HPLC法測(cè)定安神補(bǔ)腦液中防腐劑的含量Δ

陳靈君，王發(fā)英，王偉影#（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，杭州310005；.麗水市食品藥品與質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江麗水 33000）

HPLC法測(cè)定安神補(bǔ)腦液中防腐劑的含量Δ

陳靈君1＊，王發(fā)英2，王偉影2#（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，杭州310005；2.麗水市食品藥品與質(zhì)量技術(shù)檢驗(yàn)檢測(cè)院，浙江麗水 323000）

目的：建立測(cè)定安神補(bǔ)腦液中防腐劑含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：苯甲酸和羥苯乙酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為12.85～128.54μg/mL（r＝0.999 9）、4.05～40.48μg/mL（r＝0.999 8）；定量限分別為0.514、1.012 μg/mL，檢測(cè)限分別為0.171、0.353 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜1.0%；加樣回收率分別為99.38%～100.21%（RSD＝0.31%，n＝6）、97.96%～100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于安神補(bǔ)腦液中防腐劑的含量測(cè)定。

高效液相色譜法；安神補(bǔ)腦液；防腐劑；含量

安神補(bǔ)腦液是由鹿茸、制何首烏、淫羊藿提取物及維生素B1等加入單糖漿/蔗糖溶液/果糖溶液及防腐劑制成的復(fù)方中藥制劑，具有生精補(bǔ)髓、益氣養(yǎng)血、強(qiáng)腦安神的功效；可用于腎精不足、氣血兩虧所致的頭暈、乏力、健忘、失眠等癥的治療[1]。該制劑收載于2015年版《中國(guó)藥典》（一部），現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)處方中部分藥味進(jìn)行了鑒別或含量的測(cè)定，但對(duì)其中的防腐劑尚未作出規(guī)定[1]。安神補(bǔ)腦液中所用的防腐劑為常用化學(xué)防腐劑——苯甲酸和羥苯乙酯。過(guò)量使用苯甲酸不僅破壞維生素B1、影響人體對(duì)鈣的吸收、刺激胃腸道、損壞神經(jīng)系統(tǒng)，而且還會(huì)對(duì)人體肝臟造成危害，具有致癌性、細(xì)胞毒性[2-3]；過(guò)量使用羥苯乙酯會(huì)產(chǎn)生變態(tài)反應(yīng)以及類(lèi)激素作用[4]。為保證患者的用藥安全，筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[5-7]，采用高效液相色譜法（HPLC）建立了測(cè)定該制劑中防腐劑含量的方法，以期為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀、包括G4212B二極管陣列檢測(cè)器、G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、Aglient色譜工作站（美國(guó)Agilent公司）；XS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；Milli-QA10型超純水儀（美國(guó)Millipore公司）

1.2 藥品與試劑

安神補(bǔ)腦液（吉林敖東延邊藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：1512026、1604211、1604213、1606214、1609020，規(guī)格：10 mL/支）；苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：100419-201202，純度：100%）、羥苯乙酯對(duì)照品（批號(hào)：00847-201102，純度：99.9%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙睛、甲醇和磷酸為色譜純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，16%→20%A；5～25 min，20%→85%A）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取苯甲酸對(duì)照品24.10 mg和羥苯乙酯對(duì)照品15.18 mg，分別加甲醇制成每1 mL含苯甲酸482.0 μg、羥苯乙酯303.6 μg的單一對(duì)照品貯備液。精密吸取上述兩種單一對(duì)照品貯備液各適量，加甲醇制成每1 mL含苯甲酸64.27 μg、羥苯乙酯20.24 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取樣品2 mL，置于50 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 按樣品的處方比例和制備工藝制備無(wú)防腐劑的樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，各待測(cè)成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度均＞1.5；理論板數(shù)以苯甲酸峰計(jì)為109 061，以羥苯乙酯峰計(jì)為192 418；保留時(shí)間分別為12.93、15.97 min。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.4 線(xiàn)性關(guān)系考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 0.1、0.2、0.5、1、2 mL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以苯甲酸和羥苯乙酯質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得苯甲酸回歸方程為y＝40.058 4x－0.045 6（r＝0.999 9）、羥苯乙酯回歸方程為y＝19.196 5x+0.036 3（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，苯甲酸和羥苯乙酯檢測(cè)質(zhì)量濃度線(xiàn)性范圍分別為12.85～128.54、4.05～40.48 μg/mL。

2.5 定量限（LOQ）與檢測(cè)限（LOD）考察

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋?zhuān)础?.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為10∶1時(shí)，得LOQ；當(dāng)信噪比為3∶1時(shí)，得LOD。結(jié)果，苯甲酸和羥苯乙酯的LOQ分別為0.514、1.012 μg/mL，LOD分別為0.171 、0.353 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.15%、0.17%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：1512026）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、18、30 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，苯甲酸和羥苯乙酯峰面積的RSD分別為0.17%、0.47%（n＝7），表明供試品溶液在室溫下放置30 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號(hào)：1512026）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量。結(jié)果，苯甲酸和羥苯乙酯含量的平均值分別為0.188%、0.046%，RSD分別為0.31%、0.98%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取樣品（批號(hào)：1512026）1 mL，共6份，分別置于50 mL量瓶中，各加入一定質(zhì)量的苯甲酸和羥苯乙酯對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.10 樣品中防腐劑含量測(cè)定

取5批樣品各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算防腐劑含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

表2 樣品防腐劑含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3.1 流動(dòng)相的選擇

筆者參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.02%乙酸銨溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)對(duì)色譜分離的影響。結(jié)果，甲醇-水、乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，苯甲酸和羥苯乙酯有拖尾現(xiàn)象；以甲醇-0.02%乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，苯甲酸和羥苯乙酯的保留時(shí)間波動(dòng)較大；以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，苯甲酸和羥苯乙酯分離效果理想、峰形佳、理論板數(shù)高。故本試驗(yàn)選擇乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

查閱相關(guān)文獻(xiàn)[10-12]，苯甲酸和羥苯乙酯的檢測(cè)波長(zhǎng)不同。但在預(yù)試驗(yàn)中，筆者在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃面，發(fā)現(xiàn)苯甲酸和羥苯乙酯在236 nm波長(zhǎng)處響應(yīng)值均較高，且在此波長(zhǎng)處無(wú)其他成分干擾，因此選擇236 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 樣品測(cè)定結(jié)果分析

2015年《中國(guó)藥典》（四部）對(duì)合劑中防腐劑的用量作了規(guī)定，其中苯甲酸的用量不得超過(guò)0.3%（其鉀鹽、鈉鹽的用量分別按酸計(jì)），羥苯酯類(lèi)的用量不得超過(guò)0.05%[13]，本試驗(yàn)樣品中苯甲酸的含量為0.176%～0.188%、羥苯乙酯的含量為0.043%～0.046%，均未超出限定用量；但相比苯甲酸，羥苯乙酯的用量則需注意控制。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，可用于安神補(bǔ)腦液中防腐劑的含量測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：884-885.

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Content Determination of Antiseptics in Anshen Bunao Oral Liquid by HPLC

CHEN Lingjun1，WANG Faying2，WANG Weiying2（1.The Third Affiliated Hospital of Zhejiang University of TCM，Hangzhou 310005，China；2.Lishui Inspection Institute of Food and Drug ＆ Quality and Technology Inspection，Zhejiang Lishui 323000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Agilent Zorbax SB-C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05%phosphorice acid solution（gradient elution）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 236 nm，and column temperature was 30 ℃.The injection volume was 10 μL.RESULTS：The linear range of benzoic acid and ethylparaben were 12.85-128.54 μg/mL（r＝0.999 9）and 4.05-40.48 μg/mL（r＝0.999 8），respectively.The limits of quantitation were 0.514，1.012 μg/mL.The limits of detection were 0.171，0.353 μg/mL.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were all lower than 1.0%.The recoveries were 99.38%-100.21%（RSD＝0.31%，n＝6），97.96%-100.72%（RSD＝0.91%，n＝6）.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for content determination of antiseptics in Anshen bunao oral liquid.

HPLC；Anshen bunao oral liquid；Antiseptics；Content

R927.2

A

1001-0408（2017）33-4722-03

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.31

浙江省公共科技條件平臺(tái)項(xiàng)目（No.2012E60008）

＊中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量控制。電話(huà)：0571-87238002。E-mail：chen3952991@163.com

#通信作者：副主任中藥師。研究方向：藥物分析、藥物質(zhì)量控制。電話(huà)：0578-2661121。E-mail：onlyying0508@gmail.com

（編輯：劉 柳）

2017-07-02

2017-08-10）