食管鱗狀細胞癌組織中VRK1及BANF1的表達及其意義*

王婷婷，裴露，李晉，朱峰，耿杰，李雨晴，劉紅春,3

(1. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450002；3.鄭州大學醫(yī)學檢驗系，鄭州 450052)

·研究生園地·

食管鱗狀細胞癌組織中VRK1及BANF1的表達及其意義*

王婷婷1，裴露2，李晉1，朱峰1，耿杰1，李雨晴1，劉紅春1,3

(1. 鄭州大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450052；2.河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院檢驗科，鄭州 450002；3.鄭州大學醫(yī)學檢驗系，鄭州 450052)

目的探討牛痘病毒相關性激酶1(VRK1)及屏障自整合因子1(BANF1)在食管鱗狀細胞癌(ESCC)組織中的表達及其意義。方法免疫組化染色法檢測120例ESCC患者癌組織及配對的癌旁組織中VRK1和BANF1蛋白的表達水平;RT-qPCR法檢測VRK1和BANF1 mRNA在ESCC癌組織和配對的癌旁組織中的表達水平;并分析其與ESCC患者臨床病理參數(shù)間的關系。結果免疫組化染色結果表明，VRK1和BANF1蛋白在癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為70.815，60.286，P均<0.05)，且兩者的表達水平與TNM分期和分化程度差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)，而與不同性別、年齡和有無淋巴結轉移的差異無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。RT-qPCR結果顯示，VRK1和BANF1 mRNA在癌組織中的表達水平明顯高于癌旁組織(0.88±0.09 vs 0.59± 0.08，0.78±0.08 vs 0.41±0.05)，差異均有統(tǒng)計學意義(t分別為1.95,1.99，P均<0.05)。結論VRK1和BANF1在ESCC患者組織中呈過表達，且與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關。

食管鱗狀細胞癌；牛痘病毒相關性激酶1；屏障自整合因子1

牛痘病毒相關性激酶1(vaccinia-related kinase 1，VRK1)是絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)激酶家族的成員之一[1]。VRK1基因在人體組織中廣泛表達，并在分裂旺盛的細胞(如睪丸細胞，胸腺細胞，胎肝細胞和癌細胞)中的表達水平較高。研究表明，VRK1蛋白激酶在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中發(fā)揮著重要作用，其能調控正?；驉盒约毎脑鲋澈痛婊頪1-3]。BAF蛋白由屏障自整合因子1(barrier to autointegration factor 1，BANF1)基因編碼，是有絲分裂核重組[4]、調節(jié)逆轉錄病毒的整合前復合體穩(wěn)定性[5]、調節(jié)轉錄功能的必需蛋白質。然而VRK1和BANF1在食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)組織中表達的研究報道國內少見。本研究通過免疫組化和RT-qPCR檢測VRK1和BANF1蛋白質及mRNA在ESCC癌組織及癌旁組織中的表達水平,分析其與臨床病理參數(shù)間的關系,旨在探討兩者在ESCC中的作用，為臨床的治療提供新的思路。

1 對象與方法

1.1研究對象 收集2015年9月至2016年11月鄭州大學第一附屬醫(yī)院胸外科手術切除的ESCC癌組織及配對的癌旁組織(距腫瘤邊緣5 cm以上)120例。入選標準：(1)病理組織學確診為ESCC癌；(2)首次發(fā)現(xiàn)，且以往未接受手術和放化療治療；(3)經系統(tǒng)檢查后無心臟、肺部疾病和糖尿病等慢性疾病史，無肺結核、肝炎等傳染病史。排除嚴重感染、自身免疫性疾病、肝腎功能不全及其他腫瘤等相關疾病。ESCC患者的臨床病理參數(shù)見表1。本研究經鄭州大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準，患者知情同意。

1.2主要試劑及儀器 兔抗人VRK1多克隆抗體、兔抗人BANF1多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的小鼠抗兔二抗(貨號分別為bs-7706R，bs-12571R，bs-0295M，北京博奧森公司)；Trizol試劑、PrimeScript逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；引物、山羊血清、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)、乙醇、雙蒸水、蘇木素染液、DAB顯色液、DEPC水以及一次性耗材(上海生工公司)。5417R臺式高速冷凍離心機(德國Eppdendorf公司)，安捷倫3005P實時熒光定量PCR儀(美國Agilent公司)。

1.3免疫組織化學染色 分別將石蠟包埋的食管癌組織及癌旁組織切為5 μm的薄片，然后黏附在涂層顯微鏡載玻片上，50 ℃烤箱中烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇(100%、99%、95%、90%、80%、70%)依次脫水。經3%過氧化氫溫育10 min消除內源性過氧化物酶。將切片置于0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中加熱20 min進行抗原修復，室溫冷卻后用PBS沖洗3次。切片用5%正常山羊血清(1∶10稀釋)室溫封閉30 min。滴加50 μL兔抗人VRK1多

克隆抗體(1∶200稀釋)和50 μL兔抗人BANF1多克隆抗體(1∶200稀釋)，4 ℃過夜，PBS洗滌3次，每次5 min。加入HRP標記的小鼠抗兔二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃溫育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min。DAB顯色液顯色5min。自來水沖洗、蘇木素復染、梯度乙醇脫水、二甲苯脫水及中性樹脂固定。陰性對照以兔正常血清(1∶200稀釋)代替一抗，空白對照以PBS代替一抗，陽性對照由抗體公司提供，其余步驟相同。在光學顯微鏡高倍鏡下觀察100個細胞并根據(jù)陽性細胞數(shù)占該類細胞總數(shù)的百分比將染色面積依次計為0(1%)、1(0%～30%)、2(31%～60%)和3(>60%)分；染色強度按顏色由淺入深依次計為0分(不著色)、1分(淡黃色)、2分(棕黃色)及3分(棕褐色)。計算染色面積和染色強度的積，0～2分為陰性，3～9分為陽性。所有染色標本均由3名研究者分別進行判斷，結果不一致時共同觀察確定。

1.4RNA提取及逆轉錄反應 食管癌組織和癌旁組織各取50 mg，用Trizol試劑提取總RNA。用核酸定量分析儀測定RNA的純度和濃度，選取吸光度(A260/280 nm)比值在1.8～2.0的總RNA樣本用于后續(xù)實驗。按照PrimeScript RT試劑盒說明書操作將RNA反轉錄為cDNA。cDNA樣本置-20 ℃保存。

1.5引物設計及實時定量PCR(RT-qPCR) 根據(jù)GenBank中VRK1、BANF1和GAPDH的序列號(分別為NM_003384.2；NM_003860.3；NM_001256799.2)，用Primer Premier 5.0軟件設計引物。引物由上海生工公司合成。VRK1上游引物序列：5′-CTACCAA

CGAGCTGCAAAACC-3′，下游引物序列5′-TCACTCC

CAAAGCGATCCATTA-3′，產物大小為153 bp，退火溫度60 ℃。BANF1上游引物序列：5′-TGGCTGAAA

GACACTTGTGG-3′，下游引物序列：5′-CACTCTCGAA

GGCATCCGAAG-3′，產物大小為68 bp，退火溫度58 ℃。GAPDH上游引物序列：5′-GGAGCGAGATCCCT

CCAAAAT-3′，下游引物序列：5′-GGCTGTTGTCATA

CTTCTCATGG-3′，產物大小為197 bp，退火溫度60℃。制備反應混合物：以1 μL cDNA為模板進行擴增，反應體系包括SYBR Green 12 μL，ROX 校正染料0.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，ddH2O補至20 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性 5 min；95 ℃ 3 s，60 ℃(VRK1、GAPDH)/58 ℃(BANF1)30 s，72 ℃ 15 s，85 ℃ 15 s，共40個循環(huán)。在85 ℃下收集熒光信號，用MxPro 3005軟件進行熔解曲線分析。實驗重復3次。采用2-△△Ct法計算待測基因的相對表達量。

2 結果

2.1免疫組化染色檢測VRK1和BANF1蛋白在組織切片中的定位及表達 高倍鏡下，VRK1主要定位于細胞核，BANF1染色定位主要定位于細胞核，少量定位于細胞質(圖1)。ESCC患者癌組織中 VRK1和BANF1蛋白的陽性率分別為80.8%(97/120)和77.5%(93/120)，明顯高于癌旁組織[26.6%(32/120)，24.1%(29/120)]，差異有統(tǒng)計學意義(χ2分別為70.815，68.286，P均<0.05)。

2.2VRK1和BANF1蛋白的表達與ESCC患者臨床病理參數(shù)的關系 VRK1和BANF1蛋白的表達與ESCC患者性別、年齡以及有無淋巴結轉移差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，而與腫瘤的臨床分期和分化程度有關(P<0.05)。見表1。

2.3VRK1和BANF1 mRNA在ESCC患者癌組織和癌旁組織中的表達 RT-qPCR結果表明，癌組織中VRK1 mRNA的表達水平明顯高于癌旁組織(0.88±0.09 vs 0.59± 0.08)，差異有統(tǒng)計學意義(t=1.95，P=0.044)；癌組織中BANF1 mRNA的表達水平亦高于癌旁組織(0.78±0.08 vs 0.41±0.05)，差異有統(tǒng)計學意義(t=1.99，P=0.040)。

3 討論

VRK1是細胞周期蛋白D1的一個早期應答基因，其可以通過磷酸化修飾的形式參與多種細胞生理活動，如細胞周期進程、染色體凝聚、核膜包膜的分解和重組以及DNA損傷反應等[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，VRK1可能在乳腺癌[7]、肝細胞癌和結直腸癌[8]等多種腫瘤中發(fā)揮著促癌作用。Del等[8]和Huang等[9]的研究均發(fā)現(xiàn)VRK1在原發(fā)性肝細胞癌(HCC)組織和細胞系中呈高表達，并證實其與美國腫瘤研究聯(lián)合委員會(AJCC)第8版癌癥分期系統(tǒng)中的HCC肝癌分級和不良預后密切相關。本研究通過實時熒光定量PCR法檢測了食管鱗癌組織及配對的癌旁組織中VRK1 mRNA的表達水平，發(fā)現(xiàn)VRK1在癌組織中過表達，與上述研究結果基本一致。本研究通過免疫組化染色法檢測120例患者組織切片中VRK1蛋白的表達，結果顯示VRK1在低分化組中的陽性率明顯高于中、高分化組，且與腫瘤的TNM分期有關，表明其與ESCC的發(fā)生、發(fā)展有關，同時也驗證了VRK1的高表達與腫瘤的惡性程度密切相關。

注：A，VRK1在癌旁組織中表達陰性；B，VRK1在癌組織中表達陽性；C，BANF1在癌旁組織中表達陰性；D，BANF1在癌組織中表達陽性。

圖1 免疫組織化學染色檢測VRK1和BANF1蛋白的表達(×100)

BANF1編碼的BAF蛋白可以與雙鏈DNA非特異性結合，并且可以結合核膜上含有LEM結構域的蛋白質，從而促進細胞核重組并將染色質召集到核外周。核纖層蛋白lamin-A/C，LAP2α和BAF蛋白在有絲分裂過程中組成蛋白質復合物能夠調節(jié)有絲分裂紡錘體的組裝和定位[10]。研究表明，BAF蛋白是VRK1蛋白激酶的高親和力底物。Ser4上BAF的磷酸化可解除其結合DNA的能力并降低其對LEM結構域的親和力，使DNA與核包膜之間連接斷裂從而維持細胞周期進程的正常進行[11-12]。本研究亦通過免疫組化染色和RT-qPCR檢測了ESCC組織中BANF1 mRNA及蛋白質的表達水平，結果顯示其在癌組織中的表達水平也明顯高于癌旁組織，且與腫瘤的TNM分期和分化程度有關。以上結果證實，BAF蛋白可能通過調節(jié)DNA與核周蛋白的結合以及紡錘絲的組裝和定位，使細胞有絲分裂過程異常進行，從而促進腫瘤細胞的發(fā)生與發(fā)展。

綜上所述，本實驗證實VRK1和BANF1均在ESCC患者癌組織中過表達，并與分化程度和TNM分期有關，且BAF蛋白可被VRK1蛋白激酶磷酸化?；诖?，我們猜測在ESCC的發(fā)生和發(fā)展過程中，VRK1和BANF1可能直接或間接地發(fā)揮著協(xié)同作用，但兩者的相互作用機制有待進一步研究。此外，本實驗中并未發(fā)現(xiàn)二者與淋巴結轉移情況有關(P>0.05)，原因可能與標本選擇偏倚以及標本量不足有關。今后我們將擴大樣本量，對相關實驗結論進行進一步驗證。

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2017-07-03)

(本文編輯：許曉蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.15

河南省科技廳攻關項目(172102310028)。

王婷婷，1992年生，女，碩士研究生，主要從事腫瘤分子診斷研究。

劉紅春，教授，E-mail：xingyunerliu@163.com。

R735.1

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