚩萍迹?，使用磁珠法提取組織mRNA，用試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?，再用Light CyclerR480 SYBRGreenⅠMaster進(jìn)行擴(kuò)增，采用10μL反應(yīng)體系SYBR GreenⅠMaster 5μL，上下游引物4.0μL，模板1μL。反應(yīng)條件為:預(yù)變性95℃，1 min；變性95℃，10 s；退火65℃，30 s，共64個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品3個(gè)復(fù)孔，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 對(duì)所得結(jié)果使用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行比較分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 STING基因在宮頸癌癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)在篩選出的60例宮頸癌組織及癌旁組織STING基因表達(dá)分別為（0.11±0.09）及（0.32±0.14），TBK-1基因表達(dá)分別為（0.29±0.12）及（0.74±0.25），可知在癌組織細(xì)胞中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)。與癌旁組織相比，癌組織明顯低于癌旁正常組織中的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 基因的表達(dá)結(jié)果（x±s）

2.2 在不同組織內(nèi)IRF-3 mRNA表達(dá) 在篩選出的60例宮頸細(xì)胞癌及癌旁正常組織IRF-3表達(dá)分別為（0.11±0.09）、（0.32±0.14），組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而在正常角細(xì)胞系HaCaT細(xì)胞及癌細(xì)胞系hela細(xì)胞中表達(dá)水平分別為（0.148±0.023）、（0.092±0.011），見(jiàn)表2。

表2 基因的表達(dá)結(jié)果（x±s）

3 討論

宮頸癌是作為女性生殖器中最常見(jiàn)的一種惡性腫瘤，其在女性的發(fā)病率僅次于乳腺癌，對(duì)女性的身心健康和生活造成了嚴(yán)重的威脅，也是造成癌癥女性死亡的主要誘因。發(fā)病率逐年呈現(xiàn)大幅度增高的趨勢(shì)。目前對(duì)于宮頸癌的具體發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其發(fā)生發(fā)展的過(guò)程受多種因素的共同影響，而宮頸癌的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是多階段、多因素、多基因綜合作用和長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)展而產(chǎn)生的結(jié)果[6-7]。宮頸癌為國(guó)家大病救治的重點(diǎn)疾病，若能早期在對(duì)其作出預(yù)測(cè)、診斷，對(duì)宮頸癌的治療及預(yù)后無(wú)疑是一項(xiàng)重大的進(jìn)步，可以為國(guó)家節(jié)約治療費(fèi)用，具有良好的經(jīng)濟(jì)效益[8]。尤其中國(guó)是宮頸癌的高發(fā)國(guó)家，側(cè)重在農(nóng)村，惡性腫瘤重在預(yù)防，盡快找到宮頸癌早期診斷的指標(biāo)是關(guān)鍵，可以提早發(fā)現(xiàn)，達(dá)到早期治療宮頸癌的目的，從而提高治愈率，具有良好的社會(huì)效益[9]。

在本研究中結(jié)果顯示，宮頸癌癌組織與正常癌旁組織的STING基因、TBK-1、IRF-3表達(dá)水平比較發(fā)現(xiàn)，癌患者的STING基因及INF下游通路相關(guān)基因明顯低于正常組織患者（P＜0.05），為后其臨床治療提供一定的指導(dǎo)意義。

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10.3969/j.issn.1009-4393.2017.35.039

贛州市指導(dǎo)性科技計(jì)劃項(xiàng)目課題（GZ2016ZSF357）