苗藥透骨香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

姚成芬，張寶，熊丹丹，劉亭，鄭林，李月婷，陳青鳳，李勇軍（1.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004）

苗藥透骨香的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

姚成芬1，2＊，張寶1，2，熊丹丹1，2，劉亭3，鄭林3，李月婷3，陳青鳳1，2，李勇軍1#（1.民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/國(guó)家苗藥工程技術(shù)研究中心，貴陽 550004；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴陽 550004；3.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550004）

目的：建立透骨香藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)藥材進(jìn)行定性鑒別；測(cè)定藥材水分、總灰分和酸不溶性灰分；采用高效液相色譜法測(cè)定藥材中水楊酸甲酯的含量：色譜柱為Eclipse XDB-C18，流動(dòng)相為甲醇-水（62∶38，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為307 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：藥材的TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好。藥材水分為8.2%～10.8%，總灰分為0.9%～4.0%，酸不溶性灰分為0.1%～0.9%。水楊酸甲酯檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.045～0.73 μg（r＝0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤1.0%；水楊酸甲酯加樣回收率為97.8%～104.3%（RSD＝2.6%，n＝9）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于透骨香藥材的質(zhì)量控制。

透骨香；薄層色譜法；高效液相色譜法；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；滇白珠苷A；水楊酸甲酯

透骨香為杜鵑花科植物滇白珠Gaultheria yunnanensis（Franch.）Rehd.的干燥全株[1]，為2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》收載品種[2]，具有清熱解毒、活血化淤、祛風(fēng)濕、順氣平喘的功效，臨床主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、眩暈、閉經(jīng)、風(fēng)寒感冒等疾病的治療[3-6]?，F(xiàn)代藥理研究表明，透骨香藥材有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗菌等作用[7-9]?，F(xiàn)代化學(xué)研究表明，透骨香藥材含有黃酮類、木脂素類、揮發(fā)油類、萜類、有機(jī)酸類、甾體類等化學(xué)成分[10-13]。目前，藥材標(biāo)準(zhǔn)中僅有性狀和顯微鑒別，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不夠完善。本課題組在前期研究的基礎(chǔ)上，采用2015年版《中國(guó)藥典》[14]中附錄及相關(guān)方法，采集33批不同產(chǎn)地的透骨香藥材，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究，為該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和修訂提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10Avp型高效液相色譜（HPLC）儀，包括LC-10ATvp泵、SPD-10Avp紫外檢測(cè)器、7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥、TC-100柱溫箱、WML色譜工作站、UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）；TCQ-250型超聲波清洗器（北京醫(yī)療設(shè)備二廠）；AE240型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；GZX-9420 MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）。

1.2 試劑

滇白珠苷A對(duì)照品（貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，質(zhì)譜檢測(cè)確定結(jié)構(gòu)，HPLC測(cè)定純度＞98%）；水楊酸甲酯對(duì)照品（批號(hào)：110707-200609，純度：≥98%）、透骨香對(duì)照藥材（批號(hào)：121292-200402）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

透骨香藥材采于貴州省各地（見表1），經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為真品。

表1 透骨香藥材來源Tab 1 Source of G.yunnanensis

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

取藥材樣品粉末（過40目篩）1 g，置于量瓶中，加甲醇25 mL，超聲（功率：200 W，頻率：29 kHz）提取30 min，提取液直接流穿上已處理好的聚酰胺（30～60目，1 g）柱，用75 mL乙醇洗脫，收集流穿液與乙醇洗脫液，蒸干，殘?jiān)? mL甲醇使溶解，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取滇白珠苷A對(duì)照品，加甲醇制成滇白珠苷A質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。再取對(duì)照藥材1 g，同供試品溶液制備方法制成對(duì)照藥材溶液。按薄層色譜法[2015年版《中國(guó)藥典》（四部）][14]試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各6 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲苯-甲醇-醋酸（9∶1∶1∶0.5，V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%磷鉬酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖1。

2.2 水分檢查

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）水分測(cè)定法[14]測(cè)定藥材樣品水分。結(jié)果表明，33批藥材樣品水分為8.2%～10.8%（見表2）。擬定透骨香藥材水分不得過11.0%。

圖1 薄層色譜圖Fig 1 TLC chromatograms

表2 藥材樣品水分、總灰分、酸不溶性灰分測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 2 Content determination of moisture，total ash and acid insoluble ash in samples（n＝3，%）

2.3 總灰分和酸不溶性灰分檢查

按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）灰分測(cè)定法[14]測(cè)定藥材樣品總灰分和酸不溶性灰分。結(jié)果表明，33批藥材樣品總灰分為0.9%～4.0%，酸不溶性灰分為0.1%～0.9%（見表2）。擬定透骨香藥材總灰分不得過4.0%，酸不溶性灰分不得過1.0%。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：Eclipse XDB-C1（8150 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（62∶38，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：307 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)按水楊酸甲酯峰計(jì)＞4 000；分離度＞1.5，各成分基線分離良好，詳見圖2。

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取水楊酸甲酯對(duì)照品11.36 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

圖2 高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatograms

2.4.3 供試品溶液的制備 精密稱取藥材樣品粉末（過20目篩）約0.6 g，置于量瓶中，精密加甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，冷卻至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，取上清液，經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇定容，制成系列對(duì)照品溶液。精密量取上述系列對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以水楊酸甲酯進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得水楊酸甲酯回歸方程y＝2.85×104x－3.99×10（3r＝0.999 9）。結(jié)果表明，水楊酸甲酯檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.045～0.73 μg。

2.4.5 精密度試驗(yàn) 取“2.4.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，水楊酸甲酯峰面積的RSD＝0.4%（n＝9），表明儀器精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：1）適量，分別于室溫下放置0、1、2、4、8 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，水楊酸甲酯峰面積的RSD＝1.0%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號(hào)：1）適量，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共9份，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果，水楊酸甲酯含量平均值為0.92 mg/g，RSD＝0.8%（n＝9），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量藥材樣品（編號(hào)：1）適量，共6份，分別加入低、中、高質(zhì)量的水楊酸甲酯對(duì)照品，按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.4.9 藥材樣品含量測(cè)定 取33批藥材樣品各適量，分別按“2.4.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算藥材樣品含量，結(jié)果見表4。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

表4 藥材樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，%）Tab 4 Results of content determination of samples（n＝3，%）

3 討論

2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中透骨香藥材使用部位為全株，透骨香藥材主要用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。研究表明，滇白珠苷A具有抗關(guān)節(jié)炎的藥理活性[15]，該藥理活性符合透骨香藥材的主治功能，即滇白珠苷A為透骨香藥材的有效成分。因此，本研究將滇白珠苷A作為藥材樣品的TLC定性鑒別研究的對(duì)照品，建立透骨香藥材TLC的定性鑒別。通過TLC鑒別結(jié)果可知，透骨香藥材起作用的部位可能為根和莖，葉是否有藥效有待進(jìn)一步研究。

文獻(xiàn)報(bào)道，透骨香藥材揮發(fā)油成分主要為水楊酸甲酯，其測(cè)定方法多用氣相色譜法[16]，少數(shù)用TLC法和熒光分析法[17]。TLC法分離度低，操作復(fù)雜；熒光法前處理較煩瑣。本研究采用HPLC法測(cè)定水楊酸甲酯的含量，優(yōu)點(diǎn)在于處理簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于透骨香藥材的質(zhì)量控制。

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Study on Quality Standard of Miao Medicine Gaultheria yunnanensis

YAO Chengfen1，2，ZHANG Bao1，2，XIONG Dandan1，2，LIU Ting3，ZHENG Lin3，LI Yueting3，CHEN Qingfeng1，2，LI Yongjun1（1.Engineering Research Center for the Development and Application of Ethnic Medicines and Traditional Chinese Medicine，Ministry of Education/State Center for Miao Medicine Engineering Technology Research，Guiyang 550004，China；2.School of Pharmacy，Guizhou Medical University，Guiyang 550004，China；3.Guizhou Provincial Key Lab of Pharmaceutics，Guiyang 550004，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Gaultheria yunnanensis.METHODS：TLC was adopted for qualitative identification of samples.Moisture，total ash and acid-insoluble ash were determined.HPLC method was used to determine the content of methyl salicylate.The determination was performed on Eclipse XDB-C18column with mobile phase consisted of methanol-water（62∶38，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 307 nm，and column temperature was 30 ℃.The sample size was 10 μL.RESULTS：TLC spots of samples were clear and well separated.The moisture was 8.2%-10.8%，total ash was 0.9%-4.0%and acid-insoluble ash was 0.1%-0.9%.The linear range of methyl salicylate were 0.045-0.73 μg（r＝0.999 9）.RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 1.0%.The recoveries of methyl salicylate were 97.8%-104.3%（RSD＝2.6%，n＝9）.CONCLUSIONS：The established standard can be used for quality control of G.yunnanensis.

Gaultheria yunnanensis；TLC；HPLC；Quality standard；Gaultheroside A；Methyl salicylate

R917

A

1001-0408（2017）33-4711-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.28

貴州省優(yōu)秀科技人才項(xiàng)目（No.黔科合人字〔2015〕11）；貴州省協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)項(xiàng)目（No.黔教合協(xié)同創(chuàng)新字〔2013〕04）；貴州省研究生卓越人才計(jì)劃項(xiàng)目（No.ZYRC2014012）；貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.黔科合平臺(tái)人才〔2016〕5613、黔科合平臺(tái)人才〔2016〕5677）

＊碩士研究生。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：1340642402@qq.com

#通信作者：教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制。E-mail：liyongjun026@126.com

（編輯：張 靜）

2017-03-07

2017-04-16）