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    雷帕霉素對衰老細胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因的調(diào)控作用觀察

    2017-12-12 01:37:40劉佐君劉寶華孟凡彪
    山東醫(yī)藥 2017年42期
    關(guān)鍵詞:雷帕節(jié)律霉素

    劉佐君,劉寶華,孟凡彪

    (深圳大學(xué),廣東深圳518060)

    雷帕霉素對衰老細胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因的調(diào)控作用觀察

    劉佐君,劉寶華,孟凡彪

    (深圳大學(xué),廣東深圳518060)

    目的觀察雷帕霉素對衰老細胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因的調(diào)控作用。方法通過傳代誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞復(fù)制性衰老,獲得衰老的人皮膚成纖維細胞。加入50%的馬血清刺激誘導(dǎo)細胞同步化,將細胞分為觀察組和對照組,分別加入100 mmol/L的雷帕霉素和DMSO培養(yǎng)24 h。采用熒光定量PCR法檢測生物節(jié)律關(guān)鍵基因芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3(BMAL1)、節(jié)律周期蛋白2(PER2)、藍光受體蛋白1(CRY1)、孤兒核受體α(Rev-erbα)、孤核受體α(Rorα)mRNA表達,利用JTK-CYCLE軟件分析各基因的節(jié)律周期,Western blotting法檢測BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達。結(jié)果觀察組PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達高于對照組(P均<0.05)。對照組BMAL1、CRY1、Rev-erbα、Rorα基因的節(jié)律周期為24 h,PER2基因的節(jié)律周期為28 h。觀察組BMAL1、CRY1、Rorα基因的節(jié)律周期為24 h,Rev-erbα基因的節(jié)律周期為27.5 h,PER2的節(jié)律周期為24 h。觀察組CRY1蛋白表達高于對照組(P<0.05),PER2蛋白表達低于對照組(P<0.05),兩組BMAL1 mRNA及蛋白表達比較無統(tǒng)計學(xué)差異。結(jié)論雷帕霉素可以提高衰老的人皮膚成纖維細胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的表達,縮短PER2的節(jié)律周期,對紊亂的節(jié)律鐘功能具有調(diào)控作用。

    生物節(jié)律;雷帕霉素;生物節(jié)律關(guān)鍵基因;芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3;節(jié)律周期蛋白2;藍光受體蛋白1;孤兒核受體α;孤核受體α;哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

    生物節(jié)律是生物為了適應(yīng)外界環(huán)境(如光照、溫度以及營養(yǎng)物質(zhì)等)而產(chǎn)生的內(nèi)在的、具有節(jié)律性的生命活動。人體的許多生理活動都具有生物節(jié)律,包括體溫、睡眠、激素分泌、代謝以及免疫系統(tǒng)等。生物節(jié)律紊亂不僅會導(dǎo)致一系列的代謝疾病如糖尿病、肥胖等,而且與衰老以及衰老相關(guān)的心血管疾病等的發(fā)生息息相關(guān)[1,2]。研究[3,4]顯示,生物節(jié)律關(guān)鍵基因芳烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白3(BMAL1)和節(jié)律調(diào)控蛋白(CLOCK)缺失會導(dǎo)致小鼠壽命縮短,并且伴隨出現(xiàn)早衰的相關(guān)表型。人體的生物節(jié)律由兩個主要的反饋環(huán)調(diào)節(jié),其中一個反饋環(huán)是由BMAL1和CLOCK形成的異源二聚體激活下游的節(jié)律周期蛋白(PERs)和藍光受體蛋白(CRYs)基因家族,PERs和CRYs基因反饋抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性,形成一個負反饋調(diào)控環(huán);BMAL1還可以激活孤兒核受體(Rev-erb)和孤核受體(Ror)基因家族,Rev-erb和Ror基因反饋抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性,形成另外一個反饋環(huán)。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是一類進化保守的絲氨酸/蘇氨酸類的蛋白激酶,與壽命有關(guān),可以直接調(diào)控生物節(jié)律。抑制mTOR信號通路可以延長酵母[5]、線蟲[6]、果蠅[7]、老鼠的壽命[8]。2015年1月~2017年1月,我們利用mTOR抑制劑雷帕霉素處理衰老的人皮膚成纖維細胞,檢測細胞內(nèi)生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、節(jié)律周期蛋白2(PER2)、CRY1、Rev-erbα、Rorα的表達變化,探討雷帕霉素對衰老細胞生物節(jié)律的調(diào)控作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人皮膚成纖維細胞由本實驗室凍存。胎牛血清(FBS)購自PAN-Biotech公司,雷帕霉素、巴佛洛霉素A1和氯喹購自Sigma公司,TRIzol和馬血清購自Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自大連寶生物公司,PER2、CRY1、BMAL1抗體購自Abcam公司,細胞β-Galactosidase染色試劑盒購自Cell Signaling Technology公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)與分組處理 向人皮膚成纖維細胞中加入含有10% FBS、100 μg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基。通過傳代(從第16代培養(yǎng)到第30代)誘導(dǎo)細胞的復(fù)制性衰老,并通過β-gal染色確定細胞衰老。β-gal染色陽性(呈藍色)細胞為衰老細胞。經(jīng)測定,第30代細胞β-gal染色陽性細胞比例為60%±6%,符合實驗要求。細胞生長到100%的細胞密度后,加入50%的馬血清處理2 h誘導(dǎo)細胞同步化。將細胞分為兩組,觀察組加入100 mmol/L雷帕霉素,對照組加入DMSO。培養(yǎng)24 h后開始取樣,每隔4 h取樣1次,共取6次。

    1.3 細胞內(nèi)BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達檢測 采用熒光定量PCR法。馬血清處理24 h后開始收集樣品,分別收集24、28、32、36、40、44 h的細胞樣品。向細胞中加入TRIzol裂解液,提取mRNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物序列:BMAL1上游引物5′-CATTAAGAGGTGCCACCAATCC-3′,下游引物5′-TCATTCTGGCTGTAGTTGAGGA-3′;CRY1上游引物5′-CTCCTCCAATGTGGGCATCAA-3′,CRY1下游引物5′-CCACGAATCACAAACAGACGG-3′;PER2上游引物5′-CTTCAGCGATGCCAAGTTTGT-3′,PER2下游引物5′-CGGATTTCATTCTCGTGGCTTT-3′;Rev-erbα上游引物5′-TCATGCTTGCGAAGGCTGTAA-3′,Rev-erbα下游引物5′-CGCTTAGGAATACGACCAAACC-3′;Rorα上游引物5′-TGCGAGGAACAATAGACCCAA-3′,Rorα下游引物5′-ATGGCCTATGTGTGCGTTGTA-3′。PCR反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min;60 ℃ 15 s;72 ℃ 20 s;72 ℃ 5 min。熒光定量PCR通過BIO-RAD CFX ConnectTMReal-time PCR儀器進行檢測和分析。讀取基因擴增的Ct值,以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。利用JTK-CYCLE軟件分析各基因的相對震蕩幅度和節(jié)律周期[13]。

    1.4 細胞內(nèi)PER2、CRY1、BMAL1蛋白表達檢測 采用Western blotting法。馬血清處理24 h后開始收集樣品,分別收集24、28、32、36、40、44 h的細胞樣品。向細胞中加入SDS上樣緩沖液裂解,煮沸10 min。經(jīng)過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜到含有正電荷的PVDF膜。經(jīng)過TBST含有5%的脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗4 ℃過夜,TBST沖洗,加入羊抗兔的二抗孵育1 h,TBST沖洗,化學(xué)發(fā)光顯影。利用Image J軟件對蛋白條帶進行半定量分析,以目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達量。

    2 結(jié)果

    2.1 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的相對震蕩幅度比較 觀察組BMAL1 mRNA的相對震蕩幅度與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異,PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的相對震蕩幅度較對照組升高(P<0.05或<0.01)。見表1。

    表1 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA相對震蕩幅度比較

    注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    2.2 兩組BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的節(jié)律周期比較 對照組BMAL1、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA的節(jié)律周期為24 h,PER2 mRNA的節(jié)律周期為28 h;觀察組BMAL1、CRY1、Rorα mRNA的節(jié)律周期為24 h,Rev-erbα mRNA的節(jié)律周期為27.5 h,PER2 mRNA的節(jié)律周期縮短到24 h。

    2.3 兩組BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達水平比較 觀察組PER2蛋白表達低于對照組,CRY1蛋白表達高于對照組,BMAL1蛋白表達無明顯變化。見表2。

    表2 兩組BMAL1、PER2、CRY1蛋白表達水平比較

    注:與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    3 討論

    生物節(jié)律控制著人體的睡眠、覺醒、進食等生理活動。生物節(jié)律紊亂會導(dǎo)致多種疾病的產(chǎn)生。機體衰老伴隨著生物節(jié)律功能的失調(diào),最明顯的就是老年人的睡眠質(zhì)量和睡眠規(guī)律性下降。Chang等[9]研究認為,衰老導(dǎo)致生物節(jié)律功能失調(diào)的分子機制可能是由生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα表達水平以及震蕩幅度降低所致。研究顯示,生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、CLOCK突變會導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)早衰的表型[3,4]。因此,上調(diào)生物節(jié)律基因表達可能有助于提高生物節(jié)律基因的震蕩幅度,進一步恢復(fù)老年人的生物節(jié)律功能。研究[10~13]顯示,mTOR與生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1有相互調(diào)控的關(guān)系,mTOR下游的蛋白質(zhì)激酶S6K1磷酸化BMAL1,BAML1的磷酸化修飾進一步調(diào)控真核細胞的翻譯過程。抑制mTOR信號通路可以顯著延長酵母、線蟲、果蠅、老鼠的壽命,但是否可以影響人衰老細胞的生物節(jié)律尚無定論。

    雷帕霉素是mTOR的抑制劑,雖然mTOR信號通路調(diào)控生物節(jié)律的研究已經(jīng)有相關(guān)的報道,但是直接利用雷帕霉素處理衰老細胞以及在動物體內(nèi)的研究還鮮有報道。節(jié)律基因的震蕩幅度是研究生物節(jié)律的一個重要指標(biāo),其主要表示一個節(jié)律周期內(nèi)基因的最高表達量與最低表達量的相對比值。節(jié)律鐘關(guān)鍵基因BMAL1和CLOCK突變都會導(dǎo)致節(jié)律基因的震蕩幅度的喪失[3,4]。而衰老老鼠的節(jié)律鐘基因的震蕩幅度是降低的[9]。本研究通過傳代獲得衰老的人皮膚成纖維細胞,加入mTOR抑制劑雷帕霉素,發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠上調(diào)生物節(jié)律關(guān)鍵基因PER2、CRY1、Rev-erbα、RORα mRNA的震蕩幅度,這表明雷帕霉素可能有助于延緩衰老導(dǎo)致的生物節(jié)律功能的下降;從蛋白質(zhì)水平上,雷帕霉素處理顯著降低了PER2蛋白的表達。由于PER2可以與BMAL1直接相互作用,并且抑制BMAL1的轉(zhuǎn)錄活性,因此雷帕霉素處理導(dǎo)致PER2蛋白表達降低,進一步解除了PER2對BMAL1下游基因的抑制作用,從而導(dǎo)致PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα mRNA表達上升。

    衰老會伴隨生物節(jié)律周期的延長,年輕老鼠的生物節(jié)律周期約為23.6 h,而老年老鼠約為24 h[9]。本研究顯示,衰老的人皮膚成纖維細胞PER2 mRNA的節(jié)律周期大于24 h,而雷帕霉素處理可以縮短PER2的節(jié)律周期。雷帕霉素能夠降低PER2蛋白表達,由于PER2蛋白穩(wěn)定性的降低會明顯縮短節(jié)律的周期[14],因此雷帕霉素可能是通過加速PER2蛋白的降解進而恢復(fù)PER2的節(jié)律周期。衰老與PER2蛋白的積累有非常緊密的聯(lián)系[15],降低PER2表達可以明顯延緩衰老導(dǎo)致的造血干細胞功能下降,進而延長老鼠壽命[16],雷帕霉素對于衰老的延緩作用是否通過PER2起作用有待進一步研究。研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)過表達PER2蛋白會顯著縮短Rev-erbα基因的節(jié)律周期,并且抑制Rev-erbα基因的節(jié)律震蕩水平。本研究結(jié)果顯示,雷帕霉素處理會延長Rev-erbα基因的節(jié)律周期,增加Rev-erbα基因的節(jié)律震蕩水平。其機制可能與PER2蛋白水平降低有關(guān)[17]。

    綜上所述,雷帕霉素可以提高衰老的人皮膚成纖維細胞生物節(jié)律關(guān)鍵基因BMAL1、PER2、CRY1、Rev-erbα、Rorα的表達,而且縮短PER2的節(jié)律周期,這意味著衰老所導(dǎo)致的節(jié)律鐘功能的下降有可能被回復(fù)或逆轉(zhuǎn)。這為雷帕霉素進一步應(yīng)用于機體生物節(jié)律調(diào)控的研究提供了依據(jù)。

    [1] Hood S, Amir S. The aging clock: circadian rhythms and later life[J]. J Clin Invest, 2017,127(2):437-446.

    [2] Sahar S, Sassone-Corsi P. Metabolism and cancer: the circadian clock connection[J]. Nat Rev Cancer, 2009,9(12):886-896.

    [3] Dubrovsky YV, Samsa WE, Kondratov RV. Deficiency of circadian protein CLOCK reduces lifespan and increases age-related cataract development in mice[J]. Aging (Albany NY), 2010,2(12):936-944.

    [4] Kondratov RV, Kondratova AA, Gorbacheva VY, et al. Early aging and age-related pathologies in mice deficient in BMAL1, the core componentof the circadian clock[J]. Genes Dev, 2006,20(14):1868-1873.

    [5] Bjedov I, Toivonen JM, Kerr F, et al. Mechanisms of life span extension by rapamycin in the fruit fly Drosophila melanogaster[J]. Cell Metab, 2010,11(1):35-46.

    [6] Vellai T, Takacs-Vellai K, Zhang Y, et al. Genetics: influence of TOR kinase on lifespan in C. elegans[J]. Nature, 2003,426(6967):620.

    [7] Harrison DE, Strong R, Sharp ZD, et al. Rapamycin fed late in life extends lifespan in genetically heterogeneous mice[J]. Nature, 2009,460(7253):392-395.

    [8] Powers RW 3rd, Kaeberlein M, Caldwell SD, et al. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling[J]. Genes Dev, 2006,20(2):174-184.

    [9] Chang HC, Guarente L. SIRT1 mediates central circadian control in the SCN by a mechanism that decays with aging[J]. Cell, 2013,153(7):1448-1460.

    [10] Lipton JO, Yuan ED, Boyle LM, et al. The circadian protein BMAL1 regulates translation in response to S6K1-mediated phosphorylation[J]. Cell, 2015,161(5):1138-1151.

    [11] Khapre RV, Kondratova AA, Patel S, et al. BMAL1-dependent regulation of the mTOR signaling pathway delays aging[J]. Aging (Albany NY), 2014,6(1):48-57.

    [12] Cao R, Li A, Cho HY, et al. Mammalian target of rapamycin signaling modulates photic entrainment of the suprachiasmatic circadian clock[J]. J Neurosci, 2010,30(18):6302-6314.

    [13] Matsumoto CS, Almeida LO, Guimaraes DM, et al. PI3K-PTEN dysregulation leads to mTOR-driven upregulation of the core clock gene BMAL1 in normal and malignant epithelial cells[J]. Oncotarget, 2016,7(27):42393-42407.

    [14] Toh KL, Jones CR, He Y, et al. An hPer2 phosphorylation site mutation in familial advanced sleep-phase syndrome[J]. Science, 2001,291(5506):1040-1043.

    [15] Asher G, Gatfield D, Stratmann M, et al. SIRT1 regulates circadian clock gene expression through PER2 deacetylation[J]. Cell, 2008,134(2):317-328.

    [16] Wang J, Morita Y, Han B, et al. Per2 induction limits lymphoid-biased haematopoietic stem cells and lymphopoiesis in the context of DNA damage and ageing[J]. Nat Cell Biol, 2016,18(5):480-490.

    [17] Chen RM, Schirmer A, Lee Y, et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism[J]. Mol Cell, 2009,36(3):417-430.

    Regulatoryeffectofrapamycinonkeygenesofcircadianrhythminsenescentcells

    LIU Zuojun, LIU Baohua, MENG Fanbiao

    (Shenzhen University, Shenzhen 518060, China)

    ObjectiveTo investigated the effect of rapamycin on the cell autonomous circadian rhythm of senescent cells.MethodsWe induced replicative senescence of human dermal fibroblasts by series passage. The senescent human dermal fibroblasts cells were identified by SA-β-gal staining. The senescent human dermal fibroblasts cells were synchronized by 50% horse serum, and treated with DMSO or 200 nmol/L rapamycin. The oscillation profiles of BMAL1, PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα were examined by fluorogenic quantitative PCR. The circadian rhythm of genes was analyzed by JTK-CYCLE software. The protein expression of BMA1, CRY1, and PER2 was detected by Western blotting.ResultsThe mRNA expression of PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα in the observation group was higher than that of the control group (allP<0.05). The biorhythm cycle of BMAL1, CRY1, Rev-erbα, and Rorα genes in the control group was 24 h, and the biorhythm cycle of PER2 gene was 28 h. The biorhythm cycle of BMAL1, CRY1, and Rorα genes in the observation group was 24 h, and the biorhythm cycle of Rev-erbα gene was 27.5 h. The expression of CRY1 protein in the observation group was significantly higher than that in the control group, while PER2 protein expression was significantly lower than that in the control group (bothP<0.05). No significant difference was found in BMAL1 mRNA and protein expression between these two groups.ConclusionRapamycin can increase the expression of BMAL1, PER2, CRY1, Rev-erbα and Rorα mRNA in the aging human dermal fibroblasts and shorten the rhythmic cycle of PER2, which plays a regulatory role in the disturbance of circadian clock function.

    biorhythm; rapamycin; key gene of biorhythm; aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator 3; PER2; cryptochrome 1; orphan nuclear receptor α; orphan nuclear receptor α; mammalian target of rapamycin

    10.3969/j.issn.1002-266X.2017.42.007

    Q419

    A

    1002-266X(2017)42-0025-04

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81601215)。

    劉佐君(1982-),男,博士后,主要研究方向為生物節(jié)律鐘調(diào)控衰老的分子機制。E-mail: ijing1982@szu.edu.cn

    2017-04-18)

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