春蘭雜交種子無菌萌發(fā)及植株再生培養(yǎng)技術

馬輝　張?zhí)稹×蝴惥“ㄖ摇￡愋闾m　孫葉

摘要：研究了春蘭種內(nèi)雜交種和種間雜交種的結(jié)實情況，種子無菌萌發(fā)和植株再生培養(yǎng)技術。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春蘭種內(nèi)雜交、春蘭與蕙蘭種間正反交結(jié)果率和種子量都比較正常，春蘭種內(nèi)雜交種萌發(fā)率明顯高于種間雜交種；春蘭種內(nèi)雜交種第1年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的占到1111%，第2年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50組合為24%，第3年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的占到3827%，春蘭品種自交種、種子萌發(fā)原球莖出現(xiàn)不同程度的白化變異；春蘭和大花蕙蘭種間正反交結(jié)果率差異較大，蒴果種子量少，但種子萌發(fā)數(shù)多，種子培養(yǎng)第1年萌發(fā)數(shù)均大于100；春蘭種內(nèi)雜交種子萌發(fā)后根狀莖增殖和芽誘導液體培養(yǎng)方式的增殖生長量和形成優(yōu)勢數(shù)明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)。在“環(huán)球荷鼎×九章梅”雜交種組培小苗根誘導試驗中，當活性炭濃度為1 gL，NAA濃度為05 mgL時，組培苗平均新根數(shù)和平均新根長數(shù)最大。

關鍵詞：春蘭；人工雜交；無菌萌發(fā)；植株再生

中圖分類號： S6823104+3文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0049-03[

[HJ14mm]

收稿日期：2016-05-26

基金項目：江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（13）5071）。

作者簡介：馬輝（1987—），男，江蘇泰州人，研究實習員，主要從事花卉組織培養(yǎng)研究。E-mail：mhhao520@qqcom。

通信作者：孫葉，碩士，副研究員，主要從事花卉育種和組織培養(yǎng)研究。E-mail：sunye9999@126com。

春蘭（Cymbidium goeringii）是蘭科蘭屬地生蘭類多年生草本，是傳統(tǒng)中國蘭的代表種，原產(chǎn)于我國長江流域或西南地區(qū)，日本和朝鮮半島也有分布。春蘭名優(yōu)品種具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值，在東南亞特別是日本、韓國和臺灣地區(qū)十分受歡迎。春蘭的花期恰逢農(nóng)歷春節(jié)，在年宵花市場有很大的開發(fā)潛力。利用春蘭名優(yōu)品種作為親本，進行種內(nèi)雜交和種間雜交，是豐富春蘭花期、花型、花色性狀，選育春蘭優(yōu)良新種質(zhì)的有效途徑，人工雜交育種和組培快繁技術對春蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有十分重要的意義。

1材料與方法

11材料

試驗材料春蘭、蕙蘭（C faberi）、大花蕙蘭（C hybrids）由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學研究所“香蘭苑”中國蘭種質(zhì)資源圃提供；無菌播種材料為2009年以來人工雜交獲得的雜交種；增殖培養(yǎng)和芽分化材料為雜交種2012年無菌萌發(fā)后形成的原球莖或根狀莖；根誘導試驗材料為“環(huán)球荷鼎×九章梅”雜交組合雜交種經(jīng)無菌萌發(fā)，增殖培養(yǎng)和芽誘導培養(yǎng)后的 3～4 cm 無根組培苗。

12方法

121人工雜交2009—2015年春，對花期相遇的春蘭、蕙蘭、大花蕙蘭作為親本進行人工授粉雜交。雜交組合主要分為春蘭種內(nèi)品種間雜交、春蘭與蕙蘭的種間雜交、春蘭與大花蕙蘭的種間雜交。授粉時用干凈的鑷子把母本的花粉取下，將父本的花粉塊放入母本的蕊腔中，用記號筆在花盆上和試驗記錄本上寫明雜交組合名稱、雜交時間，3個月后登記結(jié)果率；分別在無菌播種后12、24、36個月統(tǒng)計雜交種萌發(fā)率。

122種子無菌播種及萌發(fā)時間統(tǒng)計采收成熟度為5—7個月、果皮略黃但尚未裂開的蒴果，種子前處理后，播于固體培養(yǎng)基，每個塑果播10瓶，統(tǒng)計相對種子量。培養(yǎng)基配方為12MS+05 mgLNAA+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL 活性炭+70 gL瓊脂，pH值51～54。播種后暗培養(yǎng)，室溫為25～28 ℃，種子萌發(fā)后見光培養(yǎng)10～12 hd，3個月后每月統(tǒng)計雜交組合的雜交種子萌發(fā)數(shù)。

123增殖培養(yǎng)、芽分化誘導的基本培養(yǎng)增殖培養(yǎng)、芽分化誘導的基本培養(yǎng)基為12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL活性炭，pH值51～54，固體培養(yǎng)基加7 gL瓊脂粉，液體培養(yǎng)基不添加瓊脂粉。3因素隨機區(qū)組試驗，A因素為不同雜交組合，5個材料；B因素為NAA和6-BA濃度配比，5個水平；C因素為培養(yǎng)方式，液體培養(yǎng)或固體培養(yǎng)。每個處理培養(yǎng)4 g根狀莖，10個重復，培養(yǎng)3個月后稱質(zhì)量統(tǒng)計，統(tǒng)計根狀生長量和優(yōu)勢芽數(shù)。

124生根誘導的基本培養(yǎng)生根誘導的基本培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基為12MS+05 gL蛋白胨+20 gL蔗糖+05 gL馬鈴薯粉，pH值51～54。2因素試驗，A因素為活性炭濃度，3個水平，B因素為NAA濃度，3個水平。每個處理接種6株無根小苗，5個重復，培養(yǎng)90 d后測量和統(tǒng)計每處理的平均新根數(shù)和平均新根長。

2結(jié)果與分析

21春蘭人工雜交的結(jié)果率及雜交組合萌發(fā)情況

研究發(fā)現(xiàn)，春蘭種內(nèi)及春蘭、蕙蘭種間雜交的結(jié)果率和種子量都很正常。春蘭種內(nèi)雜交的組合萌發(fā)率為525%，較春蘭種間雜交高；大花蕙蘭作為母本和春蘭雜交不容易獲得蒴果，種子發(fā)育不正常，沒有萌發(fā)的組合；春蘭作為母本與大花蕙蘭雜交結(jié)果率達80%，但種子量較正常雜交種少，但由于蘭花雜交種子總量大，春蘭和大花蕙蘭雜交種種子萌發(fā)后群體仍然很大，并不影響種苗快繁和新品種選育（表1）。

22春蘭品種間雜交種的種子萌發(fā)情況

春蘭和蕙蘭種間雜交部分雜交種能正常萌發(fā)，但種子萌發(fā)時間較長，種子萌發(fā)數(shù)較低，均小于50（表2）。春蘭和大花蕙蘭雜交，雜交組合第1年就能大量萌發(fā)，第2年少量萌發(fā)，第3年基本已不萌發(fā)（表3）。

春蘭種內(nèi)雜交種子第1年萌發(fā)數(shù)大于50的組合占到1111%，第2年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50組合為24%，第3年雜交種子萌發(fā)數(shù)大于50的組合占到3827%。其中第1年[CM（25]萌發(fā)數(shù)較大的組合以種子萌發(fā)大于100為主，第2、第3年

萌發(fā)數(shù)較大的組合以種子萌發(fā)大于50為主。所有萌發(fā)組合中，種子萌發(fā)量較大的組合占到5178%（表4）。endprint

春蘭自交種子3年內(nèi)種子萌發(fā)數(shù)較大的組合占 6364%，但自交種萌發(fā)后出現(xiàn)原球莖白化現(xiàn)象的組合占 7273%，白化率最高達到364%。這些白化材料能正常增殖和芽分化，培養(yǎng)出白化苗，但組培苗成苗率較低，綠色材料能正常培養(yǎng)，組培苗出瓶后生長性狀也比較穩(wěn)定（表5）。

23春蘭品種間雜交種的增殖培養(yǎng)和芽分化誘導

不同雜交組合的雜交種根狀莖在NAA濃度為05 mgL的液體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)生長量較大，與固體培養(yǎng)基比較，液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根狀莖增殖生長量大；根狀莖在NAA、6-BA濃度為（0+2） mgL和（1+3） mgL時，優(yōu)勢芽較多，同一激素濃度下，液體培養(yǎng)基較固體培養(yǎng)基平均優(yōu)勢芽多；不同雜交組合的根狀莖生長和芽誘導的最佳培養(yǎng)基配方和最佳培養(yǎng)方

式不同（表6）。

24春蘭品種間雜交種的根誘導

當活性炭濃度為10 gL、NAA濃度為05 mgL時，組培苗平均新根數(shù)和平均新根長最大。NAA濃度相同時，隨著活性炭濃度增加平均新根數(shù)增加，但無顯著影響，活性炭濃度相同時，隨著NAA的濃度增加平均新根數(shù)和平均新根長增加，且影響顯著（表7）。

3結(jié)論與討論

春蘭的品種創(chuàng)新水平嚴重落后于國外蘭科花卉，主要原因是人工雜交選育還未成為中國蘭品種創(chuàng)新的主要途徑。蘭科植物人工雜交選育新品種的主要技術瓶頸為雜交種子的無菌萌發(fā)和植株再生培養(yǎng)[1-4]，本研究結(jié)果表明，春蘭品種間雜交種結(jié)果率很高，雜交組合萌發(fā)率達525%，種子萌發(fā)時間長達3年左右，1年內(nèi)萌發(fā)，種子萌發(fā)數(shù)大的雜交種僅占58%，這與以往的研究結(jié)果[5]一致。春蘭雜交種的萌發(fā)特點增加了人工雜交育種的難度，因此增加雜交組合的數(shù)量，延長雜交種子的萌發(fā)時間是提高雜交種萌發(fā)率的有效途徑。

春蘭、蕙蘭都屬于蘭屬地生蘭種，親緣關系較近，大花蕙蘭是通過蘭屬中的大花附生種、小花垂生種以及一些地生蘭經(jīng)過多代人工雜交育成的品種群。本研究發(fā)現(xiàn)春蘭種間雜交組合中，春蘭和蕙蘭正反交結(jié)果率都正常，但雜交種萌發(fā)率低，種子萌發(fā)時間長，種子培養(yǎng)2～3年后才萌發(fā)，且種子萌發(fā)數(shù)也較少，均未超過50個。春蘭和大花蕙蘭的正反交雜交種的結(jié)果率差異明顯，春蘭為母本時能得到雜交蒴果，但雜交種種子量較正常雜交種少，雜交種萌發(fā)時間短，以種子→原球莖→完整植株途徑生長發(fā)育成苗，這是附生蘭種子發(fā)育的特點。以往研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)具有附生蘭血統(tǒng)的大花蕙蘭與地生蘭雜交具有此特點[6-10]，因此推測，春蘭、蕙蘭雜交種的種子萌發(fā)困難、萌發(fā)時間長是由地生蘭的特性決定的，研究相關內(nèi)容可

能是解決中國蘭雜交種萌發(fā)困難、萌發(fā)時間長問題的關鍵。

春蘭的組培快繁是實現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)的重要前提，植物組培用培養(yǎng)基有固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基相對固體培養(yǎng)基組織培養(yǎng)量大，可培養(yǎng)時間長，工序簡單，節(jié)省成本，本研究結(jié)果證明液體培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)和誘芽培養(yǎng)效果優(yōu)于固體培養(yǎng)基，與已有研究報道[11-13]一致，但還未受到廣泛關注，液體培養(yǎng)方式對于春蘭大規(guī)模組培快繁有很高的應用價值，可嘗試推廣。

參考文獻：

[1][ZK（#]李子紅，賈燕 珍品蘭花快速繁殖與養(yǎng)護[M] 上海：上?？茖W技術出版社，2006

[2]徐程，詹忠根，張銘 中國蘭的組織培養(yǎng)[J] 植物生理學通訊，2002，38（2）：171-174

[3]黃磊，賀筱蓉，鄭立明 春蘭種子非共生萌發(fā)的研究[J] 種子，2003，132（6）：40-41

[4]孫崇波，劉玫，施季森 蕙蘭種子無菌萌發(fā)及植株再生[J] 浙江農(nóng)業(yè)學報，2008，20（4）：231-235

[5]龐惠仙，楊紅明，馬駿，等 春蘭、豆瓣蘭、蓮瓣蘭和春劍4種國蘭種子萌發(fā)特性研究初報[J] 西部林業(yè)科學，2010，39（3）：56-60

[6]孟英，聞永慧，李慧敏，等 虎雪蘭與朱砂蘭、蕙蘭正反交育種及種子無菌萌發(fā)與增殖研究[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學，2014，42（13）：3812-3814

[7]張志勝，何瓊英，傅雪琳，等 中國蘭花遠緣雜交及雜交種子萌發(fā)的研究[J] 華南農(nóng)業(yè)大學學報，2001，22（2）：62-65

[8]朱根發(fā)，王碧青，陳明莉，等 大花蕙蘭與蘭屬植物種間雜交研究[J] 植物學通報，2005，22（4）：445-448

[9]曾碧玉，常強，許傳俊 雜交蘭品種“韓國小姐”與墨蘭品種“企劍黑墨”雜交坐果及無菌播種研究[J] 熱帶作物學報，2015，36（3）：510-515

[10][ZK（#]朱根發(fā)，陳明莉，羅智偉，等 墨蘭與大花蕙蘭種間雜種原球莖的誘導及增殖研究[J] 園藝學報，2004，31（5）：688-690

[11]孫葉，包建忠，劉春貴，等 春蘭雜交種子無菌萌發(fā)及根狀莖增殖的研究[J] 金陵科技學院學報，2012，28（1）：76-79

[12]陳銀龍 國蘭無菌播種技術研究[J] 安徽農(nóng)業(yè)科學，2006，34（17）：4291

[13]王利民 大花蕙蘭雜交育種研究[D] 北京：北京林業(yè)大學，2007endprint