地衣內(nèi)生真菌的鑒定及其抗植物病原菌活性

范莉莉　秦正男　郭守玉　韓留福

摘要：以粉緣斑葉梅（Cetrelia cetrarioides）、粉樹花（Ramalina farinacea）、東方松蘿（Usnea orientalis）3種地衣為試驗(yàn)材料，進(jìn)行內(nèi)生真菌分離、鑒定、物種多樣性、ITS（internal transcribed spacer）序列系統(tǒng)發(fā)育分析以及抗植物病原菌活性的初步研究。物種多樣性研究結(jié)果表明，3種地衣體中分離共獲得29株內(nèi)生真菌，確定隸屬于4科8屬；其中，炭角菌屬為3種地衣內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬。地衣內(nèi)生真菌粗提發(fā)酵液對(duì)鐮刀菌（Fusarium sp）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、黃瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum等4種供試植物病原菌抗菌活性試驗(yàn)結(jié)果表明，東方松蘿中的內(nèi)生真菌C25、C27和C49效果良好，有潛在的生物防治應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：地衣；內(nèi)生真菌；分類；鑒定；抗病原菌活性；優(yōu)勢(shì)屬；生物防治

中圖分類號(hào)： S94932；S182文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）21-0115-04

收稿日期：2017-04-18

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31370067）；湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金（編號(hào)：2012snjAB001）；河北省自然科學(xué)基金（編號(hào)：C2016205201）

作者簡(jiǎn)介：范莉莉（1989—），女，河北邯鄲人，碩士研究生，主要從事地衣內(nèi)生真菌資源研究。E-mail：lilifan0529@163com。

通信作者：韓留福，博士，教授，主要從事地衣生物學(xué)研究。E-mail：hanliufu@hebtueducn。

植物內(nèi)生真菌（endophytic fungi）是指寄生于健康植物組織內(nèi)，但不會(huì)引起宿主植物出現(xiàn)不良癥狀的一類微生物1]。Clay等發(fā)現(xiàn)侵染內(nèi)生真菌的牧草遭受到真菌病害影響的程度遠(yuǎn)低于沒(méi)有感染內(nèi)生真菌的，感染內(nèi)生真菌的宿主植物往往比未感染植株更具生存競(jìng)爭(zhēng)力2-3]。藥用植物體內(nèi)存在能產(chǎn)生與宿主植物活性成分物質(zhì)相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物在新型藥物開(kāi)發(fā)和生物防治等方面具有巨大的潛在應(yīng)用價(jià)值4-6]。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的具有抗菌活性菌株被發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌逐漸成為研究的熱點(diǎn)。

目前人們僅僅利用植物內(nèi)生真菌的小部分，還有很多未從植物體內(nèi)分離、培養(yǎng)、開(kāi)發(fā)利用。國(guó)內(nèi)外對(duì)內(nèi)生真菌的研究主要集中在高等植物中，對(duì)低等植物尤其是地衣的研究較少7-9]。事實(shí)上，內(nèi)生真菌作為一個(gè)較大的生物類群，也廣泛存在于地衣組織中10-12]。在藥用研究方面，從扁枝衣分離獲得的6株內(nèi)生真菌通過(guò)平板對(duì)峙法進(jìn)行抗菌活性研究發(fā)現(xiàn)，2株產(chǎn)生明顯的拮抗帶，抑菌效果顯著，是良好的生物防治候選菌株13]?？傊匾聝?nèi)生真菌作為一類重要的真菌資源，它們的藥用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值尚未被有效開(kāi)發(fā)利用。本研究以采自神農(nóng)架林區(qū)的藥用地衣粉緣斑葉梅（Cetrelia cetrarioides）、粉樹花（Ramalina farinacea）、東方松蘿（Usnea orientalis）為材料，進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)、種類多樣性分析和抗植物病原菌活性菌株篩選，旨在為豐富地衣內(nèi)生真菌資源，并為植物病害的生物防治提供資料。

1材料與方法

11樣本采集

2014年4月從湖北省神農(nóng)架林區(qū)海拔2 150 m的樹枝或樹干上隨機(jī)采集粉緣斑葉梅、粉樹花、東方松蘿等地衣標(biāo)本。在實(shí)驗(yàn)室溫度為4 ℃條件下保存，并在5～7 d處理完畢。試驗(yàn)所用地衣樣本及分離的內(nèi)生真菌菌株均保存在中國(guó)科學(xué)院微生物所標(biāo)本室（HMAS-L）、河北師范大學(xué)標(biāo)本室（HBNU-L）中。

12內(nèi)生真菌的分離、純化和分類鑒定

菌株分離：（1）樣本清洗。選取適量樣本，自來(lái)水沖洗 1～2 h，剔除表面雜物；在超凈臺(tái)上，用紫外照射上下表面各10 min。（2）表面消毒。無(wú)菌水涮洗3遍，75%乙醇消毒 30 s，3% NaClO溶液消毒3 min，75%乙醇消毒30 s，無(wú)菌水涮洗3遍，置于無(wú)菌吸水紙上。（3）分離方法。剪碎消毒樣本，置于加入400 μL無(wú)菌水的20 mL離心管中，玻璃棒研磨；涂布接種；20 ℃條件下培養(yǎng)。

菌株純化：待培養(yǎng)基長(zhǎng)出菌落后，采用頂端純化法，轉(zhuǎn)接至新PDA培養(yǎng)基上，多次純化，直到得到單一、穩(wěn)定的菌落，4 ℃ 條件下保存。

分類鑒定：利用解剖鏡觀察菌落特征；采用插片法對(duì)菌絲和孢子進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。通過(guò)DNA提取，PCR擴(kuò)增，獲得nrDNA的ITS序列，經(jīng)校正后，NCBI在線進(jìn)行Blast比對(duì)，確定一致性最高的同源序列，結(jié)合菌落形態(tài)和顯微特征，進(jìn)行內(nèi)生真菌分類鑒定14-15]。

13內(nèi)生真菌發(fā)酵液的抗菌活性試驗(yàn)方法

4種供試植物病原菌包括鐮刀菌（Fusarium sp）、多枝橫梗霉（Lichtheimia ramosa）、黃瓜萎蔫病菌 （Plectosphaerella cucumerina）、Pythium capillosum以及陽(yáng)性對(duì)照菌球毛殼菌（Chaetomium globosum），均由河北師范大學(xué)地衣生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

試驗(yàn)步驟：（1）菌株活化。取出在4 ℃條件下保存的地衣內(nèi)生真菌，于PDA培養(yǎng)基中活化，25 ℃條件下培養(yǎng)6～7 d。（2）搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)16]。取適量活化菌株接種于200 mL PDB液體培養(yǎng)基中，25 ℃、150 rmin搖床振蕩培養(yǎng)7～15 d。（3）粗提液制備。將內(nèi)生真菌發(fā)酵液離心、過(guò)濾，取上清液進(jìn)行丙酮浸提，獲得粗提液。（4）粗提液培養(yǎng)基制備。將粗提液加入PDA培養(yǎng)基（二者體積比為1 ∶20）混勻，制成粗提液培養(yǎng)基。以球毛殼菌粗提液培養(yǎng)基作為陽(yáng)性對(duì)照1，以無(wú)菌水加入等量丙酮培養(yǎng)基作為對(duì)照2。（5）抗菌活性測(cè)試。接種植物病原菌于培養(yǎng)基中央，25 ℃條件下培養(yǎng)。十字交叉法測(cè)量病原菌菌落直徑（cm），按照下面公式計(jì)算其抑菌率17]：endprint

抑菌率=對(duì)照生長(zhǎng)量（cm）-處理生長(zhǎng)量（cm）]對(duì)照生長(zhǎng)量（cm）×100%。

2結(jié)果與分析

21分離結(jié)果

從3種地衣樣本的150塊組織中分離共獲得29株內(nèi)生真菌，定殖率為1933%。其中，從葉狀地衣粉緣斑葉梅中分離獲得9株內(nèi)生真菌（C21、C22、C23、C39、C54、C55、C60、C61、C63），定殖率為3000%；從枝狀地衣粉樹花中獲得11株內(nèi)生真菌（C31、C32、C33、C36、C38、C40、C51、C52、C53、C57和C58），定殖率為1833%；從枝狀地衣東方松蘿中分離獲得9株內(nèi)生真菌（C25、C27、C35、C42、C45、C49、C50、C59和C65），定殖率為1500%（表1）。結(jié)果表明，葉狀地衣定殖率高于枝狀地衣。

22地衣內(nèi)生真菌的物種多樣性

對(duì)地衣內(nèi)生真菌菌落特征進(jìn)行簡(jiǎn)要描述（表2、圖1）。利用測(cè)得nrDNA-ITS序列與GenBank中已注冊(cè)信息在線比對(duì)，結(jié)果如表2所示；基于nrDNA-ITS序列信息，利用Mega 6軟件構(gòu)建地衣內(nèi)生真菌與其他相關(guān)真菌類群的鄰接（neighbor-joining，簡(jiǎn)稱NJ）系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），系統(tǒng)樹的每個(gè)分支的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析以Bootstrap方法進(jìn)行檢驗(yàn)，重復(fù)1 000次。結(jié)果表明，29株內(nèi)生真菌確定隸屬于8屬，其中炭角菌屬（Xylaria）有12株菌株，占4138%，為3種地衣內(nèi)生真菌的優(yōu)勢(shì)屬。

23發(fā)酵粗提液的抗菌活性

由表3可知，對(duì)照1（球毛殼菌）對(duì)植物病原菌表現(xiàn)出一定的抑菌效果；對(duì)照2（無(wú)菌水加丙酮）對(duì)植物病原菌均無(wú)抑菌效果；C25發(fā)酵粗提液對(duì)鐮刀菌、多枝橫梗霉的抑菌率分別為3326%、3287%，對(duì)黃瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率達(dá)95%以上；C27發(fā)酵粗提液對(duì)鐮刀菌、黃瓜萎蔫病菌的抑菌率分別為1338%、1564%，對(duì)Pcapillosum表現(xiàn)為完全抑制；對(duì)多枝橫梗霉的抑菌率約為4965%；C49發(fā)酵粗提液對(duì)黃瓜萎蔫病菌和P capillosum的抑菌率達(dá)均到90%以上，對(duì)鐮刀菌的抑菌率約為4567%，對(duì)多枝橫梗霉的抑菌率為1042%。其他內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液均未發(fā)現(xiàn)抑菌效果。

試驗(yàn)結(jié)果表明，東方松蘿內(nèi)生真菌C25、C27、C49的發(fā)酵粗提液對(duì)植物病原菌的抑菌效果較好且具有廣譜性。

3結(jié)論與討論

目前真菌鑒定主要基于形態(tài)學(xué)特征和特定的分子序列差異，其中ITS序列分析法鑒定種間關(guān)系準(zhǔn)確性相對(duì)較高，簡(jiǎn)單易行，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值18]。本試驗(yàn)對(duì)內(nèi)生真菌進(jìn)行ITS序列分析、系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建、輔助形態(tài)學(xué)鑒定以及內(nèi)生真菌分類地位的確定。

植物內(nèi)生真菌作為一種新興的微生物資源，具有廣闊的開(kāi)發(fā)前景19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌具有廣泛的抗菌活性20]。通過(guò)對(duì)3種地衣內(nèi)生真菌發(fā)酵粗提液的抗植物病原菌活性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3株分離自東方松蘿的地衣內(nèi)生真菌C25、C27和C49抑菌率較高，具有較好的抗菌活性，有望成為很好的生物防治菌，在農(nóng)作物病害預(yù)防中可以發(fā)揮重要的作用。

參考文獻(xiàn)：

1]ZK（#]郭良棟 內(nèi)生真菌研究進(jìn)展J] 菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152

2]Clay K，Cheplick G P，Marks S Impact of the fungus Balansia henningsiana on Panicum agrostoides： frequency of infection，plant growth andreproduction，and resistance to pestsJ] Oecologia，1989，80（3）：374-380

3]任愛(ài)梅，張麗珂，孟憲剛 植物內(nèi)生真菌研究進(jìn)展與存在問(wèn)題J] 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（2）：103-106

4]李標(biāo)，李清，唐坤，等 內(nèi)生真菌在中藥現(xiàn)代化中的作用J] 中國(guó)中藥雜志，2016，41（1）：14-19

5]張蕓，馮自力，馮鴻杰，等 內(nèi)生球毛殼屬真菌CEF-082對(duì)棉花黃萎病的控制作用J] 植物病理學(xué)報(bào)，2016，46（5）：697-706

6]Xiang L，Gong S J，Yang L J，et al Biocontrol potential of endophytic fungi in medicinal plants from Wuhan Botanical Garden in ChinaJ] Biological Control，2016，94（3）：47-55

7]Huang W Y，Cai Y Z，Hyde K D，et al Biodiversity of endophytic fungi associated with 29 traditional Chinese medicinal plantsJ] Fungal diversity，2008，33（61）：61-75

8]Jia M，Chen L，Xin H L，et al A friendly relationship between endophytic fungi and medicinal plants：a systematic reviewJ] Frontiers in Microbiology，2016，7：906

9]王利梅，角建林，陳麗玲，等 金葉女貞內(nèi)生真菌分離及抑菌活性J] 昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，37（3）：18-21

10]ZK（#]Li W C，Zhou J，Guo S Y，et al Endophytic fungi associated with lichens in Baihua mountain of Beijing，ChinaJ] Fungal Diversity，2007，25（5）：69-80

11]Kellogg J J，Raja H A Endolichenic fungi：a new source of rich bioactive secondary metabolites on the horizonJ] Phytochemistry Reviews，2017，16（2）：271-293

12]Shivanna R，Garampalli R H Investigation of macrolichens for antifungal potentiality against phytopathogensJ] Indo American Journal of Pharmaceutical Research，2016，6（4）：5290-5296endprint