疊氮化鈉對(duì)綠豆種子和幼苗生長(zhǎng)的誘變效應(yīng)

溫日宇，劉建霞，宋亞靜，劉支平

疊氮化鈉對(duì)綠豆種子和幼苗生長(zhǎng)的誘變效應(yīng)

溫日宇1，劉建霞2，宋亞靜2，劉支平3

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所，山西忻州034000；2.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西大同037009；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所，山西大同037008）

以晉綠9號(hào)為試驗(yàn)材料，測(cè)定不同濃度疊氮化鈉對(duì)綠豆誘變不同時(shí)間種子的發(fā)芽率、幼苗鮮質(zhì)量、根長(zhǎng)的改變情況，探究疊氮化鈉對(duì)綠豆種子和幼苗生長(zhǎng)的誘變效應(yīng)。結(jié)果表明，疊氮化鈉的濃度16 mmol/L、誘變時(shí)長(zhǎng)6 h為最佳誘變條件；在低濃度溶液誘變下，隨著濃度的不斷增加，誘變效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，誘變濃度為15 mmol/L或誘變時(shí)間小于6 h時(shí)，可提高其根長(zhǎng)和幼苗鮮質(zhì)量；疊氮化鈉的濃度大于17 mmol/L或誘變時(shí)間超過(guò)6 h時(shí)，疊氮化鈉誘變能夠降低種子的萌發(fā)勢(shì)，甚至致其死亡，幼苗及其根長(zhǎng)也低于對(duì)照組。

綠豆；疊氮化鈉；生長(zhǎng)指標(biāo)

綠豆（Vigna radiata（Linn.）Wilczek.），屬豆科作物，別名青小豆、菉豆、植豆等，在我國(guó)已有超過(guò)2 000 a的種植歷史。其原產(chǎn)于印度、緬甸地區(qū)，目前普遍種植于東南亞各國(guó)，在非洲、歐洲、美洲也有少量種植。在我國(guó)，綠豆的種植面積超過(guò)70.8萬(wàn)hm2，是僅次于印度的綠豆種植大國(guó)[1-3]。綠豆作為一種藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值特別高的作物，有著豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，是人們理想的營(yíng)養(yǎng)保健食品。

改革開放以來(lái)，我國(guó)人民生活水平不斷提高，膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生巨大變化，對(duì)于食品的保健作用愈加重視，再加上綠豆在食品工業(yè)、釀造工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)上的廣泛應(yīng)用，國(guó)內(nèi)對(duì)綠豆的需求持續(xù)增長(zhǎng)。但由于我國(guó)長(zhǎng)期種植綠豆，一些名優(yōu)品種退化、混雜現(xiàn)象嚴(yán)重，而綠豆遺傳研究落后，近年來(lái)新品種選育進(jìn)程緩慢，極大地制約了綠豆產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-6]。因此，對(duì)綠豆種質(zhì)創(chuàng)新，提高綠豆的產(chǎn)量、改善綠豆的品質(zhì)顯得尤為重要。

應(yīng)對(duì)綠豆生長(zhǎng)的惡劣環(huán)境，國(guó)內(nèi)外進(jìn)行過(guò)一系列改變綠豆抗逆性和抗病性的研究，而對(duì)于提高綠豆產(chǎn)量和改善綠豆品質(zhì)所進(jìn)行的試驗(yàn)研究中，雖然通過(guò)雜交育種和轉(zhuǎn)基因技術(shù)已獲得一些成效，但雜交育種的可遺傳性較差和轉(zhuǎn)基因的安全問(wèn)題始終難以解決[7-10]。我國(guó)曾利用返回式衛(wèi)星及氣球做了空間誘變育種的嘗試，但在綠豆方面收效甚微，而且空間誘變的成本昂貴，不適于長(zhǎng)期使用[11-13]。相比于雜交育種，誘變育種周期短，效果明顯且能獲得較穩(wěn)定的優(yōu)良性狀。在諸多化學(xué)試劑中，疊氮化鈉（NaN3）因其效率高、低毒、價(jià)格便宜、使用安全等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于育種方面。其誘變?cè)頌閇12-13]：NaN3溶液在pH為3（等電點(diǎn)pH＝4.18）時(shí)可以生成最大量的HN3分子，容易通過(guò)膜滲透入細(xì)胞，HN3分子和DNA作用發(fā)生點(diǎn)突變，使其堿基置換，DNA單鏈斷裂，從而影響DNA合成蛋白質(zhì)，以達(dá)到影響酶活性的目的。疊氮化鈉的誘變只能在DNA復(fù)制時(shí)才能發(fā)揮作用，所以種子在M1時(shí)期開始時(shí)用NaN3溶液進(jìn)行處理，對(duì)DNA合成的胚胎進(jìn)行預(yù)處理[14-18]。

目前，使用疊氮化鈉對(duì)綠豆種子進(jìn)行誘變育種鮮有研究。本試驗(yàn)以晉綠9號(hào)綠豆種子為試驗(yàn)材料，疊氮化鈉作為誘變劑，探究綠豆在疊氮化鈉處理后種子萌發(fā)率、根長(zhǎng)和幼苗鮮質(zhì)量的變化，以期找出對(duì)綠豆種子誘變效果最好的誘變濃度和時(shí)間，獲得可遺傳的優(yōu)良性狀，提高綠豆產(chǎn)量和品質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料為晉綠9號(hào)綠豆種子，由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高寒區(qū)作物研究所提供；試驗(yàn)所用的化學(xué)誘變?cè)噭榀B氮化鈉（NaN3）。

1.2 方法

取1 250粒顆粒飽滿、大小均一的晉綠9號(hào)綠豆種子置于500 mL大燒杯中，用75%的乙醇將種子表面進(jìn)行初步消毒，后用蒸餾水沖洗3次。用0.2%的HgCl2溶液消毒12 min，后用雙蒸水清洗干凈。取濃度為 15，16，17，18，19，20 mmol/L的疊氮化鈉（各濃度取30 mL）于6個(gè)50 mL的錐形瓶中，對(duì)照組用清水處理，再將消毒處理的綠豆種子分別取50粒放于錐形瓶中進(jìn)行誘變處理。設(shè)置4組，誘變時(shí)間為5.0，5.5，6.0，6.5 h。將綠豆種子分別擺放進(jìn)滅菌后（培養(yǎng)皿預(yù)先用LS-35LJ型立式壓力蒸汽滅菌器121℃下滅菌30 min）的5組（共25個(gè)）直徑為8.5 cm的培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿保持干燥），各培養(yǎng)皿內(nèi)墊2層大小同樣為直徑8.5 cm的濾紙（預(yù)先噴灑適量蒸餾水潤(rùn)濕），每個(gè)培養(yǎng)皿放50顆種子，將種子擺放整齊，互相之間不要接觸，加蓋，放置于自然光照下，溫度為室溫，每日加入適量的清水，以保持濾紙的濕潤(rùn)，保證種子有足夠的水分發(fā)芽。每天定時(shí)觀察記錄綠豆種子的發(fā)芽數(shù)，計(jì)算種子的發(fā)芽率。待綠豆種子的芽長(zhǎng)超過(guò)自身長(zhǎng)度后轉(zhuǎn)培在花盆中，置于YTP-1250型高效組織培養(yǎng)架上，使其自然生長(zhǎng)至二葉一心時(shí)，進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 種子發(fā)芽率的測(cè)定 培養(yǎng)第1天開始至第7天計(jì)算各培養(yǎng)皿中種子的發(fā)芽率。

1.3.2 幼苗根長(zhǎng)的測(cè)定 當(dāng)幼苗生長(zhǎng)至2個(gè)葉片時(shí)，每種幼苗各取5株，用精密不銹鋼尺測(cè)量幼苗根（根據(jù)最長(zhǎng)根的長(zhǎng)度測(cè)定）的生長(zhǎng)長(zhǎng)度，取平均值作為最終數(shù)值。

1.3.3 幼苗鮮質(zhì)量的測(cè)定 當(dāng)幼苗生長(zhǎng)到2個(gè)葉片時(shí)，每種濃度各選5株長(zhǎng)勢(shì)較好、大小均勻的幼苗，小心地從花盆中取出，根部先用蒸餾水沖洗，然后用去離子水沖洗，用吸收紙吸干表面水分，用J111102型電子天平測(cè)量5株幼苗的鮮質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法進(jìn)行處理，最終數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。種子發(fā)芽率采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；綠豆幼苗鮮質(zhì)量、幼苗根長(zhǎng)運(yùn)用Excel做出標(biāo)準(zhǔn)誤差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 疊氮化鈉誘變對(duì)綠豆種子萌發(fā)率的影響

從表 1 可以看出，用濃度為 15，16，17，18，19，20 mmol/L的疊氮化鈉分別對(duì)綠豆種子進(jìn)行4個(gè)時(shí)間（5.0，5.5，6.0，6.5 h）處理，隨著誘變濃度的增加，綠豆種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率都呈遞減趨勢(shì)，除濃度為17，18 mmol/L的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率差異不顯著外，其他幾個(gè)濃度差異都達(dá)顯著水平。說(shuō)明在該誘變條件下疊氮化鈉對(duì)綠豆種子的萌發(fā)均有顯著影響。

當(dāng)誘變時(shí)間為6 h、疊氮化鈉濃度為16 mmol/L時(shí)，綠豆種子的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率分別為52%和51.32%，均接近50%，因此，本研究認(rèn)為，疊氮化鈉濃度16 mmol/L、誘變時(shí)間6 h為最佳誘變條件。

當(dāng)誘變時(shí)間為6.5 h時(shí)，疊氮化鈉對(duì)綠豆種子的萌發(fā)率有顯著性降低；隨著疊氮化鈉濃度的增加，致死效應(yīng)逐漸增強(qiáng)，當(dāng)疊氮化鈉的濃度為20 mmol/L時(shí)，綠豆種子的萌發(fā)率為2%；濃度為16，17，18，19 mmol/L時(shí)，綠豆種子的發(fā)芽率分別為34%，24%，12%和6%，對(duì)照的萌發(fā)率達(dá)到100%。

種子萌發(fā)率的試驗(yàn)結(jié)果表明，采用不同濃度的疊氮化鈉對(duì)綠豆種子進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的誘變，對(duì)其萌 發(fā)率有不同的影響。

表1 不同濃度疊氮化鈉溶液處理下綠豆的發(fā)芽率和相對(duì)發(fā)芽率

2.2 疊氮化鈉誘變對(duì)綠豆根系生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，用不同濃度的疊氮化鈉進(jìn)行不同時(shí)長(zhǎng)的誘變對(duì)綠豆根系生長(zhǎng)有不同的影響。其中，不同濃度疊氮化鈉對(duì)綠豆種子處理5 h時(shí)，疊氮化鈉濃度為15mmol/L時(shí)幼苗根系最長(zhǎng)，其他濃度的根系較短，但均比對(duì)照明顯變長(zhǎng)。疊氮化鈉對(duì)綠豆種子處理5.5 h時(shí)，15 mmol/L濃度處理的幼苗根長(zhǎng)達(dá)到最大值，濃度不超過(guò)16 mmol/L時(shí)，對(duì)幼苗的根長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用；濃度大于17 mmol/L時(shí)，根長(zhǎng)有明顯變短的跡象。疊氮化鈉處理綠豆種子6 h時(shí)，濃度不超過(guò)16 mmol/L時(shí)對(duì)根長(zhǎng)有促進(jìn)作用，濃度為15 mmol/L時(shí)根長(zhǎng)達(dá)到最大值；濃度大于16 mmol/L時(shí)，幼苗的根長(zhǎng)表現(xiàn)出明顯的抑制效果。疊氮化鈉處理綠豆種子6.5 h時(shí)，濃度不超過(guò)16 mmol/L時(shí)會(huì)對(duì)根系有促進(jìn)作用，但是效果不明顯；當(dāng)濃度大于16 mmol/L時(shí)，疊氮化鈉的誘變使得綠豆幼苗的根系無(wú)法正常生長(zhǎng)。

2.3 疊氮化鈉誘變對(duì)綠豆幼苗鮮質(zhì)量的影響

試驗(yàn)結(jié)果表明，疊氮化鈉誘變對(duì)綠豆幼苗鮮質(zhì)量的影響也表現(xiàn)出明顯的誘變效應(yīng)。由圖2可知，低濃度短時(shí)間處理會(huì)使幼苗的鮮質(zhì)量明顯增加，且會(huì)有部分葉片發(fā)黃；高濃度下或者長(zhǎng)時(shí)間誘變下，幼苗的鮮質(zhì)量明顯降低，部分幼苗由于疊氮化鈉的誘變會(huì)出現(xiàn)矮化現(xiàn)象。

在用疊氮化鈉對(duì)綠豆種子誘變5 h時(shí)，濃度為17 mmol/L時(shí)會(huì)顯著增加幼苗的鮮質(zhì)量，當(dāng)疊氮化鈉的濃度大于17 mmol/L時(shí)，幼苗的鮮質(zhì)量較對(duì)照逐漸降低；在用疊氮化鈉誘變5.5 h時(shí)，濃度為15～17 mmol/L時(shí)，誘變會(huì)使幼苗的鮮質(zhì)量明顯增加，濃度大于17 mmol/L時(shí)，誘變會(huì)使幼苗的鮮質(zhì)量較對(duì)照降低；在用疊氮化鈉對(duì)綠豆種子誘變6 h時(shí)，濃度為17 mmol/L時(shí)，誘變會(huì)使幼苗的鮮質(zhì)量增加，但不明顯，其他濃度誘變會(huì)使幼苗的鮮質(zhì)量降低；在用疊氮化鈉誘變6.5 h時(shí)，本試驗(yàn)中所有濃度的誘變都會(huì)使得幼苗的鮮質(zhì)量明顯減小。

3 討論與結(jié)論

綠豆是一種極易發(fā)芽的豆科植物，在室溫下置于清水中8 h便能完成發(fā)芽。本試驗(yàn)用毒性較低的疊氮化鈉對(duì)綠豆種子予以不同時(shí)長(zhǎng)的誘變處理，來(lái)探究綠豆種子發(fā)芽的變化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨疊氮化鈉濃度增加，若處理時(shí)間長(zhǎng)短適宜，對(duì)種子的發(fā)芽有促進(jìn)作用；若疊氮化鈉的濃度高出一定范圍或誘變時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，種子的發(fā)芽率會(huì)大幅下降，甚至有可能全部致死，說(shuō)明綠豆種子DNA受到疊氮化鈉的嚴(yán)重?fù)p壞。本試驗(yàn)中，疊氮化鈉對(duì)種子發(fā)芽率、綠豆幼苗和根生長(zhǎng)的影響顯示出顯著的濃度和時(shí)間效應(yīng)。在低濃度的疊氮化鈉誘變下綠豆種子初期萌發(fā)勢(shì)能加快，綠豆幼苗和根系早期生長(zhǎng)也得到提升，疊氮化鈉對(duì)綠豆根伸長(zhǎng)率和幼苗鮮質(zhì)量也有顯著的改善作用。疊氮化鈉對(duì)綠豆根伸長(zhǎng)率和幼苗鮮質(zhì)量有顯著的改善作用。當(dāng)疊氮化鈉的濃度低于17 mmol/L時(shí)，處理時(shí)間少于6 h時(shí)，不會(huì)破壞種子的發(fā)芽率，一旦高于6 h，疊氮化鈉會(huì)對(duì)綠豆種子造成損害，使綠豆的發(fā)芽率顯著下降，綠豆發(fā)芽率低于10%，甚至不發(fā)芽，幼苗和根系也不能正常生長(zhǎng)。

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Mutagenic Effects of Sodium Azide on the Growth of Mung Bean Seeds and Seedlings

WENRiyu1，LIUJianxia2，SONGYajing2，LIUZhiping3
（1.Instituteof Maize，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Xinzhou 034000，China；2.Collegeof Life Science，Datong University，Datong037009，China；3.Instituteof the Crops in High Latitudeamp;Cold Climate Area，Shanxi Academy of Agricultural Sciences，Datong 037008，China）

In this study,taking Jinlü 9 as the test material,the effects of different concentrations of sodium azide on the germination rate,fresh quality and root length of seedlings at different time were investigated.The results showed that the optimal right condition was that the concentration of sodium azide was 16 mmol/L and the mutation time was 6 h.In the low concentration of solution mutagenesis,with the increase of concentration,the mutagenic effect gradually increased.At the concentration of 15 mmol/L,the germination potential,root length and fresh quality of seedlings were significantly increased when the mutagenesis time was less than 6 h.When the concentration of sodiumazide wasmore than 17 mmol/L or themutation time was more than 6 h,sodium azide had the tendency to reduce the germination potential of seeds,and even the lethal would not germinate,and the seedlings and root length were lower than the control group.

mungbean;sodiumazide;growth index

S522

A

1002-2481（2017）12-1933-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.12.09

2017-07-25

山西省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（201603D221004-5）；山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140311005-3）

溫日宇（1976-），男，山西朔州人，副研究員，碩士，主要從事作物種質(zhì)資源開發(fā)與利用研究工作。