退化與正常山核桃林土壤細(xì)菌多樣性比較研究

李 皓，董建華，董建明，袁紫倩，胡俊靖，趙偉明

退化與正常山核桃林土壤細(xì)菌多樣性比較研究

李 皓1，董建華1，董建明2，袁紫倩1，胡俊靖1，趙偉明1

（1. 杭州市林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310022；2. 杭州市臨安區(qū)林業(yè)局，浙江 杭州 311300）

2014年10月，在浙江省臨安市選擇4個(gè)退化山核桃Carya cathayensis林樣地和2個(gè)正常山核桃林樣地，采土樣后用16SrDNA測(cè)序技術(shù)分析兩種林地土壤細(xì)菌多樣性。結(jié)果表明，6個(gè)樣地土壤細(xì)菌共有36門(mén)75綱96目224科924屬。在門(mén)的水平上，退化和正常林地細(xì)菌主要類(lèi)群基本一致，主要類(lèi)群有變形菌門(mén)Proteobacteria，酸桿菌門(mén) Acidobacteria，擬桿菌門(mén) Bacteroidetes，綠彎菌門(mén) Chloroflexi，厚壁菌門(mén) Firmicutes，疣微菌門(mén)Verrucomicrobia，放線菌門(mén)Actinobacteria和浮霉菌門(mén)Planctomycetes，但不同林地中各類(lèi)群相對(duì)豐度明顯不同；在屬的水平上，退化和正常林地差別很大。Alpha多樣性分析顯示，6個(gè)樣地 Shannon指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)的排序各不相同，分析說(shuō)明山核桃林退化程度與土壤細(xì)菌數(shù)量和多樣性無(wú)關(guān)。相關(guān)分析結(jié)果表明，ACE指數(shù)與交換性H+顯著相關(guān)，其余土壤物理化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性。

山核桃；退化；土壤細(xì)菌群落；16SrDNA測(cè)序；多樣性

山核桃Carya cathayensis是我國(guó)特有的木本油料樹(shù)種，主要分布在浙皖交界的天目山地區(qū)，包括浙江臨安及安徽寧國(guó)等縣市，其果實(shí)富含不飽和脂肪酸和礦物質(zhì)，可加工為干果食用，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高。近年來(lái)，為了追求高產(chǎn)，林農(nóng)大量使用化肥和化學(xué)除草劑使許多山核桃林地出現(xiàn)退化現(xiàn)象，植株生長(zhǎng)不良、枝條死亡，產(chǎn)量大幅下降，甚至整片林分死亡。

土壤細(xì)菌是土壤環(huán)境的重要組成部分，參與土壤中物質(zhì)轉(zhuǎn)換和能量傳遞。土壤中細(xì)菌的種類(lèi)、數(shù)量和分布影響著土壤肥力、植物營(yíng)養(yǎng)及土壤中有毒物質(zhì)降解，同時(shí)在促進(jìn)土壤生態(tài)恢復(fù)方面發(fā)揮著重要作用，土壤細(xì)菌的生物多樣性越豐富，越有利于土壤的可持續(xù)利用和抗壓力[1-2]。

16SrDNA測(cè)序以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，直接從環(huán)境樣品中提取全部微生物的DNA，構(gòu)建 16SrDNA文庫(kù)，利用高通量測(cè)序技術(shù)分析樣品所包含的全部微生物的群體基因組成及功能和參與的代謝通路，解讀微生物群體的多樣性與豐度，探求微生物與環(huán)境之間的關(guān)系[3-4]。

本研究采用 16SrDNA測(cè)序分析技術(shù)分析退化山核桃林和正常山核桃林土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，研究山核桃生長(zhǎng)不良及土壤環(huán)境變化對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，為山核桃退化林地的土壤管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于浙江省臨安市龍崗鎮(zhèn)林坑村，119°05′35.1″ E，30°09′27.6″ N，亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，氣候溫和，雨量充足，年平均氣溫15.8℃，年平均日照1 939 h，無(wú)霜期234 d。研究區(qū)內(nèi)山核桃林普遍為人工純林，株行距5 m×6 m，300株·hm-2。林農(nóng)通常在林地內(nèi)使用大量化肥和化學(xué)除草劑，使多數(shù)山核桃林出現(xiàn)不同程度的退化，只有化肥施用量少、采用人工劈草方式經(jīng)營(yíng)的林分生長(zhǎng)健康。2014年5月，根據(jù)山核桃林分生長(zhǎng)狀況，對(duì)山核桃林進(jìn)行退化程度分級(jí)：（1）正常，山核桃長(zhǎng)勢(shì)正常良好；（2）輕度退化，葉色偏黃，頂端出現(xiàn)少量枯枝；（3）嚴(yán)重退化，多數(shù)植株樹(shù)葉稀少，頂端枯死或整株死亡。

1.2 試驗(yàn)材料

2014年10月，選擇4個(gè)退化山核桃林地（樣地1，樣地2，樣地3，樣地4）和2個(gè)正常林地（樣地5和樣地6），每個(gè)樣地面積為666.67 m2，樣地基本情況見(jiàn)表1。

在每個(gè)樣地內(nèi)隨機(jī)設(shè)5個(gè)采樣點(diǎn)，去除表面雜草和浮土，采集0 ～ 20 cm 土層中的土壤，將每個(gè)樣地5個(gè)樣點(diǎn)采樣土壤充分混合后，一部分用聚乙烯袋密封，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃冰箱中保存，另一部分樣品自然風(fēng)干，用于測(cè)定土壤化學(xué)性質(zhì)，樣地土壤基本性質(zhì)見(jiàn)表2。

表1 樣地基本情況Table1 Information of 6 sample plots

表2 不同樣地土壤基本理化性質(zhì)Table 2 Phisio-chemical properties of soil in 6 sample plots

1.3 試驗(yàn)方法

利用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)山核桃林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析鑒定。所有樣品細(xì)菌基因組 DNA提取和16S rDNA擴(kuò)增與測(cè)序工作委托生工生物工程（上海）有限公司完成。實(shí)驗(yàn)流程：對(duì)提取到的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，查看基因組DNA的完整性與濃度。利用Qubit2.0DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)需加入的DNA量。PCR所用的引物已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的通用引物。PCR結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（cat：SK8131）對(duì)DNA進(jìn)行回收?；厥债a(chǎn)物用Qubit2.0定量，根據(jù)測(cè)得的DNA濃度，將所有樣品按照1:1的比例進(jìn)行混合，混合后充分震蕩均勻，用于后續(xù)的樣品建庫(kù)（加測(cè)序標(biāo)簽）與測(cè)序。

測(cè)序分析流程：采用Flash軟件融合雙末端序列，而后通過(guò)各樣品barcode使數(shù)據(jù)回歸樣品，并對(duì)各樣本序列做 QC。去除非靶區(qū)域序列及嵌合體，采用 RDPclassifier將序列進(jìn)行物種分類(lèi)，根據(jù)序列間的距離對(duì)多條序列進(jìn)行聚類(lèi)，把序列之間的相似性作為域值分成操作分類(lèi)單元（OTU）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用不同分類(lèi)水平的OTU分析，說(shuō)明山核桃林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。采用Alpha多樣性分析，計(jì)算Shannon指數(shù)，ACE指數(shù)，Chao1指數(shù)，Coverage等，衡量每個(gè)樣本的物種多樣性[5]。使用SPSS 19.0對(duì)不同樣地土壤化學(xué)性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 退化山核桃林地和正常山核桃林地土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

通過(guò)OTU分析得出，在相似水平為97%的條件下，6個(gè)樣地中土壤細(xì)菌共有36門(mén)75綱96目224科924屬。在門(mén)的分類(lèi)水平上，退化山核桃林地和正常山核桃林地主要類(lèi)群基本一致，其中變形菌門(mén) Proteobacteria，酸桿菌門(mén) Acidobacteria，擬桿菌門(mén) Bacteroidetes，綠彎菌門(mén) Chloroflexi，厚壁菌門(mén) Firmicutes，疣微菌門(mén)Verrucomicrobia，放線菌門(mén)Actinobacteria和浮霉菌門(mén)Planctomycetes為主要類(lèi)群，詳見(jiàn)表3。

表3 不同樣地土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)門(mén)相對(duì)豐度Table 3 Relative abundance of dominant phylum in 6 sample plots

對(duì)正常樣地中相對(duì)豐度超過(guò)1%的細(xì)菌主要門(mén)類(lèi)進(jìn)行分析，與退化林地的相比，在生長(zhǎng)良好的山核桃林地中變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高，酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度較低，不同樣地中存在一定數(shù)量的無(wú)法分類(lèi)的類(lèi)群。在屬的水平上，退化山核桃林地中，紅游動(dòng)菌屬 Rhodoplanes，慢生根瘤菌屬 Bradyrhizobium，Rhizomicrobium，長(zhǎng)繩菌屬Longilinea，Gp1，Gp2和Gp3為主要類(lèi)群。在嚴(yán)重退化的樣地1和樣地2中，Meniscus和Levilinea相對(duì)豐度較高，在輕度退化的樣地3和樣地4中，Gemmatimonas相對(duì)豐度高于嚴(yán)重退化林地，Rhizomicrobium相對(duì)豐度低于嚴(yán)重退化林地。生長(zhǎng)良好的樣地5和樣地6中的主要類(lèi)群與退化山核桃林完全不同，Gp6，Sphingomonas，Nitrospira，Gp10，Alcaligenes，Providencia，Pseudomonas和Paenibacillus相對(duì)豐度較高，結(jié)果見(jiàn)表4。

2.2 不同山核桃林地土壤細(xì)菌Alpha多樣性分析

根據(jù)Alpha多樣性分析顯示（表5），6個(gè)樣地Shannon多樣性指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地3＞樣地2＞樣地1＞樣地4＞樣地6，說(shuō)明樣地5土壤細(xì)菌物種多樣性最豐富，6號(hào)樣地物種多樣性最低；ACE多樣性指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地3＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6；Chao1多樣性指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地1＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6，說(shuō)明樣地1和樣地3土壤細(xì)菌物種總數(shù)最多，樣地6物種總數(shù)最少。綜合3種多樣性指數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)山核桃林地土壤細(xì)菌多樣性與山核桃退化程度無(wú)關(guān)，退化林地的土壤細(xì)菌多樣性并不低于正常林地。

表4 不同樣地細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬相對(duì)豐度Table 4 Relative abundance of genera in 6 sample plots

表5 不同樣地土壤細(xì)菌Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)Table 5 Alpha diversity analysis on soil bacteria in 6 sample plots

2.3 土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性相關(guān)分析

對(duì)不同山核桃林地土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)表6。ACE指數(shù)與交換性H+之間呈顯著相關(guān)，其余土壤理化性質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌多樣性指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性。

表6 山核桃林地土壤理化性質(zhì)與細(xì)菌多樣性的相關(guān)分析Table 6 Correlation analysis on soil physiochemical properties and bacteria diversity

3 討論

3.1 山核桃林退化與土壤理化性質(zhì)

山核桃林退化是由林地土壤問(wèn)題導(dǎo)致的。土壤的酸化、養(yǎng)分供應(yīng)不平衡使山核桃的生長(zhǎng)受到制約，出現(xiàn)根系、枝條死亡，嚴(yán)重退化的林地甚至?xí)霈F(xiàn)大量單株枯死的現(xiàn)象。山核桃適宜的土壤pH值通常在6.0左右[7]，本研究中正常林地的pH值分別為5.73和6.08，退化山核桃林地土壤pH值低于正常林地，土壤交換性酸高于正常林地，說(shuō)明退化林土壤都有一定程度的酸化。表1中堿解氮、速效磷、速效鉀和有機(jī)質(zhì)的數(shù)據(jù)說(shuō)明，退化林地土壤中氮素積累過(guò)多，部分退化林地中磷和鉀不足，有機(jī)質(zhì)含量不高。

3.2 山核桃林退化與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

6個(gè)樣地中共發(fā)現(xiàn)36門(mén)75綱96目224科924屬細(xì)菌，在門(mén)的水平上，退化山核桃林與正常山核桃林主要類(lèi)群基本一致，但不同門(mén)的相對(duì)豐度明顯不同，正常林地中變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高，酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度較低，這可能與土壤 pH值相對(duì)較高有關(guān)。在屬的分類(lèi)水平上，退化林與正常山核桃林優(yōu)勢(shì)屬差別很大，退化林地細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬有紅游動(dòng)菌屬，慢生根瘤菌屬，長(zhǎng)繩菌屬等，這些屬在正常林地中不是優(yōu)勢(shì)屬。正常山核林樣地之間細(xì)菌優(yōu)勢(shì)屬也有所不同，可能與2塊樣地土壤類(lèi)型不同有關(guān)。研究顯示，山核桃林地中還存在許多不能分類(lèi)的類(lèi)群，仍需對(duì)山核桃林地土壤細(xì)菌生態(tài)功能及山核桃生長(zhǎng)的作用開(kāi)展研究，以期通過(guò)管理和調(diào)控土壤微生物，為山核桃生長(zhǎng)提供良好的土壤環(huán)境，有效解決山核桃林地退化問(wèn)題。

降香Dalbergia odorifera，香蕉Musa nana，蘋(píng)果Malus pumila和白皮松Pinus bunging等植物的土壤中，多樣性較好的土壤微生物群落有利于植物的生長(zhǎng)，促進(jìn)植物營(yíng)養(yǎng)吸收，增強(qiáng)抗病性[8-12]。本研究中，山核桃林地土壤細(xì)菌多樣性與退化程度無(wú)關(guān)，生長(zhǎng)良好的山核桃林地土壤細(xì)菌多樣性也有低于生長(zhǎng)不好的林地，可能是林農(nóng)在生長(zhǎng)不良的林地內(nèi)施用了更多的化肥，改變了土壤肥力，同時(shí)也對(duì)土壤細(xì)菌多樣性產(chǎn)生了影響。

4 結(jié)論

（1）6個(gè)樣地土壤共發(fā)現(xiàn)36門(mén)75綱96目224科924屬細(xì)菌，在細(xì)菌門(mén)的水平上，退化與正常山核桃林主要類(lèi)群基本一致，但不同門(mén)細(xì)菌相對(duì)豐度明顯不同，正常林地中變形菌門(mén)相對(duì)豐度較高，酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度較低。在屬的水平上，生長(zhǎng)良好的林地中的主要細(xì)菌屬與退化山核桃林差異很大。

（2）Alpha多樣性分析顯示，6個(gè)樣地Shannon指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地3＞樣地2＞樣地1＞樣地4＞樣地6，ACE指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地3＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6，Chao1指數(shù)排序?yàn)闃拥?＞樣地1＞樣地5＞樣地2＞樣地4＞樣地6。

（3）只有ACE指數(shù)與交換性H+之間呈顯著相關(guān)，其余土壤化學(xué)性質(zhì)指標(biāo)與細(xì)菌多樣性指數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性。

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Comparison on Soil Bacteria Diversity between Degrated and Healthy Carya cathayensis Forests

LI Hao1，DONG Jian-hua1，DONG Jian-ming2，YUAN Zi-qian1，HU Jun-jing1，ZHAO Wei-ming1
（1. Hangzhou Forestry Academy of Zhejiang, Hangzhou 310022, China; 2. Lin'an Forestry Bureau of Zhejiang, Hangzhou 311300, China）

Four sample plots in degraded Carya cathayensis stand and 2 in normal ones were established in October 2014 in Lin’an district, Zhejiang province. Soil samples were sequenced by 16SrDNA for comparison on bacteria community diversity of different sample plots. The results indicated that there were 924 genera of 224 families and 36 phylums, 75 classes, 96 orders in sampled plots. The main phylums were the same in the tested plots, included Proteobacteria, Acidobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Firmicutes, Verrucomicrobia, Actinobacteria and Planctomycetesbut with different relative abundance . The distribution of main genera had great difference between degraded and normal plots. The Shannon index, the ACE index and Chao1 index showed that it had no relationship between degradation of sampled stands with bacteria richness and diversity. Correlation analysis demonstrated that ACE index had evident relation with H+, the other physiochemical properties of the tested had no significant correlation with bacteria diversity index.

Carya cathayensis; degraded; soil bacteria community; 16SrDNA sequencing; diversity

S664.1

A

1001-3776（2017）05-0042-06

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.05.007

2017-03-21；

2017-08-13

浙江省林業(yè)科研成果推廣項(xiàng)目（2013B13）

李皓，工程師，從事經(jīng)濟(jì)林研究；E-mail：38761202@qq.com。