枯草芽孢桿菌發(fā)酵蟹殼粉產(chǎn)蛋白酶的研究

劉楊柳，魏東東，劉燕，郭潤芳，于宏偉，孫紀錄

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵蟹殼粉產(chǎn)蛋白酶的研究

劉楊柳，魏東東，劉燕，郭潤芳，于宏偉，孫紀錄*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071001）

以蟹殼粉為培養(yǎng)基的主要成分，研究一株枯草芽孢桿菌UMN-26在其中產(chǎn)蛋白酶的最適培養(yǎng)條件，以期為使用微生物發(fā)酵法脫除蟹殼中的蛋白質(zhì)打下基礎(chǔ)。以發(fā)酵液中的蛋白酶酶活力作為指標，采用單因素試驗和響應(yīng)面法優(yōu)化蟹殼粉培養(yǎng)基的發(fā)酵條件。試驗結(jié)果表明，優(yōu)化的培養(yǎng)基組成為：蟹殼粉濃度5.5%，蔗糖濃度11.81%，初始pH 7.27。最適培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，培養(yǎng)時間108 h。在此條件下，發(fā)酵液的蛋白酶酶活力達到1 465.86 U/mL，為優(yōu)化前的7.86倍，蛋白質(zhì)的脫除率為70.71%。

枯草芽孢桿菌；蛋白酶；蟹殼粉；響應(yīng)面法；脫蛋白質(zhì)率

蟹殼是蟹加工和消費過程中的副產(chǎn)物。每年全世界約產(chǎn)生數(shù)以百萬噸的蟹殼。目前，大部分蟹殼通常作為廢料被丟棄，導(dǎo)致環(huán)境污染及資源浪費。蟹殼的主要成分是礦物質(zhì)（20%～50%）、蛋白質(zhì)（20%～40%）、幾丁質(zhì)（15%～40%）[1]。其中，幾丁質(zhì)（chitin，又稱甲殼素）及其衍生物在食品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，可作為絮凝劑、增稠劑、保鮮劑[2]、食品包裝膜[3]及保健食品[4]等。獲得蟹殼中的幾丁質(zhì)，至少需要經(jīng)過脫蛋白質(zhì)和脫礦物質(zhì)兩個關(guān)鍵步驟。一直以來，脫除蟹殼中的蛋白質(zhì)常采用化學(xué)方法[5]，即以10%的NaOH沸水浴1 h～2 h[6]。后來有所改進[7-8]，如時杰將NaOH質(zhì)量分數(shù)由10%降至2%以減少濃堿使用[9]。但是，這種化學(xué)方法始終存在兩個弊端，一是會引起幾丁質(zhì)的解聚合作用，二是加劇環(huán)境污染。與之相比，生物技術(shù)工藝，如蛋白酶處理[10-12]及產(chǎn)蛋白酶微生物發(fā)酵[13]，因其溫和的工藝條件，近年來受到越來越多的關(guān)注。此外，生物學(xué)方法可得到天然分子量的幾丁質(zhì)，同時對環(huán)境友好。但是，目前，蛋白酶制劑相對較高的價格制約著酶法脫蛋白處理的應(yīng)用，而采用產(chǎn)蛋白酶的微生物直接發(fā)酵蟹殼脫蛋白的報道也較少。

有鑒于此，本文使用響應(yīng)面法，優(yōu)化了一株枯草芽孢桿菌UMN-26在蟹殼粉培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的營養(yǎng)條件，旨在研發(fā)一種生產(chǎn)蛋白酶的廉價培養(yǎng)基。另一方面，發(fā)酵后的蟹殼粉已脫除部分或全部蛋白質(zhì)，可為進一步提取較高品質(zhì)的幾丁質(zhì)打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蟹殼粉：新鮮蟹殼購于河北省黃驊市水產(chǎn)品加工市場，經(jīng)清洗干燥粉碎，過120目篩后制得蟹殼粉，用于配制發(fā)酵培養(yǎng)基。

蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、酪蛋白、酪氨酸、碳酸鈉、三氯乙酸（以上均為分析純）：國藥集團藥業(yè)股份有限公司；福林試劑（2 mol/L）：Biotopped公司。

枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）UMN-26：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院酶學(xué)實驗室篩選并保存的菌種[14-15]。

斜面培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，用于菌種短期保藏。

種子培養(yǎng)基：營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，用于菌種活化。

蟹殼粉培養(yǎng)基：在300 mL三角瓶中加入一定量的蟹殼粉，補充或不補充碳源，加入蒸餾水60 mL配制成蟹殼粉培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)初始pH 7.0。121℃滅菌15 min。用于發(fā)酵產(chǎn)酶。

1.2 儀器與設(shè)備

SP-756P型可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；PHS-3DW型pH計：合肥橋斯儀器設(shè)備有限公司；FA1004型電子天平：上海良平儀器儀表有限公司；HD-850型桌上式潔凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SYQ-DSX-280A型不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠；ZWY-2102C型雙層恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵產(chǎn)酶條件

將枯草芽孢桿菌UMN-26從試管斜面接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，200 r/min，37℃，12 h培養(yǎng)活化。然后以2%接種量接入60 mL蟹殼粉培養(yǎng)基（蟹殼粉濃度3%，初始pH至7.0），37℃，200 r/min，恒溫振蕩培養(yǎng)發(fā)酵5 d。發(fā)酵結(jié)束后，培養(yǎng)物12 000 r/min離心5 min，取上清液作為粗酶液，測定蛋白酶酶活力。

1.3.2 蛋白酶活力測定

依據(jù)福林法測定[16]。

取發(fā)酵液離心的上清液作為粗酶液，適當(dāng)稀釋后，取1.0 mL于10 mL具塞試管中（樣品管2支，空白管1支），37℃水浴預(yù)熱5min。然后樣品管加入1.0 mL同樣預(yù)熱的1%酪蛋白溶液（0.1 mol/L，pH7.2的PBS配制），空白管則加2.0 mL的0.4 mol/L三氯乙酸，準確計時保溫反應(yīng)10 min后，樣品管中迅速、準確地加入2.0mL三氯乙酸，空白管中則加1.0 mL酪蛋白溶液。取出試管靜置10 min，再以9 000 r/min離心5 min。吸取上清液1.0 mL于試管中，依次加入5.0 mL的0.4 mol/L碳酸鈉溶液，1.0 mL稀福林試劑，混勻，40℃水浴顯色20 min。取出迅速冷卻至室溫。

蒸餾水代替上清液作試劑空白對照，調(diào)儀器零點。在波長680 nm下測定樣品空白管和樣品管的吸光度。樣品管與樣品空白管吸光度之差取平均值，通過線性回歸方程計算酪氨酸濃度。

分別取不同濃度（0、20、40、60、80、100 μg/mL）的酪氨酸溶液1 mL，按照上述步驟測定吸光度，以酪氨酸濃度C為橫坐標，吸光度A為縱坐標繪制標準曲線。本試驗中的L-酪氨酸標準曲線如圖1所示，線性回歸方程為：A=0.009 8×C+0.012 4（R2=0.999 3）。

圖1 L-酪氨酸標準曲線Fig.1 The standard curve of L-tyrosine

蛋白酶活力定義：在37℃，pH 7.2條件下，1 mL發(fā)酵液上清液在1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸的蛋白酶量，定義為1個蛋白酶活力單位（U），單位為U/mL。

蛋白酶酶活力計算公式：從標準曲線計算出樣品稀釋液的酶活力，單位為U/mL。樣品的酶活力按式（1）計算：

式中：X為樣品酶活力，U/mL；C為由標準曲線得出的稀釋液酶活力，U/mL；V為所取樣品的體積，mL；4為反應(yīng)試劑的總體積，mL；n為上清液的稀釋倍數(shù)；10為反應(yīng)時間10 min。

1.3.3 蟹殼粉蛋白質(zhì)脫除率

采用凱氏定氮法[17]。

式中：m1為發(fā)酵后蟹殼回收質(zhì)量，g；m2為發(fā)酵前蟹殼質(zhì)量，g；N1為發(fā)酵后蟹殼含氮量，g；N2為發(fā)酵前蟹殼含氮量，g。

1.3.4 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基單因素試驗

1.3.4.1 蟹殼粉濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

分別配制蟹殼粉濃度分別為1%、3%、5%、7%和9%的60 mL蟹殼粉培養(yǎng)基，調(diào)整初始pH 7.0，向其中接種2%活化菌液，于37℃、200 r/min條件下發(fā)酵5 d，研究蟹殼粉濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.4.2 碳源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

于蟹殼粉濃度為5%的蟹殼粉培養(yǎng)基中，分別添加葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖作為碳源補充（5%濃度），調(diào)整初始pH 7.0，向其中接種2%活化菌液，于37℃、200 r/min條件下發(fā)酵5 d，研究不同種類碳源對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.4.3 補充蔗糖濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

于蟹殼粉濃度為5%的蟹殼粉培養(yǎng)基中，分別補充濃度為 1%、3%、5%、7%、9%、11%和 13%的蔗糖，調(diào)整初始pH 7.0，向其中接種2%活化菌液，于37℃、200 r/min條件下發(fā)酵5 d，研究蔗糖濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.4.4 初始pH值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

于蟹殼粉濃度為3%的蟹殼粉培養(yǎng)基（無其他碳源補充）中，調(diào)節(jié)初始 pH 值分別至 6.0、7.0、8.0，自然pH值（9.0）作為對照，向其中接種2%活化菌液，于37℃、200 r/min條件下發(fā)酵5 d，研究pH值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.5 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面法（response surface methodology，RSM）中的 Box-Behnken Designs（BBD）原理設(shè)計和分析試驗。在單因素試驗基礎(chǔ)上，確定試驗自變量及較優(yōu)水平，以蛋白酶酶活力為響應(yīng)值設(shè)計、實施試驗，得到二次方程模型，通過方差分析和模型預(yù)測，尋求最優(yōu)的培養(yǎng)基條件。

1.3.6 培養(yǎng)條件的單因素試驗

1.3.6.1 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基中以2%接種量接入枯草芽孢桿菌UMN-26，分別于32、37、42℃條件下，200 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。研究不同培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.6.2 搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基中以2%接種量接入枯草芽孢桿菌UMN-26，分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為150、200、250 r/min，37℃振蕩培養(yǎng)5 d。研究不同搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響。

1.3.6.3 培養(yǎng)時間對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基中以2%接種量接入枯草芽孢桿菌UMN-26，于37℃，200 r/min條件下振蕩培養(yǎng) 5 d。在培養(yǎng)期間，分別于 12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h 時取樣，12 000 r/min 離心 5 min，取上清液測定蛋白酶活力。以發(fā)酵時間為橫坐標，蛋白酶酶活力為縱坐標，繪制產(chǎn)蛋白酶曲線。

1.3.7 重復(fù)性

每個試驗處理做兩組平行，取平均值進行蛋白酶活力計算；每批試驗做3次重復(fù)，以標準偏差估計試驗誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基單因素試驗

2.1.1 蟹殼粉濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

蟹殼粉濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖2。

圖2 蟹殼粉濃度對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.2 The effect of crab shell powder concentration on proteinase production

由圖2可知，在單純的蟹殼粉培養(yǎng)基中，隨著蟹殼粉濃度增高，UMN-26所產(chǎn)蛋白酶酶活力先增大后減小。當(dāng)蟹殼粉濃度為5%時，發(fā)酵液的蛋白酶酶活力最高，為224.94 U/mL。這表明枯草芽孢桿菌UMN-26能利用蟹殼粉中的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營養(yǎng)成分生長產(chǎn)酶，并且不與蟹殼粉濃度始終呈正相關(guān)。原因可能是由于低濃度的蟹殼粉提供了枯草芽孢桿菌生長產(chǎn)酶的營養(yǎng)物質(zhì)來源，且溶氧量適宜；但蟹殼粉濃度的增高，發(fā)酵液的溶氧量下降，菌體的生長繁殖受到抑制，甚至發(fā)生菌體自溶現(xiàn)象，最終導(dǎo)致產(chǎn)酶的下降[18]。

2.1.2 碳源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

碳源種類對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖3。

在圖3中，補充各種受試碳源后的蟹殼粉培養(yǎng)基的產(chǎn)蛋白酶酶活力均高于純蟹殼粉培養(yǎng)基中蛋白酶活力，表明蟹殼粉中天然的碳源種類（主要為幾丁質(zhì)）不適宜枯草芽孢桿菌生長產(chǎn)酶，需要補充新的碳源來促進UMN-26的生長產(chǎn)酶。圖3還表明，補充蔗糖的蟹殼粉培養(yǎng)基中蛋白酶酶活力最高，達到848 U/mL。這與已報道的事實相符，即蔗糖是枯草芽孢桿菌的產(chǎn)酶最適碳源，原因可能是由于蔗糖對發(fā)酵液pH具有良好的緩沖作用[19]。

圖3 碳源種類對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.3 The effect of different carbon sources on proteinase production

2.1.3 蔗糖濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

蔗糖濃度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖4。

圖4 蔗糖濃度對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.4 The effect of sucrose concentration on proteinase production

由圖4可知，隨著蟹殼粉培養(yǎng)基中補充的蔗糖濃度增高，UMN-26產(chǎn)蛋白酶酶活力開始時迅速增大，在蔗糖濃度達到7%以后，蛋白酶酶活力趨于穩(wěn)定，蔗糖濃度增至13%后，蛋白酶活力反而呈降低趨勢。其原因可能是一定濃度的蔗糖會促進UMN-26的生長和產(chǎn)酶，畢竟天然的蟹殼粉培養(yǎng)基中優(yōu)良碳源較少，但是，蔗糖濃度達到一定程度時也會影響培養(yǎng)基的滲透壓，高滲環(huán)境會抑制UMN-26的生命活動。

2.1.4 初始pH值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

初始pH值對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響見圖5。

圖5 初始pH值對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.5 The effect of initial pH on proteinase production

培養(yǎng)基的pH值是影響微生物生長活動的一個重要理化指標。由圖5可知，在蟹殼粉培養(yǎng)基的自然pH 9.0時，酶活力僅為48.62 U/mL，不適宜UMN-26的生長和產(chǎn)酶。隨著初始pH值向酸性范圍調(diào)整，蛋白酶酶活力隨之增高。結(jié)合先前的研究[15]，UMN-26所產(chǎn)蛋白酶，在pH 6～8的范圍內(nèi)酶活力最高，因此綜合考慮，選擇pH值7為較優(yōu)水平。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基的響應(yīng)面法優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計結(jié)果

依據(jù)單因素試驗結(jié)果，以蟹殼粉濃度A（%）、蔗糖濃度B（%）、初始pH值C為自變量，發(fā)酵液的蛋白酶酶活力Activity（U/mL）為響應(yīng)值，應(yīng)用Design-expert 7.1.6中的Box-Behnken原理設(shè)計試驗，因素水平編碼值見表1，響應(yīng)面試驗設(shè)計方案及結(jié)果如表2所示。

表1 因素水平編碼表Table 1 Coded value of factor levels

表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Project and results of the RSM experiment

續(xù)表2 響應(yīng)面法試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Project and results of the RSM experiment

由表2可知，試驗共設(shè)計實施17個關(guān)鍵點，其中包括析因點12個，零點5個以估計試驗誤差。對以上17組試驗數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，建立Y為目標函數(shù)的多元二次回歸方程（實際值），得到式（3）。

2.2.2 模型方差分析

利用BBD原理對多元二次回歸方程模型式（3）進行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面二次模型方差分析表Table 3 ANOVA for RS quadratic model

由表3方差分析可知，模型的F值為27.47（P=0.000 1＜0.01）極顯著，失擬項 F 值為 3.82（P=0.114 3＞0.05）不顯著。模型的預(yù)測決定系數(shù)R2=0.768 9，預(yù)測范圍小，因此通過手動調(diào)節(jié)，去除交互項BC簡化模型，以提高模型的擬合系數(shù)。簡化后得到二次方程模型見式（4），其校正系數(shù)R2=0.943 9。表明簡化后模型可用于最優(yōu)值的預(yù)測。

簡化后二次模型預(yù)測結(jié)果為蟹殼粉濃度為5.5%，蔗糖濃度11.81%，初始pH值為7.27，預(yù)測蛋白酶活力達到1 460.12 U/mL。根據(jù)實驗室條件，該組合具備可操作性。因此在此條件下進行驗證試驗，測得蛋白酶酶活力為1 458.99 U/mL。

為直觀表現(xiàn)各因素間的交互作用，簡化模型中交互項AB和AC對響應(yīng)值的交互影響以曲面圖和等高線圖來表示（見圖6和圖7）。

圖6 交互項A和B對蛋白酶酶活力的影響Fig.6 The effect on proteinase activity of interaction term A and B

由圖6a曲面圖可以看出，隨著蟹殼粉濃度增高，發(fā)酵液中的蛋白酶活力先增大后降低；隨著蔗糖濃度增高，蛋白酶活力先增大后平緩下降，二者有一定的交互作用，但影響不顯著；與等高線與邊界線的交點越多表明主效應(yīng)顯著，由圖6b等高線圖可以看出，蟹殼粉濃度是主效應(yīng)因子。

圖7 交互項AC對蛋白酶酶活力的影響Fig.7 The effect on proteinase activity of interaction term A and C

由圖7a曲面圖可以看出，隨著初始pH值增大，發(fā)酵液的蛋白酶活力先增大后降低；隨著蔗糖濃度增大，蛋白酶活力先增大后降低，交互作用不顯著；由圖7b等高線圖可知，蟹殼粉濃度對響應(yīng)值蛋白酶活力比pH值的影響顯著，是主效應(yīng)因子。

2.3 發(fā)酵條件對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

2.3.1 溫度對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，研究發(fā)酵條件對蛋白酶產(chǎn)生的影響，繪制溫度與酶活力折線圖8。

由圖8可知，枯草芽孢桿菌UMN-26發(fā)酵蟹殼粉培養(yǎng)基，在37℃時蛋白酶酶活力最大。溫度主要是影響菌體的生長：發(fā)酵溫度低，枯草芽孢桿菌UMN-26的生長受到抑制，蛋白酶活力較低；溫度越高，菌株衰老的速度也加快，酶活力降低[20]。

2.3.2 轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的影響

在優(yōu)化的蟹殼粉培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，研究不同轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌UMN-26產(chǎn)蛋白酶的影響，得到圖9。

圖8 發(fā)酵溫度對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.8 The effect of fermentation temperature on proteinase production

圖9 轉(zhuǎn)速對蛋白酶產(chǎn)生的影響Fig.9 The effect of rotational speed on proteinase production

搖床轉(zhuǎn)速通過改變搖瓶的溶氧量而影響菌體生長和蛋白酶合成[21]。由圖9可知，枯草芽孢桿菌UMN-26產(chǎn)蛋白酶酶活力在200 r/min后趨于穩(wěn)定?？莶菅挎邨U菌是好氧微生物，轉(zhuǎn)速越高，溶氧量越高；但轉(zhuǎn)速超過200 r/min，酶活力增加不大，原因可能是溶氧量已經(jīng)滿足菌體的需求量。因此確定轉(zhuǎn)速為200 r/min。

2.3.3 枯草芽孢桿菌UMN-26產(chǎn)蛋白酶進程

對枯草芽孢桿菌在優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基中的產(chǎn)蛋白酶情況進行分時段檢測，每隔12 h測定蛋白酶活力，觀測120 h，結(jié)果見圖10。

圖10 優(yōu)化后蟹殼粉培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶曲線Fig.10 The proteinase production curve of optimized crab shell powder medium

由圖10可知，在優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基中，蛋白酶活力隨發(fā)酵時間延長而呈升高趨勢，在108 h達到酶活力峰值1 465.86 U/mL，隨后有所降低；發(fā)酵120 h后，蛋白酶酶活力為1 458.99 U/mL。表明優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基為枯草芽孢桿菌UMN-26生長提供了適宜的營養(yǎng)條件，有利于產(chǎn)生蛋白酶。

2.4 蟹殼的蛋白質(zhì)脫除效果

經(jīng)過凱氏定氮法測定發(fā)酵前后蟹殼粉中的蛋白質(zhì)含量，根據(jù)式（2）計算枯草芽孢桿菌發(fā)酵后蛋白質(zhì)的脫除率DP為70.71%，表明枯草芽孢桿菌發(fā)酵蟹殼具有一定的蛋白質(zhì)脫除效果。

3 結(jié)論與討論

本文研制蟹殼粉培養(yǎng)基以培養(yǎng)枯草芽孢桿菌UMN-26產(chǎn)生蛋白酶，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化后，得到蟹殼粉培養(yǎng)基的組成條件：蟹殼粉濃度5.5%，添加蔗糖濃度11.81%，初始pH 7.27。在此培養(yǎng)基中，優(yōu)化發(fā)酵條件為：溫度37℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，枯草芽孢桿菌在108 h產(chǎn)蛋白酶酶活力達到1 465.86 U/mL，是未優(yōu)化的蟹殼粉培養(yǎng)基中酶活力（186.33 U/mL）的7.86倍。最終蛋白質(zhì)脫除率為70.71%。這表明優(yōu)化后的蟹殼粉培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶活力大大提高，對蟹殼的蛋白質(zhì)脫除有一定效果，優(yōu)化方案有效。

蟹殼是蟹產(chǎn)品加工中的廢棄物，蔗糖是來源充足且普遍的碳源之一，其成本相比牛肉膏、蛋白胨等原料成本低，因此本試驗得到的將是一種價格低廉，綠色環(huán)保的產(chǎn)蛋白酶的蟹殼粉培養(yǎng)基。

此外，在以產(chǎn)蛋白酶的微生物發(fā)酵蝦蟹殼脫除蛋白質(zhì)的研究中，采用的菌種主要有粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）[22-23]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas Aeruginosa）[24-25]，芽孢桿菌（Bacillus）[26-27]，紫紅曲霉菌（Monascus purpureus）[28]等，發(fā)酵周期 3 d～7 d，在發(fā)酵后蛋白酶活力較高的培養(yǎng)基中，蝦蟹殼蛋白質(zhì)的脫除效率能達到80%以上。Oh Y等研究了銅綠假單胞菌K-187高產(chǎn)蛋白酶的優(yōu)化培養(yǎng)基，最高蛋白酶活力高達 21.2 U/mL，是優(yōu)化前（2.2 U/mL）的 10倍[29]。LIU 等在不補充葡萄糖的蝦頭培養(yǎng)基中，接種10%枯草芽孢桿菌B.21886，于180 r/min，30℃培養(yǎng)96 h，發(fā)現(xiàn)24 h時達到產(chǎn)酶高峰（229.7±10.0）U/mL，而在補充2.5%的葡萄糖時，培養(yǎng)基產(chǎn)蛋白酶量達到700 U/mL，表明優(yōu)化前后對蛋白酶產(chǎn)生量有較大影響[30]。而本文的研究結(jié)果也證實了這一點。更進一步，OLFA等研究用響應(yīng)面法對短小芽孢桿菌A1發(fā)酵蝦殼提取幾丁質(zhì)的進行條件了優(yōu)化，發(fā)酵6 d后脫除了94%蛋白質(zhì)[28]。由此可見，使用產(chǎn)蛋白酶的微生物發(fā)酵蟹殼粉來脫除其中的蛋白質(zhì)，是一種富有潛力的綠色生物技術(shù)。使用本研究中的枯草芽孢桿菌UMN-26脫除蟹殼粉中的蛋白質(zhì)，還需要進一步對發(fā)酵的環(huán)境條件進一步優(yōu)化，以提高蛋白質(zhì)的脫除率，并對發(fā)酵液中的蟹殼粉殘渣進行詳細的成分分析。

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Research on Fermentation of Crab Powder for Proteinase Production by Bacillus subtilis

LIU Yang-liu，WEI Dong-dong，LIU Yan，GUO Run-fang，YU Hong-wei，SUN Ji-lu*
（College of Food Science and Technology，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，Hebei，China）

The optimal cultural conditions for protease production by Bacillus subtilis UMN-26 with the crab shell powder as the main composition of culture medium was studied，which may lay the foundation for deproteinization of crab cells with microbiological fermentation method.Single factor tests and response surface methodology were adopted to optimize the fermentation conditions of the crab shell powder culture medium，with the proteinase activity of the fermentation supernatant as an index.The results showed that the optimized conditions were：crab shell powder concentration was 5.5%，sucrose concentration was 11.81%and initial pH 7.27.And optimized fermentation conditions were：cultural temperature was 37℃，rotational speed was 200 r/min and time was 108 h.The protease enzyme activity of fermentation supernatant reached 1 465.86 U/mL，7.86 times than the former，and the rate of deproteinization was 70.71%.

Bacillussubtilis；proteinase；crabpowder；responsesurfacemethodology；deproteinizationefficiency

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.035

河北省科學(xué)技術(shù)廳項目（15273204D）

劉楊柳（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：食品工程。

*通信作者：孫紀錄（1972—），男，教授，博士。

2017-05-11