長鏈非編碼RNA ZFAS1在非小細(xì)胞肺癌患者組織中表達(dá)及作用*

張徐，臧雪燕，顧建美，張鵬，梁煒，陳京燕，潘磊，錢暉，許文榮

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.南通市腫瘤醫(yī)院，江蘇南通 226000)

·腫瘤與微環(huán)境檢測·

長鏈非編碼RNAZFAS1在非小細(xì)胞肺癌患者組織中表達(dá)及作用*

張徐1，臧雪燕1，顧建美2，張鵬1，梁煒1，陳京燕1，潘磊1，錢暉1，許文榮1

(1.江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇省檢驗醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.南通市腫瘤醫(yī)院，江蘇南通 226000)

目的檢測非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者癌組織中鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1(zinc finger antisense 1,ZFAS1)表達(dá)水平，探討ZFAS1在NSCLC進(jìn)展中的生物學(xué)作用。方法實時熒光定量RT-PCR檢測ZFAS1在NSCLC患者癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平。RNA干擾ZFAS1在A549細(xì)胞中表達(dá)，細(xì)胞計數(shù)和克隆形成實驗檢測細(xì)胞增殖情況，流式分析檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡，Transwell遷移和基質(zhì)膠侵襲實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，實時熒光定量RT-PCR檢測CyclinD1、Bcl2、N-cadherin、ZEB1、Slug和Twist基因表達(dá)水平變化。結(jié)果ZFAS1在NSCLC患者癌組織中的平均表達(dá)水平[0.01(0.002，0.054)]較癌旁組織[0.002 (0.001，0.012)]明顯升高(Z=-2.638,P<0.01)。ZFAS1基因敲減后，A549細(xì)胞增殖能力明顯減弱(P<0.01)；A549細(xì)胞周期G1期比例升高，S期比例下降(P<0.01)；A549細(xì)胞凋亡比例明顯增加(P<0.01)；A549細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯下降(P均<0.01)；A549細(xì)胞中CyclinD1、Bcl2、N-cadherin、ZEB1、Slug和Twist基因表達(dá)水平均降低(P均<0.05)。結(jié)論ZFAS1在NSCLC患者癌組織中呈高表達(dá)。ZFAS1基因敲減誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、凋亡和抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)，減弱NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1；長鏈非編碼RNA；非小細(xì)胞肺癌；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)參與染色質(zhì)重塑、基因轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)翻譯等生物學(xué)進(jìn)程[1]。lncRNA表達(dá)異常與腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移及治療耐藥等密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷、療效監(jiān)測及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[2]。鋅指結(jié)構(gòu)反義轉(zhuǎn)錄本1(zinc finger antisense 1,ZFAS1)是一種新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，在肝癌[3]、卵巢癌[4]、結(jié)腸癌[5]中表達(dá)上調(diào)。本研究旨在檢測ZFAS1在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)患者癌組織中的表達(dá)水平，并探討ZFAS1在NSCLC進(jìn)展中的生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2015年11月至2016年10月于南通市腫瘤醫(yī)院就診的NSCLC患者50例，男31例，女19例，年齡37～72歲，中位年齡53.6歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)影像學(xué)檢查(如胸部X線、胸部CT等)、組織學(xué)檢查(經(jīng)纖維支氣管鏡、縱膈鏡、胸腔鏡等采集組織進(jìn)行病理學(xué)檢查)最終診斷為NSCLC。(2)納入前未經(jīng)手術(shù)及放化療等治療。對患肝腎疾病，血液系統(tǒng)疾病，其他類型肺癌或其他臟器腫瘤，自身免疫性疾病以及嚴(yán)重感染的患者予以排除。NSCLC分期及病理組織學(xué)分型按照1997年國際抗癌聯(lián)盟(UICC)和美國癌癥聯(lián)合委員會(AJCC)診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中鱗癌13例，腺癌37例。留取距離癌組織5 cm以上的癌旁組織(經(jīng)病理組織學(xué)檢查無癌細(xì)胞)作為對照組，所有組織標(biāo)本在離體30 min內(nèi)分裝于不同凍存管中，置液氮中保存。樣本采集經(jīng)南通市腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2細(xì)胞系、主要試劑和儀器 人NSCLC細(xì)胞系A(chǔ)549購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、Trizol試劑(美國Gibco公司)；LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑、對照和ZFAS1 shRNA質(zhì)粒(漢恒公司)；基質(zhì)膠(美國BD公司)；細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡試劑盒(福麥斯公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)；2×SYBR Green PCR Master Mix(康為世紀(jì)公司)；CFX96熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；NanoDrop2000超微量分光光度計(美國Thermo公司)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)和RNA干擾 A549細(xì)胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(1×105/孔)。采用LipoFiter轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)shRNA質(zhì)粒在無血清條件下轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，轉(zhuǎn)染6 h后更換為常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.4細(xì)胞生長曲線和克隆形成 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞種于24孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(1×104/孔)，連續(xù)培養(yǎng)6 d，每天用牛鮑氏計數(shù)板計數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞接種于6孔板細(xì)胞培養(yǎng)板(1×103/孔)，連續(xù)培養(yǎng)10 d，隔天換液。培養(yǎng)結(jié)束后，取出6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，用光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。實驗重復(fù)3次。

1.5細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡檢測 收集轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞(5×105個)，用95%預(yù)冷無水乙醇4 ℃固定過夜。次日用PBS 洗滌3次，加入碘化丙啶(PI)染液暗處染色30 min，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。收集轉(zhuǎn)染后的A549細(xì)胞，重懸于染色緩沖液中，加入Annexin V和PI染液暗處染色30 min，流式細(xì)胞分析細(xì)胞凋亡。實驗重復(fù)3次。

1.6細(xì)胞遷移和侵襲實驗 轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞種于Transwell遷移小室上室(2×104/孔)，下室加入600 μL常規(guī)培養(yǎng)基。遷移24 h后，取出Transwell小室，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽擦除小室膜內(nèi)側(cè)未遷移的細(xì)胞，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。隨機選擇10個高倍視野，計數(shù)遷移細(xì)胞數(shù)。基質(zhì)膠侵襲實驗預(yù)先用基質(zhì)膠100 μL包被Transwell遷移小室上室。置于37 ℃溫育，待基質(zhì)膠凝固后，接種轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞(4×104/孔)，下室加入600 μL常規(guī)培養(yǎng)基，侵襲36 h。染色步驟和結(jié)果分析同細(xì)胞遷移實驗。實驗重復(fù)3次。

1.7RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染后A549細(xì)胞總RNA，NanoDrop 2000超微量分光光度計檢測RNA濃度和純度，取吸光度(A260/280 nm)為1.8～2.0的RNA樣本，將RNA樣本按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-20 ℃保存。

1.8引物設(shè)計與合成 利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由上海英濰捷基公司合成。引物序列見表1。

1.9實時熒光定量RT-PCR 采用CFX96實時熒光定量PCR儀分析，按照UltraSYBR實時熒光定量RT-PCR Mixture試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)總體系20 μL：2×SYRR Green PCR Master Mix 10 μL、上、下游引物(5 mmol/L)各0.3 μL，cDNA模板1.5 μL，RNase free ddH2O 7.9 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性10 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。目的基因的相對表達(dá)水平用2-△△Ct法計算，公式：△△Ct=[(樣本Ct目的基因-樣本Ct管家基因)-(對照組Ct目的基因-對照組Ct管家基因)]。ZFAS1檢測以U6為管家基因，其他目的基因檢測以β-actin為管家基因。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1ZFAS1在NSCLC組織中的表達(dá) 實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與癌旁組織[0.002(0.001，0.012)]相比，ZFAS1在NSCLC癌組織中表達(dá)水平[0.01(0.002，0.054)]明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-2.638，P<0.01)。

2.2ZFAS1基因敲減對A549細(xì)胞生長和克隆形成的影響 實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1基因在敲減組中表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.083，P<0.05)，見圖1A。生長曲線實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1敲減組在接種第4、5和6天后細(xì)胞生長明顯減弱(t分別為29.00、41.00和11.80；P均<0.01)，見圖1B。細(xì)胞克隆形成結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1敲減組細(xì)胞克隆形成數(shù)目明顯減少(t=23.85，P<0.01)，見圖1C、1D。

注：**，P<0.01。

圖1ZFAS1基因敲減抑制A549細(xì)胞生長和克隆形成

2.3ZFAS1基因敲減對A549細(xì)胞周期和凋亡的影響 流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1敲減組細(xì)胞G1期細(xì)胞比例明顯增加，S期細(xì)胞比例明顯減少(t分別為25.21和33.98；P均<0.01)，見圖2A。此外，與對照組相比，ZFAS1敲減組凋亡細(xì)胞比例亦明顯增加(t=22.20，P<0.01)，見圖2B。

注：**，P<0.01。

圖2ZFAS1基因敲減誘導(dǎo)A549細(xì)胞S期降低和細(xì)胞凋亡

2.4ZFAS1基因敲減對A549細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響 Transwell遷移實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1敲減組細(xì)胞遷移能力明顯減弱(t=43.73，P<0.01)，見圖3A。此外，與對照組相比，ZFAS1敲減組細(xì)胞侵襲能力也明顯降低(t=38.31，P<0.01)，見圖3B。

注： **，P<0.01。

圖3ZFAS1基因敲減抑制A549細(xì)胞遷移和侵襲(×100)

2.5ZFAS1基因敲減對A549細(xì)胞增殖和EMT相關(guān)基因表達(dá)的影響 實時熒光定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，ZFAS1敲減組細(xì)胞中增殖相關(guān)基因CyclinD1和Bcl2表達(dá)水平明顯下降(t分別為30.66和8.973，P均<0.01)，EMT相關(guān)基因N-cadherin、ZEB1、Slug、Twist表達(dá)水平亦明顯下降(t分別為16.82、17.57、9.468和6.535，P均<0.05)，見圖4。

3 討論

LncRNA在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用[6]。研究表明，多種lncRNA在NSCLC中存在表達(dá)異常，包括SNHG20[7]、SBF2-AS1[8]和PANDAR[9]等。這些lncRNA通過調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡和遷移，參與NSCLC生長和轉(zhuǎn)移。另有研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可作為NSCLC診斷和預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物[6]。如SNHG20在NSCLC患者癌組織中的表達(dá)水平明顯增加，并與腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。SNHG20高表達(dá)的NSCLC患者生存期短，預(yù)后差，提示SNHG20可能是NSCLC患者的獨立預(yù)后因素[7]。lncRNA可穩(wěn)定地存在于血清中。血清MALAT1鑒別NSCLC與非NSCLC組(健康人對照組和肺良性病變組)的AUCROC達(dá)0.956[10]。當(dāng)cut-off 值為0.62時，其敏感性和特異性分別為87.5%和94.1%[10]，提示血清lncRNA檢測NSCLC具有較好的診斷效能。Tian等[11]發(fā)現(xiàn)ZFAS1在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)，且其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)與ZFAS1低表達(dá)患者相比，ZFAS1高表達(dá)患者生存時間明顯縮短，提示ZFAS1可作為NSCLC患者預(yù)后評估的獨立風(fēng)險因子。本研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1在NSCLC患者癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，與Tian等[11]的報道結(jié)果較為一致。但本研究由于樣本量較少，未進(jìn)行ZFAS1表達(dá)水平與NSCLC病理參數(shù)相關(guān)性分析。后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步擴大樣本量，以明確ZFAS1表達(dá)水平與NSCLC疾病進(jìn)展和預(yù)后的關(guān)系。

注：*，P<0.05；**，P<0.01。

圖4ZFAS1基因敲減下調(diào)A549細(xì)胞中增殖和EMT相關(guān)基因表達(dá)

ZFAS1在NSCLC中的生物學(xué)作用機制目前尚不明確。Li等[3]最早揭示ZFAS1通過ceRNA機制結(jié)合miR-150，激活ZEB1表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲。Fang等[5]證實ZFAS1通過調(diào)控ZEB1表達(dá)，誘導(dǎo)EMT發(fā)生，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者血清外泌體中富含ZFAS1，外泌體通過轉(zhuǎn)運ZFAS1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，ZFAS1基因敲減導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力減弱，其機制可能與ZFAS1基因敲減誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡和抑制EMT特性有關(guān)。本研究結(jié)果證實，ZFAS1基因敲減導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞CyclinD1基因表達(dá)下調(diào)。Cyclin D1是推動細(xì)胞周期從G1期進(jìn)入S期的關(guān)鍵蛋白質(zhì)。在不同腫瘤中CyclinD1基因多存在過度表達(dá)，引起細(xì)胞惡性增殖。ZFAS1基因敲減還導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞中Bcl2基因表達(dá)下調(diào)。Han等[9]發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者癌組織中PANDAR表達(dá)水平降低。PANDAR過表達(dá)通過下調(diào)Bcl2促進(jìn)NSCLC細(xì)胞凋亡。提示ZFAS1可能通過調(diào)控CyclinD1和Bcl2基因的表達(dá)促進(jìn)NSCLC細(xì)胞周期進(jìn)展和抑制細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)ZFAS1基因敲減導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞ZEB-1基因表達(dá)下調(diào)，這與Li等[3]和Fang等[5]的研究報道結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)ZFAS1基因敲減導(dǎo)致NSCLC細(xì)胞Slug和Twist基因表達(dá)下調(diào)。Zhou等[13]報道ZFAS1和Twist基因在胃癌組織中的表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示ZFAS1可能通過激活ZEB1、Slug和Twist等EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控EMT發(fā)生。Xia等[14]報道ZFAS1通過結(jié)合miR-150-5p上調(diào)Sp1表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌惡性進(jìn)展。然而，本研究仍需在今后的研究中繼續(xù)探討ZFAS1是否通過ceRNA機制調(diào)控增殖和EMT相關(guān)基因在NSCLC中的表達(dá)情況。

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2017-08-10)

(本文編輯：許曉蒙)

Expressionandrolesoflongnon-codingRNAZFAS1innon-smallcelllungcancer

ZHANGXu1,ZANGXue-yan1,GUJian-mei2,ZHANGPeng1,LIANGWei1,CHENJing-yan1,PANLei1,QIANHui1,XUWen-rong1

(1.JiangsuKeyLaboratoryofMedicalScienceandLaboratoryMedicine,SchoolofMedicine,JiangsuUniversity,Zhenjiang212013,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,NantongTumorHospital,Nantong226000,Jiangsu,China)

ObjectiveTo determine the expression levels of zinc finger antisense 1(ZFAS1) in tumor tissues of non-small cell lung cancer (NSCLC) and investigate the biological roles ofZFAS1 in NSCLC.MethodsThe relative expression levels ofZFAS1 in tumor tissues of NSCLC patients were determined by using real-time fluorescent qRT-PCR. RNA interference was used to knock downZFAS1 expression in A549 cells. The proliferations of A549 cells withZFAS1 knockdown were determined by cell counting and cell colony formation assays. Flow cytometric analysis was used to determine the cellular cycle distribution and apoptosis of the A549 cells withZFAS1 knockdown. Transwell migration and matrigel invasion assays were used to determine the migration and invasion of the A549 cells withZFAS1 knockdown. The gene expression levels ofcyclinD1,Bcl2,N-cadherin,ZEB1,SlugandTwistwere determined by real-time fluorescent qRT-PCR.ResultsThe mean expression levels ofZFAS1 in tumor tissues of NSCLC patients [0.01(0.002 to 0.054)] were significantly higher than those in the adjacent non-cancerous tissues [0.002(0.001 to 0.012)] (Z=-2.638;P<0.01). AfterZFAS1 knockdown, the proliferation of A549 cells was remarkably retarded (P<0.01). The percentage of cells at G1phase was increased while the cells at S phase was decreased (P<0.01). The rate of apoptotic cells was significantly increased in A549 cells withZFAS1 knockdown (P<0.01). A549 cells showed decreased migration and invasion abilities afterZFAS1 knockdown (P<0.01). The expression levels ofcyclinD1,Bcl2,N-cadherin,ZEB1,SlugandTwistgenes were decreased inZFAS1 knockdown A549 cells (P<0.05).ConclusionZFAS1 was highly expressed in the tumor tissues of NSCLC patients.ZFAS1 knockdown induced cell cycle arrest, cell apoptosis and suppression of epithelial-mesenchymal transition (EMT), leading to the inhibition of proliferation, migration, and invasion of NSCLC cells.

zinc finger antisense 1; long non-coding RNA (lncRNA); non-small cell lung cancer; epithelial-mesenchymal transition

10.13602/j.cnki.jcls.2017.11.04

國家自然科學(xué)基金面上項目(81572075, 81672416)；江蘇省自然科學(xué)基金面上項目(BK20131242)；江蘇省重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(BE2015667)；鎮(zhèn)江市重點研發(fā)計劃(社會發(fā)展)項目(SH2015034)；江蘇省“青藍(lán)工程”;江蘇省“333工程”。

張徐，1984年生，男，副教授，博士，從事腫瘤分子診斷研究。

許文榮，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail: icls@ujs.edu.cn。

R375.2

A