毛黃堇藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

吳佳，胡娟娟，張德偉（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶401121；2.重慶醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中藥學(xué)院，重慶 4011；.重慶萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000）

毛黃堇藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究Δ

吳佳1＊，胡娟娟2#，張德偉3（1.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測研究院，重慶401121；2.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校中藥學(xué)院，重慶 401331；3.重慶萬州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404000）

目的：建立毛黃堇藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：從原植物形態(tài)、性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）方面對藥材進(jìn)行定性鑒別；檢測藥材水分、總灰分和水浸出物的含量；采用高效液相色譜法測定藥材中脫氫卡維丁的含量：色譜柱為Agilent C18，流動相為乙腈-磷酸鹽緩沖液（含20 mmol/L磷酸二氫鉀、10 mmol/L二乙胺、0.1%磷酸）（28∶72，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為347 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣量為10μL。結(jié)果：原植物為多年生草本，藥材常皺縮成團(tuán)，被毛，主根圓錐形，根莖和根部有明顯的干裂，葉卷曲而多碎落，花呈黃白色；花粉粒類圓形，可見方晶和柱晶，非腺毛眾多，可見具緣紋孔、螺紋及網(wǎng)紋導(dǎo)管，亦可見木纖維。藥材樣品TLC圖斑點(diǎn)清晰，分離度好。水分為7.5%～18.5%，總灰分為20.5%～26.2%，水浸出物為29.9%～46.4%。脫氫卡維丁檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.040 08～2.404 8 μg（r＝0.999 9），精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD＜2.0%；加樣回收率為95.6%～102.5%（RSD＝2.3%，n＝9）。結(jié)論：該研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于毛黃堇藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)。

毛黃堇；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；脫氫卡維丁

毛黃堇Corydalis tomentella Franch.系罌粟科紫堇屬植物，產(chǎn)于湖北西部、四川東部至南部、重慶和陜西南部，又名干巖矸（重慶），其全草皆可入藥，為民間貴重中草藥，具有抗菌、消炎、鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用，主治瘡癰腫毒、肝炎、肝硬化、肝癌等癥[1-3]，作為地方民族用藥用途廣泛，療效顯著。隨著重慶市藥物種植研究所對毛黃堇藥材人工馴化研究的初步成功，毛黃堇藥材的系統(tǒng)研究需求也愈加迫切。目前，國內(nèi)外尚未見有關(guān)該藥材活性和成分的相關(guān)報(bào)道。本試驗(yàn)對毛黃堇藥材進(jìn)行原植物形態(tài)性狀特征、顯微特征、薄層色譜（TLC）定性鑒別，擬定藥材水分、總灰分和水浸出物限度，通過高效液相色譜法（HPLC）建立其活性成分脫氫卡維丁含量測定方法[4-9]，以期為建立毛黃堇藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1260型HPLC儀，包括四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器，Agilent 1260工作站（美國Agilent公司）；BP221S、MSA225S-100-DU型電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

脫氫卡維丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：111667-200401，純度：100%）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠）；乙腈為色譜純，二乙胺、甲醇、鹽酸、磷酸二氫鉀、磷酸為分析純，水為純化水。

1.3 藥材

試驗(yàn)用10批毛黃堇藥材樣品（S1～S10）由重慶市藥物種植研究所采集（采集地：重慶市南川區(qū)金佛山）提供并確認(rèn)基源，由重慶市藥物種植研究所蔣萬浪副主任中藥師鑒定為真品。

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物形態(tài)與性狀鑒別

2.1.1 原植物形態(tài) 本品為多年生草本，全體密被白色毛茸；主根肉質(zhì)，圓錐形，灰黃色；莖1～3 mm，直立或傾斜；葉基生，具長柄；葉片輪廓狹三角形，二回羽狀復(fù)葉，一回裂片11～13枚，具短柄；二回裂片9～11枚；末回裂片寬倒卵形，先端鈍圓或再2～3深裂。總狀花序頂生，疏生花10余朵；苞片短小，卵狀披針形；花冠金黃色，無毛，外輪上瓣先端具淺凹，距圓筒形，長約占全瓣長的2/3，末端略下彎[4]。原植物形態(tài)見圖1。

圖1 原植物形態(tài)Fig 1 Original plant morphology

2.1.2 藥材性狀 與原植物相比較，毛黃堇藥材全草常皺縮成團(tuán)，被毛；主根圓錐形，表面棕黃色至棕褐色，有明顯的皺紋及須根痕，質(zhì)硬而脆，斷面黃綠色至綠棕色；根莖和根部有明顯的干裂，呈片層結(jié)構(gòu)；葉柄多成束卷曲，綠灰色，干硬、脆而易碎；葉卷曲而多碎落，呈現(xiàn)灰綠色；花呈黃白色；氣微臭，味酸苦。藥材性狀見圖2。

圖2 藥材性狀Fig 2 Medicinal materials properties

2.2 顯微鑒別

取藥材樣品適量，粉碎，粉末因各組織部位的比例不同，呈現(xiàn)的顏色也稍有差別，介于深綠色至棕色之間，花粉粒類圓形，具3個(gè)萌發(fā)孔；可見方晶和柱晶；非腺毛眾多，多碎斷，頂端鈍圓；可見具緣紋孔、螺紋及網(wǎng)紋導(dǎo)管，亦可見木纖維。顯微特征見圖3。

圖3 藥材粉末顯微特征圖Fig 3 Microscopic characteristics of medicinal materials powder

2.3TLC鑒別

取藥材樣品粉末（過2號篩）0.25 g，加1%鹽酸甲醇溶液50 mL，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz，下同）處理30 min，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另取脫氫卡維丁對照品，加甲醇制成脫氫卡維丁質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液。按TLC法[2015年版《中國藥典》[10]（四部）]試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1，V/V/V/V/V/V）為展開劑，置于氨蒸氣飽和的展開缸內(nèi)，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，詳見圖4。

2.4 水分測定

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）“附錄ⅨH水分測定法”的第一法（烘干法）[10]測定藥材樣品水分，每批平行測定3份，詳見表1。結(jié)果表明，藥材樣品水分為7.5%～18.5%，平均值為12.5%。初步擬定毛黃堇藥材水分不得過15.0%。

2.5 總灰分測定

圖4 薄層色譜圖Fig 4 TLC chromatograms

表1 水分、總灰分、水浸出物和脫氫卡維丁含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of determination of moisture，total ash，water-soluble extract and dehydrocavidine（n＝3）

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年《中國藥典》（一部）“附錄ⅨK灰分測定法[10]”測定藥材樣品總灰分。每批平行測定3份，詳見表1。結(jié)果表明，藥材樣品總灰分為20.5%～26.2%（過2號篩），平均值為23.5%。初步擬定毛黃堇藥材總灰分不得過26.0%。

2.6 水浸出物

取10批藥材樣品粉末（過2號篩）適量，精密稱定，按照2015年版《中國藥典》（一部）“附錄ⅩA浸出物測定法[10]”測定藥材樣品浸出物。每批平行測定3份，詳見表1。結(jié)果表明，藥材樣品水浸出物為29.9%～46.4%，平均值為36.6%。初步擬定毛黃堇藥材水浸出物不得少于30.0%。

2.7 含量測定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-磷酸鹽緩沖液（含20 mmol/L磷酸二氫鉀、10 mmol/L二乙胺、0.1%磷酸）（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：347 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以脫氫卡維丁峰計(jì)＞4 000；脫氫卡維丁基線分離良好，分離度＞1.5，詳見圖5。

圖5 高效液相色譜圖Fig 5 HPLC chromatograms

2.7.2 對照品溶液的制備 精密稱取五氧化二磷中減壓干燥至恒質(zhì)量的脫氫卡維丁對照品適量，加1%鹽酸甲醇溶液制成脫氫卡維丁質(zhì)量濃度為0.200 4 mg/mL的對照品溶液。

2.7.3 供試品溶液的制備 取藥材樣品粉末（過2號篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加1%鹽酸甲醇溶液50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放置室溫，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.7.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液0.2、0.5、1、2、4、8、12 μL，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以脫氫卡維丁進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得脫氫卡維丁回歸方程y＝2 833.6 x+99.236（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，脫氫卡維丁檢測進(jìn)樣量線性范圍為0.040 08～2.404 8 μg。

2.7.5 精密度試驗(yàn) 取“2.7.2”項(xiàng)下對照品溶液適量，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，脫氫卡維丁峰面積的RSD＝0.3%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，脫氫卡維丁峰面積的RSD＝0.9%（n＝5），表明供試品溶液室溫放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.7.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取藥材樣品（編號：S2）適量，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，脫氫卡維丁峰面積的RSD＝1.8%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量藥材樣品（編號：S2）適量，共9份，分別加入低、中、高質(zhì)量的脫氫卡維丁對照品，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab 2 Results of recovery tests（n＝9）

2.7.9 樣品含量測定 取10批藥材樣品各適量，分別按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表1。

3 討論

毛黃堇原為野生，近年重慶市藥物種植研究所對毛黃堇人工馴化研究已初步成功（在性狀上考察了野生品與家種品異同，結(jié)果兩者性狀均一致）。筆者對多批藥材樣品進(jìn)行TLC檢測，結(jié)果均檢出脫氫卡維丁對照品相應(yīng)的色譜斑點(diǎn)。結(jié)果表明，本研究TLC條件合理，方法可行，專屬性強(qiáng)。因本藥材樣品為全草類藥材，各部位占比不同，造成水分、總灰分及水浸出物含量差異較大；故在制定限度時(shí)，范圍稍有放寬。

本試驗(yàn)含量測定供試品溶液的制備項(xiàng)下，筆者對提取溶劑類型、提取溶劑體積及提取時(shí)間均進(jìn)行考察，結(jié)果用50 mL 1%鹽酸甲醇溶液提取30 min藥材樣品即可提取完全，且雜質(zhì)較少。筆者分別以乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（28∶72，V/V）和乙腈-磷酸鹽緩沖液（含20 mmol/L磷酸二氫鉀、10 mmol/L二乙胺、0.1%磷酸）（28∶72，V/V）為流動相所得的供試品色譜峰分離度均能達(dá)到要求；其中，正文收載的流動相所得到的色譜峰形相對較好。筆者對脫氫卡維丁進(jìn)行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)有2個(gè)較大的紫外吸收峰，最強(qiáng)吸收峰在274 nm，次強(qiáng)吸收峰在347 nm；但采用274 nm作為檢測波長時(shí)，雜質(zhì)干擾較多，故最終選用347 nm作為檢測波長。

綜上所述，本研究所建標(biāo)準(zhǔn)可用于毛黃堇藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)評價(jià)。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：303.

[2]南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典：上冊[M].2版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2006：105.

[3]中國科學(xué)院四川分院中醫(yī)中藥研究所.四川中藥志：第1冊[M].1982年版.成都：四川人民出版社，1982：52.

[4]葉勇，黃秋潔，劉華鋼.高效液相色譜法測定不同來源巖黃連中不同部位脫氫卡維丁含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2015，34（1）：99-101.

[5]吳楊，陸兔林，季德，等.巖黃連中生物堿的分離和結(jié)構(gòu)鑒定[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，31（1）：81-83.

[6]葉勇，黃秋潔，劉華鋼.超濾法測定脫氫卡維丁的血漿蛋白結(jié)合率[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2015，35（1）：12-15.

[7]龔志強(qiáng)，謝麗莎，黃茂春.HPLC測定廣西4個(gè)產(chǎn)地野生巖黃連藥材中脫氫卡維丁的含量[J].中國醫(yī)藥指南，2013，11（3）：480-481.

[8]胡芳，陸兔林，毛春芹，等.HPLC測定巖黃連生物總堿中脫氫卡維丁、鹽酸巴馬汀和鹽酸小檗堿[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：68-71.

[9]程華，熊斌，丁碧軍，等.RP-HPLC法測定巖黃連注射液中脫氫卡維丁的含量[J].中國藥房，2008，19（33）：2601-2602.

[10]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：57、103、202、204.

Study on Quality Standard of Corydalis tomentella

WU Jia1，HU Juanjuan2，ZHANG Dewei3（1.Chongqing Institute for Food and Drug Control，Chongqing 401121，China；2.TCM College，Chongqing Medical and Pharmaceutical College，Chongqing 401331，China；3.Wanzhou Institute for Food and Drug Control，Chongqing 404000，China）

OBJECTIVE：To establish the quality standard of Corydalis tomentella.METHODS：The medicinal material was identified in respects of property，microscopic characteristics and TLC.The contents of moisture，total ash and water soluble extract were determined.The content of dehydrocavidine was determined by HPLC.The determination was performed on Agilent C18column with mobile phase consisted of acetonitrile-phosphate buffer solution（containing 20 mmol/L monopotassium phosphate，10 mmol/L diethylamine，0.1%phosphoric acid）（28∶72，V/V）at the flow rate of 1.0 mL/min.The detection wavelength was set at 347 nm，and the column temperature was 35℃.The sample size was 10μL.RESULTS：The original plant is perennial herbs.The medicinal material often shrank into a ball.The main root was in conical shape；the rhizomes and roots were distinctly chapped；leaves curled and broken，and flowers were yellowish-white.The pollen grains were round-like in shape；square and columnar crystals were found；there were a large number of nonglandular hairs.The bordered pit，threaded and reticulate catheter were found；wood fiber was also found.TLC spots were clear and well-separated.The content of moisture were 7.5%-18.5%，total ash were 20.5%-26.2%，and extract were 29.9%-46.4%.The linear range of dehydrocavidine were 0.040 08-2.404 8 μg（r＝0.999 9）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2.0%.The recoveries were 95.6%-102.5%（RSD＝2.3%，n＝9）.CONCLUSIONS：The established standard can be used for quality evaluation of C.tomentella.

Corydalis tomentella；Quality standard；TLC；HPLC；Dehydrocavidine

R927

A

1001-0408（2017）33-4695-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.33.24

國家科技重大專項(xiàng)課題（No.2014ZX09304307）

＊主管中藥師。研究方向：中藥質(zhì)量檢驗(yàn)及標(biāo)準(zhǔn)起草、化學(xué)成分分析。E-mail：37358772@qq.com

#通信作者：講師。研究方向：中藥化學(xué)成分分析。E-mail：4651520@qq.com

（編輯：張 靜）

2017-05-09

2017-07-03）