草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾高致病力萊氏野村菌菌株的篩選及其田間防治效果

路廣亮，徐穎,2，羅卿權(quán)，王章訓(xùn)，李麗，蔡丹群

(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232； 3.上海辰山植物園，上海 201602；4.東郊賓館，上海 201203)

草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾高致病力萊氏野村菌菌株的篩選及其田間防治效果

路廣亮1，徐穎1,2，羅卿權(quán)1，王章訓(xùn)1，李麗3，蔡丹群4

(1.上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院，上海 200232； 2.上海城市困難立地綠化工程技術(shù)研究中心，上海 200232； 3.上海辰山植物園，上海 201602；4.東郊賓館，上海 201203)

室內(nèi)測(cè)定了7株萊氏野村菌Metarhiziumrileyi菌株對(duì)草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾Spodopteradepravata3齡幼蟲的毒力，結(jié)果表明，25 ℃下1×108個(gè)/mL孢子濃度萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾的致死中時(shí)LT50為3.75 ～ 5.21 d。選取室內(nèi)毒力測(cè)定中效果較好的菌株DT2011N7分別在8月和9月進(jìn)行2次野外藥效試驗(yàn)，結(jié)果表明，在8月高溫條件下，萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾無防治效果，而9月份防治效果明顯，藥后7 d，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為78.53%和54.29%，藥后10 d達(dá)到最佳防效，分別為79.33%和89.85%，藥后20 d，仍有一定的防效，分別為46.17%和41.55%。試驗(yàn)表明萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾具有良好的殺蟲活性和持效性，具有作為生防菌株開發(fā)利用的潛力。

萊氏野村菌；淡劍灰翅夜蛾；致死中時(shí)；防治效果

淡劍灰翅夜蛾Spodopteradepravata(原名淡劍襲夜蛾Sidemiadepravata)是近年來危害多種禾本科草坪草的重要害蟲，在日本、韓國也有分布[1-2]。在我國，該蟲被報(bào)道在上海、江蘇、湖北、湖南、浙江、福建、河北、遼寧、安徽、天津和山東等地對(duì)草坪造成嚴(yán)重危害[3-9]，蟲口密度高時(shí)，每平方米可達(dá)數(shù)百頭，對(duì)草坪造成毀滅性危害，是我國東部地區(qū)最為嚴(yán)重的草坪害蟲。同時(shí)，由于因其產(chǎn)卵量大、世代重疊嚴(yán)重[7]，防治難度較大。目前對(duì)該蟲的防控多依靠有機(jī)磷農(nóng)藥，對(duì)人體健康和環(huán)境危害較大，并不適宜在人們休閑休憩的草坪上使用，因此探尋安全高效的生物防治技術(shù)的重要性日益凸顯。

利用昆蟲病原真菌防治害蟲是有害生物防治的重要手段之一[10]，與傳統(tǒng)化學(xué)防治相比具有以下優(yōu)勢(shì)：對(duì)非靶標(biāo)生物(包括人)及環(huán)境安全，能形成昆蟲病害流行，不易產(chǎn)生抗藥性[11]。因此，真菌殺蟲劑的研究開發(fā)受到了廣泛的關(guān)注和重視。以綠僵菌產(chǎn)品為例，截至2014年7月，全球有83個(gè)獲得注冊(cè)，防治對(duì)象分別屬于12個(gè)目33個(gè)科[12]。

Metarhiziumrileyi原名萊氏野村菌Nomuraearileyi[13]，2014年Kepler 等重新界定了其分類地位，將其歸于綠僵菌屬M(fèi)etarhizium[14]。該菌對(duì)防治鱗翅目幼蟲極具潛力，其在一定環(huán)境條件下，能造成病害流行，有效降低害蟲種群數(shù)量[15-16]，已被廣泛報(bào)道可侵染夜蛾科害蟲，對(duì)斜紋夜蛾Spodopteralitura、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等鱗翅目害蟲有較強(qiáng)的致病力[16-17]。但迄今為止，未見包括萊氏野村菌在內(nèi)的昆蟲病原真菌防治草坪害蟲淡劍灰翅夜蛾的報(bào)道。

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，上海局部地區(qū)草坪上淡劍灰翅夜蛾和斜紋夜蛾有受真菌侵染大量死亡的現(xiàn)象，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和多基因序列分析明確其病原真菌為Metarhiziumrileyi[18]。在此基礎(chǔ)上，作者篩選出對(duì)淡劍灰翅夜蛾幼蟲高致病力菌株進(jìn)行田間防治試驗(yàn)，為萊氏野村菌對(duì)該蟲的防治應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 供試菌株：萊氏野村菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室分離并保存的菌株，分離自罹病淡劍灰翅夜蛾或斜紋夜蛾幼蟲。

供試?yán)ハx：野外采集淡劍灰翅夜蛾蟲卵，自然孵化后，將幼蟲轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒，置于光照培養(yǎng)箱中，光周期 14L∶10D，濕度75%，溫度25 ℃，以禾本科草坪草為飼料人工飼養(yǎng)，至成蟲羽化后交尾產(chǎn)卵，取下一代3 齡幼蟲作為供試蟲。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉16 g，加水定容至1 000 mL；薩氏麥芽糖酵母培養(yǎng)基(SMAY)：麥芽糖提取物40 g、蛋白胨10 g、酵母粉10 g、瓊脂粉16 g，加水定容至1 000 mL。

1.2 室內(nèi)毒力測(cè)定 在SMAY固體培養(yǎng)基上活化供試菌株后，涂板接種至SMAY 平板，于26 ℃下全光照恒溫培養(yǎng)10 ～ 15 d，待孢子長(zhǎng)滿平板后，用0.05% Tween-80洗脫孢子并轉(zhuǎn)移至滅菌三角瓶中，在渦旋震蕩儀上震蕩1 min，超聲波清洗儀上處理5 min后，用100目篩網(wǎng)過濾并收集濾液，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)濾液中孢子數(shù)，用0.05% Tween-80將孢子濾液稀釋為1×108個(gè)/mL。

采用浸漬法接種淡劍灰翅夜蛾3 齡幼蟲，每處理80頭。試蟲放入新鮮制備的1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液中浸蘸10 s后，置于無菌濾紙上，任其爬行晾干水分，移入滅菌養(yǎng)蟲盒，每盒1蟲。用0.05% Tween-80處理對(duì)照試蟲。將上述試蟲置于光周期L14∶D10，溫度25 ℃，濕度75%的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每天觀察記錄死亡情況，計(jì)算校正死亡率。使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS 8.1計(jì)算致死中時(shí)LT50。

1.3 野外防治試驗(yàn) 萊氏野村菌DT2011N7于SMAY固體培養(yǎng)基上26 ℃全光照恒溫培養(yǎng)10～15 d，用0.05% Tween-80洗脫孢子，制備濃度為1×108個(gè)/mL的孢子懸浮液，用此孢子懸浮液10倍稀釋制備1×107個(gè)/mL的孢子懸浮液。對(duì)照供試藥劑為48%毒死蜱乳油(陶氏益農(nóng))。

野外試驗(yàn)分別于2016年8月和9月在上海辰山植物園不同地塊矮生百慕達(dá)草坪上進(jìn)行。每次試驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理，萊氏野村菌孢子懸浮液1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL，對(duì)照藥劑48%毒死蜱乳油稀釋1000倍，噴施清水作為空白對(duì)照。每處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)小區(qū)20 m2，小區(qū)內(nèi)9點(diǎn)棋盤式取樣，每樣方20 cm×20 cm，計(jì)數(shù)樣方內(nèi)的活蟲數(shù)量。施藥前調(diào)查各處理小區(qū)內(nèi)蟲口基數(shù)，藥后3，7，10，20 d分別調(diào)查小區(qū)內(nèi)活蟲數(shù)，計(jì)算各處理的蟲口減退率及校正防效。試驗(yàn)期間上海地區(qū)的氣象狀況見表1。應(yīng)用Excel 2007計(jì)算蟲口減退率及校正防效，使用SAS 8.1軟件進(jìn)行單因素方差分析。

表1 2016年試驗(yàn)期間上海地區(qū)主要?dú)庀笾笜?biāo)

2 結(jié)果與分析

2.1 室內(nèi)高毒力菌株篩選結(jié)果 7株萊氏野村菌均在接種后2 d開始導(dǎo)致淡劍灰翅夜蛾3齡幼蟲死亡，在接種后7～8 d致試蟲全部死亡。受萊氏野村菌侵染死亡的蟲體僵直，死亡后2～3 d蟲體表面布滿白色菌絲，4～5 d蟲體表面開始出現(xiàn)淡綠色粉狀物，5～7 d蟲體表面布滿淡綠色粉狀物，為萊氏野村菌的分生孢子(圖1a)。表2結(jié)果表明，7株萊氏野村菌菌株接種淡劍灰翅夜蛾后，均在4～5 d達(dá)到對(duì)試蟲50 %的致死率，其中DT2014-2、XW-DSN3、DT2011N7的致死中時(shí)較短，分別為3.75，3.83，4.14 d，表明這3株菌株對(duì)淡劍灰翅夜蛾具有較強(qiáng)的致病力。

a.室內(nèi)毒力試驗(yàn)中死亡的幼蟲蟲體；b.施用萊氏野村菌10 d后田間幼蟲死亡蟲體圖1 受萊氏野村菌侵染死亡的淡劍灰翅夜蛾幼蟲蟲體

表2 萊氏野村菌不同菌株對(duì)淡劍灰翅夜蛾3齡幼蟲的致死中時(shí)(LT50)

2.2 野外防治效果 8月高溫條件下，噴施萊氏野村菌DT2011N7孢子懸浮液后，淡劍灰翅夜蛾3，7，10 d后的蟲口密度雖然均有所減退，但由于對(duì)照區(qū)的自然蟲口減退率也較快，萊氏野村菌的校正防效均為負(fù)值。野外死亡蟲體干癟僵硬，顏色變?yōu)楹谏?，散落于地面，未見表現(xiàn)受萊氏野村菌侵染癥狀的死亡蟲體。表明在此次試驗(yàn)中，萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾未顯示防效。對(duì)照化學(xué)藥劑48 %毒死蜱乳油1 000倍液的校正防效良好，為99.81%～100%(表3)。

表3 2016年8月16日野外防治試驗(yàn)結(jié)果

注：表中數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值，同列不同大寫字母代表不同處理間有極顯著性差異(Plt;0.01)。

9月適溫條件下，噴施萊氏野村菌DT2011N7孢子懸浮液后，藥后3 d無效果，藥后7 d開始表現(xiàn)出明顯的防治效果，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為78.53%和54.29%，高濃度孢子懸浮液的效果明顯高于低濃度。藥后10 d達(dá)到最佳防效，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別達(dá)到79.33%和89.85%。藥后20 d仍有一定防效，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為46.17 %和41.55 %。對(duì)照化學(xué)藥劑48 %毒死蜱乳油1 000倍液的校正防效為95.74 %～100 %(表4，5)。

注：表中數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值，同列不同大寫字母代表不同處理間有極顯著性差異(Plt;0.01)。

表5 2016年9月9日野外防治試驗(yàn)校正防效

注：表中數(shù)據(jù)為3個(gè)重復(fù)的平均值，同列不同大寫字母代表不同處理間有極顯著性差異(Plt;0.01)。

藥后7,10,20 d田間噴施萊氏野村菌孢子懸浮液的區(qū)域可見較多受萊氏野村菌侵染的淡劍灰翅夜蛾幼蟲死亡蟲體，初期蟲體表面密布白色菌絲(圖1b)，后期由于表面著生淡綠色分生孢子，整個(gè)蟲體轉(zhuǎn)為淡綠色或綠色，且死亡蟲體大多附于草莖或草葉上，只有少數(shù)散落在地面上。而清水對(duì)照區(qū)及化學(xué)藥劑處理區(qū)藥后20 d均未見受侵染死亡蟲體。藥后50 d檢查時(shí)，在清水對(duì)照區(qū)、化學(xué)藥劑處理區(qū)及園內(nèi)其它草坪上均可見到由于病害自然流行受侵染死亡的淡劍灰翅夜蛾罹病蟲體。

3 結(jié)論與討論

致病力是衡量菌株生防潛力的重要指標(biāo)[19]。由于蟲生真菌具有一定的遺傳多樣性，不同寄主來源的同種菌株對(duì)不同昆蟲的毒力差別較大[20]，即使是分離自同一種寄主昆蟲的不同菌株毒力也有差異[19]。因此分離并篩選對(duì)淡劍灰翅夜蛾高毒力的萊氏野村菌菌株對(duì)其生物防治十分重要。本研究選取了分離自兩種不同寄主淡劍灰翅夜蛾和斜紋夜蛾的萊氏野村菌菌株進(jìn)行對(duì)淡劍灰翅夜蛾的室內(nèi)毒力篩選，毒力較高的3株菌株中既有分離自淡劍灰翅夜蛾的菌株，也有分離自斜紋夜蛾的菌株，表明來自這兩種寄主的萊氏野村菌不同菌株均可侵染淡劍灰翅夜蛾，且毒力水平相差不大。

氣候因素對(duì)萊氏野村菌的防治效果影響極大。在8月和9月2次野外防治試驗(yàn)中萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾的防治效果完全不同，8月萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾無防治效果，而9月防治效果明顯，藥后10 d達(dá)到最好防治效果89.8%。8月試驗(yàn)期間白天最高溫度的平均值為34.9 ℃，夜間最低溫度的平均值為27.1 ℃。9月試驗(yàn)期間白天最高溫度的平均值為27.7 ℃，夜間最低溫度的平均值為21.6 ℃。溫度對(duì)萊氏野村菌毒力的直接影響未見報(bào)道，但研究表明萊氏野村菌菌株毒力與產(chǎn)孢量及孢子萌發(fā)速率具正相關(guān)性[20]。同時(shí)多位研究者報(bào)道溫度對(duì)萊氏野村菌菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響[15,21-22]，20～ 30 ℃之間萊氏野村菌可以較好生長(zhǎng)，32 ℃以上菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)明顯受到抑制，其中涂增 等[15]和孔瓊 等[22]的研究表明，32 ℃時(shí)萊氏野村菌基本不產(chǎn)孢。因此推測(cè)溫度因素影響了施用后萊氏野村菌在田間的生長(zhǎng)和繁殖，導(dǎo)致了田間8月和9月防治效果完全不同。

作者觀察了淡劍灰翅夜蛾在不同溫度下的年齡-齡期生命表，表明在26～30 ℃ 溫度下淡劍灰翅夜蛾種群增殖能力最強(qiáng)[23]，這個(gè)溫度范圍恰好介于萊氏野村菌可以較好生長(zhǎng)繁殖的溫度范圍內(nèi)(20～30 ℃)，因此從適生溫度來看，可以利用萊氏野村菌在淡劍灰翅夜蛾發(fā)生高峰期對(duì)其進(jìn)行防治。

淡劍灰翅夜蛾在上海的發(fā)生高峰為7—10月，自然情況下，野外在10月下旬起才易于觀察到淡劍灰翅夜蛾被萊氏野村菌侵染寄生現(xiàn)象，這可能是由于萊氏野村菌大范圍流行需要達(dá)到一定菌量積累。本研究結(jié)果表明9月施用萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾有較好防效，較田間昆蟲病害流行的時(shí)間要早，因此可以在9—10月施用萊氏野村菌替代化學(xué)藥劑防治淡劍灰翅夜蛾，人工施用生防菌縮減了菌量積累所需的時(shí)間，使田間大范圍寄生提前發(fā)生。Sprenkel amp; Brooks[24]和Ignoffo 等[25]早期在研究萊氏野村菌防治大豆田夜蛾科害蟲時(shí)也指出，施用萊氏野村菌可誘使田間昆蟲的真菌病害提前流行，更好地達(dá)到在高峰期防治害蟲的目的。

施用萊氏野村菌不同濃度孢子在防治初期效果差異明顯，在防治后期無正相關(guān)差異。藥后7 d，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為78.53 %和54.29 %，高濃度孢子懸浮液的效果明顯好于低濃度，但在藥后10 d達(dá)到最好防效時(shí)，1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為79.33 %和89.85 %，高濃度孢子懸浮液的效果并沒有高于低濃度。施藥20 d后1×108個(gè)/mL和1×107個(gè)/mL孢子懸浮液的校正防效分別為46.17 %和41.55 %，無顯著差異。因此，在實(shí)際防治應(yīng)用時(shí)，如需達(dá)到速效性，可使用較高濃度的萊氏野村菌，如蟲口密度較低，對(duì)速效性要求不高，推薦使用較低濃度。

本研究結(jié)果表明供試萊氏野村菌對(duì)淡劍灰翅夜蛾具有良好的殺蟲活性和持效性，具有很好的開發(fā)利用潛力。但其產(chǎn)孢條件、室內(nèi)生物學(xué)特性等還需進(jìn)一步研究，以便為其應(yīng)用提供更多的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 王巧申)

ScreeningandfieldcontrolefficacyofhighvirulentstrainsofMetarhiziumrileyiagainstlawnpestSpodopteradepravata/

LU Guangliang,et al.
(Shanghai Academy of Landscape Architecture Science and Planning,Shanghai 200232 China)

The virulence of sevenMetarhiziumrileyistrains against 3rd instar larvaeSpodopteradepravatawas screened.The bioassay result showed the median lethal time LT50ofM.rileyiagainstS.depravatawas 3.75 ～ 5.21 d with 1×108conidia/mL under 25 ℃.Field trial was conducted to evaluate the efficacy of the selectedM.rileyistrain DT2011N7 in August and September,respectively.While the treatment under higher temperature showed no efficacy in August,the corrected control efficacy in cooler September was 78.53% with 1×108conidia/mL spore suspension and 54.29% with 1×107conidia /mL on the 7th day after treatment,the efficacy on the 10th day was 79.33% and 89.85% respectively,which showed the best control efficacy,and the efficacy in the 20th day was 46.17% and 41.55%,respectively.HenceM.rileyiis a promising fungal insecticide for controllingS.depravata.

Metarhiziumrileyi;Spodopteradepravata;median lethal time (LT50);control efficacy

2017-04-06；

2017-07-03

上海市科技人才計(jì)劃項(xiàng)目(14YF1414100)，上海市綠化和市容管理局攻關(guān)項(xiàng)目辰山科研專項(xiàng)(G142437)

路廣亮(1988—)，河南鶴壁人，助理工程師，研究方向?yàn)榫G化植物病蟲害綜合治理，E-mail：mn8875@163.com

徐穎，博士，E-mail：xuying20002@163.com。

S763.306.4

B

1671-0886(2017)06-0040-05