藏藥水柏枝的質(zhì)量標準研究Δ

多杰，馬志良，多杰拉旦，尼瑪才讓，東知多杰，賽桑杰（1.中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點實驗室/新疆特有藥用資源利用省部共建國家重點實驗室培育基地/中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊830011；.藏藥研發(fā)國家重點實驗室/青海省藏醫(yī)藥研究院，西寧 810016；3.中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100049）

藏藥水柏枝的質(zhì)量標準研究Δ

多杰1，2，3＊，馬志良2，多杰拉旦2，尼瑪才讓2，東知多杰2，賽桑杰2（1.中國科學(xué)院干旱區(qū)植物資源化學(xué)重點實驗室/新疆特有藥用資源利用省部共建國家重點實驗室培育基地/中國科學(xué)院新疆理化技術(shù)研究所，烏魯木齊830011；2.藏藥研發(fā)國家重點實驗室/青海省藏醫(yī)藥研究院，西寧 810016；3.中國科學(xué)院大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，北京 100049）

目的：建立藏藥水柏枝的質(zhì)量標準。方法：從性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）方面對藥材進行定性鑒別；檢測藥材水分、灰分和浸出物的含量；采用高效液相色譜法（HPLC）測定藥材中沒食子酸的含量：色譜柱為Diamonsil C18，流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm，柱溫為30℃，進樣量為10 μL。結(jié)果：水柏枝呈圓柱形，有多數(shù)窄條形互生小葉，質(zhì)脆，易折斷，氣微，味淡。木栓細胞表面和下表皮細胞表面可見多角形，木纖維多成束，草酸鈣簇晶眾多。TLC圖斑點清晰，分離度良好。水分為6.83%～8.12%，總灰分為4.01%～5.01%，酸不溶性灰分為1.06%～1.98%，水浸出物為17.91%～22.65%，醇浸出物為11.29%～15.51%。沒食子酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.13～50 μg/mL（r＝0.999 7），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)試驗的RSD＜1.0%，沒食子酸加樣回收率為94.0%～100.8%（RSD＝2.27%，n＝9）。結(jié)論：該研究所建標準可用于藏藥水柏枝的質(zhì)量評價。

藏藥；水柏枝；質(zhì)量標準；沒食子酸；薄層色譜法；高效液相色譜法

水柏枝始載于《四部醫(yī)典》，藏文譯音為“翁布”[1]，為檉柳科植物水柏枝Myricaria germanica L.Desv.的嫩枝及葉、花，主要分布于我國青海、甘肅、四川、云南、西藏等地，生長于山地、河谷、礫石質(zhì)河灘、河床砂地、河漫灘及河谷山山坡[2]。水柏枝藥材主治風(fēng)濕痹痛、麻疹不透、瘟病時疫、臟腑毒熱、咽喉腫痛、中毒癥、黃水病、血熱病等癥[3]，被廣泛用于藏藥復(fù)方制劑中，如二十五味大湯丸、五味甘露藥浴湯散、十九味草果散等[4]。水柏枝藥材含有黃酮、三萜、酚酸、木脂素、甾體和長鏈脂肪醇類等化合物[5-7]?，F(xiàn)代藥理研究表明，水柏枝藥材具有抗菌、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗疲勞、提高細胞免疫以及保護肝損傷等作用[8]。然而，水柏枝作為常用藏藥材，目前缺乏相關(guān)質(zhì)量標準，給臨床用藥帶來諸多不便。因此，本研究結(jié)合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定，鑒定10批水柏枝藥材樣品的原植物性狀、顯微特征，測定水分、總灰分和浸出物含量，采用薄層色譜法（TLC）和高效液相色譜法（HPLC）進行定性、定量研究，為制定水柏枝藥材的質(zhì)量標準提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括二元梯度泵，Waters 2996型紫外檢測器，EMPOWER色譜工作站（美國Waters公司）；UPT-Ⅱ型超純水機（成都優(yōu)普超純水科技有限公司）。

1.2 試劑

沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201605，純度：＞98%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

水柏枝藥材采集自青海、甘肅和西藏等地（見表1），經(jīng)筆者鑒定為真品。

表1 水柏枝藥材來源Tab 1 Origin of M.germanica

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物性狀

藥材原植物枝呈圓柱形，直徑3～6 mm。嫩枝表面綠色；老枝表面灰紅色、褐色；有多數(shù)窄條形互生小葉，長約1～6 cm，常已脫落，枝斷面不平坦，皮部薄，木部綠色，髓部大，黃白色。質(zhì)脆，易折斷。氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

藥材樣品粉末呈綠色。木栓細胞表面觀多角形，壁較厚，長160～320 μm，寬 90～150 μm；木纖維多成束，無色或淡黃色，直徑4～15 μm，壁厚，胞腔細長，紋孔不明顯；草酸鈣簇晶眾多，直徑7～13 μm，菱角較鈍，有時分布于木纖維周圍。下表皮細胞表面觀多角形，外壁稍彎曲；可見具緣紋孔紋導(dǎo)管、網(wǎng)紋導(dǎo)管及螺紋導(dǎo)管，詳見圖1。

2.3TLC鑒別

取藥材樣品粉末（過2號篩）1.0 g，加甲醇50 mL，加熱回流60 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取沒食子酸對照品，加甲醇制成沒食子酸質(zhì)量濃度為2 mg/mL的對照品溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》（四部）][9]試驗，吸取上述2種溶液各2 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.5%三氯化鐵乙醇溶液，晾干，置日光燈下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，詳見圖2。

圖1 藥材樣品粉末顯微特征圖（20×）Fig 1 Microscopic characteristics of sample powder（20×）

圖2 薄層色譜圖Fig 2 TLC chromatograms

2.4 水分測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（四部）“附錄ⅨH水分測定法”的第一法（烘干法）[9]測定藥材樣品水分，每批平行測定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品水分為6.83%～8.12%，平均值為7.40%。初步擬定水柏枝藥材水分不得過10.0%。

表2 藥材樣品水分、灰分、浸出物和沒食子酸含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Content determination of moisture，ash，extract and gallic acid in samples（n＝3）

2.5 灰分測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年《中國藥典》（四部）“附錄ⅨK灰分測定法[9]”測定藥材樣品灰分。每批平行測定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品總灰分為4.01～5.01%，平均值為4.55%；酸不溶性灰分為1.06～1.98%，平均值為1.40%。初步擬定水柏枝藥材總灰分不得過6.0%，酸不溶性灰分不得過2.5%。

2.6 浸出物測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（四部）“附錄ⅩA浸出物測定法[9]”測定藥材樣品浸出物。每批平行測定3份，詳見表2。結(jié)果表明，藥材樣品水浸出物為17.91%～22.65%，平均值為20.23%；醇浸出物為11.29%～15.51%，平均值為13.85%。初步擬定水柏枝藥材水浸出物不得少于15.0%，醇浸出物不得少于10.0%。

2.7 含量測定

2.7.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗 色譜柱：Diamonsil C1（8250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸溶液（5∶95，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以沒食子酸峰計＞3 000；待測成分基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖3。

圖3 高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatograms

2.7.2 對照品溶液的制備 精密稱取沒食子酸對照品5.0 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，得沒食子酸質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL的對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過2號篩）0.500 g，置于100 mL回流圓底燒瓶中，加甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，70℃回流2 h，放至室溫，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.7.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋為原溶液質(zhì)量濃度的1、1/2、1/4、1/8、1/16倍，制成系列對照品溶液。精密量取上述系列對照品溶液各10 μL，按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以沒食子酸質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得沒食子酸回歸方程y＝16 144x+821（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，沒食子酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為3.13～50 μg/mL。

2.7.5 定量限與檢測限考察 分別精密量取“2.7.2”項下對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定[9]，當信噪比為10∶1時，得定量限為1.0 μg/mL；當信噪比為3∶1時，得檢測限為0.3 μg/mL[10]。

2.7.6 精密度試驗 取“2.7.2”項下對照品溶液適量，按“2.7.1”項下色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD＝0.14%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗 取“2.7.3”項下供試品溶液（批號：SBZ-1）適量，分別于室溫下放置0、4、8、12、24 h時按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD＝0.91%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7.8 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（批號：SBZ-1）適量，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，沒食子酸峰面積的RSD＝0.53%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.9 加樣回收率試驗 取已知含量樣品（批號：SBZ-1）適量，每份0.5 g，共6份，分別加入高、中、低質(zhì)量的沒食子酸對照品，按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗結(jié)果（n＝9）Tab 3 Results of recovery tests（n＝9）

2.7.10 藥材樣品含量測定 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.7.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算藥材樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

筆者通過質(zhì)量標準研究，修訂了水柏枝藥材性狀和顯微特征，增加了TLC鑒別，水分、灰分、浸出物及沒食子酸的含量測定。TLC預(yù)試驗中，筆者考察了不同展開系統(tǒng)，并考察了不同點樣量（1、2、3、4 μL）[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以氯仿-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶1，V/V/V）為展開劑，點樣2 μL時，斑點清晰，效果最佳；另外，還考察了不同溫度、濕度、薄層板對展開的影響，發(fā)現(xiàn)各條件對展開結(jié)果影響不大。筆者對收集的藥材樣品進行測定，結(jié)果水分為6.83%～8.12%，總灰分為4.01%～5.01%，酸不溶性灰分為1.06%～1.98%，水浸出物為17.91%～22.65%，醇浸出物為11.29%～15.51%，因此暫定水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得過10.0%、6.0%、2.5%，水和醇浸出物分別不得少于15.0%、10.0%。

通過研究發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地水柏枝藥材中沒食子酸含量略有差異，經(jīng)HPLC法測定，根據(jù)結(jié)果、藥材來源、存放等原因，為保證其臨床效果，暫定沒食子酸含量不得少于4 mg/g。

綜上所述，本研究所建方法可用于水柏枝藥材的質(zhì)量控制。

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Study on Quality Standard of Tibetan Medicine Myricaria germanica

DUO Jie1，2，3，MA Zhiliang2，Duojieladan2，Nimacairang2，Dongzhiduojie2，Saisangjie2（1.Key Lab of Chemistry of Plant Resources in Arid Regions，Chinese Academy of Sciences/State Key Lab Breeding Base of Xinjiang Indigenous Medicinal Plants Resource Utilization/Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry，Chinese Academy of Sciences，Urumqi 830011，China；2.State Key Lab of Tibetan Medicine Research and Development/Qinghai Tibetan Medicine Research Institute，Xining 810016，China；3.School of Chemistry and Chemical Engineering，University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Tibetan medicine Myricaria germanica.METHODS：M.germanica was identified in respects of properties，microscopic characteristics and TLC.The contents of moisture，ash and extract were determined.HPLC method was adopted for content determination of gallic acid.The determination was performed on Diamonsil C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1%phosphoric acid solution（5∶95，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavlengths were set at 270 nm.The column temperature was 30 ℃ and the sample size was 10 μL.RESULTS：M.germanica was cylindrical in shape，and there were many narrow strip alternate leaflets，which were brittle，easily broken，weak in smell，mild in flavor.Cork cell surface and lower epidermal cell surface showed polygon；most of xylon were bunched；there were many clusters of calcium oxalate.TLC spots were clear and well-separated.The contents of moisture，total ash，acid-insoluble ash，water-soluble extract and ethanol were 6.83%-8.12%，4.01%-5.01%，1.06%-1.98%，17.91%-22.65%，11.29%-15.51%.The linear range of gallic acid were 3.13-50 μg/mL（r＝0.999 7）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 1.0%；the recoveries were 94.0%-100.8%（RSD＝2.27%，n＝9）.CONCLUSIONS：Established standard can be used for quality evaluation of Tibetan medicine M.germanica.

Tibetan medicine；Myricaria germanica；Quality standard；Gallic acid；TLC；HPLC

R917；R927

A

1001-0408（2017）33-4699-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.25

青海省自然科學(xué)基金面上項目（No.2015-ZJ-910）；青海省藏藥新藥開發(fā)重點實驗室項目（No.2017-ZJ-Y15）

＊主任醫(yī)師，教授，博士研究生。研究方向：藏藥質(zhì)量標準及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。電話：0971-8270006。E-mail：duojie0302@sina.com

（編輯：張 靜）

2017-03-28

2017-08-08）