蘋果矮化砧木GA20氧化酶基因的克隆及其表達(dá)分析

鄭伶杰，馬 宏，張 媛，張學(xué)英，李中勇，徐繼忠

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001)

利用矮化砧木嫁接品種控制樹體高度是實(shí)現(xiàn)蘋果矮化密植栽培的重要途徑之一[1]。前人對(duì)砧木矮化機(jī)理的研究主要集中在砧穗解剖結(jié)構(gòu)、同化物運(yùn)輸、相關(guān)酶活性及激素含量等方面，而在赤霉素合成的基因方面少有報(bào)道[2]。赤霉素是一種廣泛存在于植物中的二萜類化合物，能控制多種植物發(fā)育和生理過程，當(dāng)赤霉素合成被抑制或者信號(hào)傳導(dǎo)被阻遏將導(dǎo)致植株矮化。赤霉素的合成受到多種酶的調(diào)控，目前的研究表明，GA20氧化酶是植物體內(nèi)赤霉素生物合成中最重要的限速酶[3]，它能催化從GA12到GA9及GA53到GA20一系列的氧化反應(yīng)過程，形成具有生物活性的GAs。在擬南芥、玉米、水稻、小桐子、葡萄、梨等多種植物中，GA20氧化酶基因已被克隆并進(jìn)行了功能研究[4-14]，表明該基因?qū)儆谝粋€(gè)多基因家族，其功能的缺失將導(dǎo)致植株表現(xiàn)矮化性狀。

SH系是山西省農(nóng)科院果樹研究所用國光與河南海棠雜交選育而成并在華北、西北地區(qū)廣泛應(yīng)用的矮化砧木，但在河北省部分地區(qū)由于SH系抗鹽堿能力弱，容易出現(xiàn)黃化現(xiàn)象[15]。河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果課題組以SH40為母本經(jīng)自然雜交實(shí)生選育出一批新型矮化砧木，其中2號(hào)和36號(hào)表現(xiàn)出控制品種樹體矮化、早花早果性良好等特點(diǎn)。因此，本試驗(yàn)以新型矮化砧木2號(hào)和36號(hào)為試材，設(shè)計(jì)特異引物利用RT-PCR法克隆GA20氧化酶基因cDNA的CDS序列，并分析該基因的生物信息學(xué)特征以及在不同時(shí)期砧木和嫁接品種內(nèi)GA20氧化酶基因的表達(dá)情況，以期為矮化機(jī)理的研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

試材取自河北省保定市河北農(nóng)業(yè)大學(xué)蘋果試驗(yàn)園。試驗(yàn)材料為蘋果矮化砧木2號(hào)/八棱海棠、36號(hào)/八棱海棠，以及砧穗組合天紅2號(hào)/2號(hào)/八棱海棠、天紅2號(hào)/36號(hào)/八棱海棠，分別用于GA20ox1基因的克隆及表達(dá)分析。

多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒購于北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNA Marker、克隆載體pMD19-T等購于大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞等購于上海生工生物工程股份有限公司，其他試劑均為普通國產(chǎn)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 矮化砧木總RNA的提取及cDNA第一條鏈的合成 于2015年6月5日采集2號(hào)和36號(hào)砧木莖尖的幼嫩葉片，經(jīng)液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱中。將試驗(yàn)材料按照總RNA提取試劑盒和cDNA第一鏈合成試劑盒的使用說明書提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，以檢測(cè)RNA的完整性。

1.2.2 GA20氧化酶基因(GA20ox1)編碼序列的克隆與鑒定 參照NCBI上已發(fā)表物種的GA20氧化酶基因序列，利用基因的保守性設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物F：5′-CCTCCTCCCCCAACTCACATAC-3′和R：5′- TCAGGCCTACCACCTCTGTTC-3′，采用RT-PCR方法擴(kuò)增試材中GA20ox1基因開放閱讀框(ORF)序列的全長。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火 35 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)后，切膠回收并連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)菌液PCR鑒定藍(lán)白斑篩選后，挑取陽性克隆送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用 DNAMAN軟件對(duì)所測(cè)得的核苷酸序列進(jìn)行拼接和翻譯成蛋白質(zhì)，將氨基酸序列與其他已知物種的進(jìn)行比對(duì)，使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建；運(yùn)用ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)、SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)等在線軟件分析編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)；在NCBI BlastN、NetPhos(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和ExPASy Prosite(http：//prosite.expasy.org/)中進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域、磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測(cè)和功能位點(diǎn)的分析；SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行分泌蛋白分析，用WOLF PSORT (http：//www.genscript.com/wolf-psort.html)軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；提交到 SWISS MODEL (http：//www.swissmodel.expasy.org/)程序進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)同源模擬。

1.2.4GA20ox1基因在矮化砧木及其上嫁接品種內(nèi)的表達(dá)分析 根據(jù)GA20ox1基因的cDNA編碼序列以β-actin基因?yàn)閮?nèi)參設(shè)計(jì)一對(duì)引物(表1)，對(duì)矮化砧木2號(hào)和36號(hào)及其上嫁接品種天紅2號(hào)進(jìn)行GA20ox1基因的表達(dá)分析，以八棱海棠為喬化對(duì)照，采樣時(shí)間為2015年6月5日、7月5日和8月4日。qRT-PCR反應(yīng)在 ABI 7500實(shí)時(shí)定量 PCR 儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系含有2×Ultra SYBR Mixture 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，模板cDNA 2 μL，加入滅菌蒸餾水至20 μL。反應(yīng)條件 95 ℃預(yù)變性 10 min；95 ℃變性 15 s，60 ℃退火60 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT算法分析反應(yīng)結(jié)束后熒光值變化曲線和融解曲線的結(jié)果。用SPSS V19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，Excel 2003作圖。

表1 熒光定量PCR引物

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果砧木GA20ox1基因cDNA編碼序列獲得

將蘋果砧木2號(hào)和36號(hào)的總RNA用1%瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測(cè)，獲得的RNA條帶完整清晰(圖1)，說明提取的RNA完整無降解。以總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA第1鏈為模板，用設(shè)計(jì)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，均在1 200 bp左右獲得了一條明亮的特異條帶。擴(kuò)增片段經(jīng)回收測(cè)序，確定其全長均為1 179 bp(圖2)。

圖2 PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products

2.2 蘋果砧木2號(hào)和36號(hào)GA20ox1基因序列比對(duì)

經(jīng)比對(duì)分析，2號(hào)和36號(hào)GA20ox1基因cDNA編碼序列有3個(gè)差異核苷酸，它們分別位于第279，648，1 032位。該序列與NCBI上蘋果預(yù)測(cè)的GA20ox1基因(XM_008378540.1)編碼序列對(duì)應(yīng)的同等長度序列的相似性達(dá)99.8%(圖3)。

圖3 GA20ox1基因核苷酸序列比對(duì)Fig.3 Nucleotide sequence alignment of GA20ox1

分析所獲得的cDNA編碼序列，推導(dǎo)獲得一個(gè)由393個(gè)氨基酸(包括終止密碼子)組成的蛋白序列。通過DNAMAN軟件對(duì)蘋果矮化砧木2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，2號(hào)和36號(hào)氨基酸序列相似度為100%(圖4)。

圖4 GA20ox1基因推導(dǎo)的蛋白序列比對(duì)

2.3 蘋果砧木GA20ox1基因生物信息學(xué)分析

2.3.1 GA20ox1蛋白氨基酸序列同源性及系統(tǒng)進(jìn)

化分析 利用BlastP序列比對(duì)分析結(jié)果表明，2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白氨基酸序列與其他8個(gè)物種的氨基酸序列的相似性都在80%以上。2號(hào)和36號(hào)與蘋果SH40、西洋梨、草莓、板栗、葡萄、蜜柑、茶樹、黑楊的氨基酸同源性分別為96.9%，96.8%，90.1%，88.4%，88.4%，89.5%，88.8%和88.1%。

將2號(hào)和36號(hào)的GA20ox1氨基酸序列同蘋果SH40(Malusdomestica×Malushonanensis，KC493633.1)、西洋梨(Pyruscommunis，HQ833589.1)、扁桃(Prunusdulcis，JQ412172.1)、草莓(Fragaria×Ananassa，DQ195504.1)、川桑(Morusnotabilis，XM_010110754.1)、豌豆(Pisumsativum，U70471.1)、葡萄(Vitisvinifera，NM_001280982.1)、蜜柑(Citrusunshiu，LC056054.1)、蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula，XM_003592315.2)、黑楊(Populusnigra，AB089675.1)其他14個(gè)不同物種的序列用MEGA 6.0軟件構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白的進(jìn)化符合植物學(xué)分類的規(guī)律，與同為薔薇科的蘋果SH40、西洋梨、草莓聚為同一類，之后與蒺藜苜蓿、麻風(fēng)樹和黑楊形成一個(gè)大的類群，說明它們的親緣關(guān)系比較近，而和川桑、板栗、蜜柑、茶樹等親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)(圖5)。

圖5 2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白與其他物種GA20ox1蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3.2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)分析 用ProtParam軟件預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白質(zhì)分子式為C1973H3036N524O594S22，總原子數(shù)6 149，其中絲氨酸(Ser)、亮氨酸(Leu)和賴氨酸(Lys)含量較為豐富。相對(duì)分子質(zhì)量44.3 kDa，理論等電點(diǎn)5.89，帶正電殘基(Asp+Glu)48，帶負(fù)電殘基(Asp+Lys)42。不穩(wěn)定系數(shù) 35.26小于40，脂肪系數(shù) 67.99，總平均親水性-0.453小于0，說明 GA20ox1蛋白穩(wěn)定且具有親水性。

通過SOPMA對(duì)2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白氨基酸序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明(圖6)它們都含有131個(gè)α-螺旋(33.42%)、34個(gè)β-折疊(8.67%)、149個(gè)無規(guī)則卷曲(38.01%)和78個(gè)擴(kuò)展鏈(19.9%)。用NetPhos 2.0 Server磷酸位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，GA20ox1蛋白有8處絲氨酸磷酸化位點(diǎn)、6處蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)和3處酪氨酸磷酸化位點(diǎn)。

在NCBI網(wǎng)站上將GA20ox1蛋白氨基酸序列與其他植物相比，結(jié)果表明，存在2個(gè)比較保守的結(jié)構(gòu)域，分別是與異青霉素N合成酶相關(guān)的雙加氧酶(DIOX-N)保守結(jié)構(gòu)域和2-酮戊二酸和Fe2+依賴的雙加氧酶超家族(20G-FeⅡ_Oxy)保守結(jié)構(gòu)域。利用 ExPASy Prosite 分析該蛋白質(zhì)的功能位點(diǎn)，結(jié)果進(jìn)一步表明，保守功能域?yàn)镕e2+結(jié)合域，該保守域由第258位的His、260位的Asp和314位的His殘基組成(圖7)。

h.α-螺旋；e.擴(kuò)展鏈；c.無規(guī)則卷曲；t.β-折疊。

圖7 GA20ox1蛋白保守結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)

利用WOLF PSORT，預(yù)測(cè)該蛋白的亞細(xì)胞定位情況：細(xì)胞核的定位系數(shù)為10 (nucl 10.0)，細(xì)胞質(zhì)的定位系數(shù)為2 (cyto2.0)，葉綠體的定位系數(shù)為1(chlo 1.0)，因此，推測(cè)該蛋白定位于細(xì)胞核。信號(hào)肽常指新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移(定位)N-末端的氨基酸序列[16]，Signal P預(yù)測(cè)的結(jié)果顯示該蛋白不具備信號(hào)肽，這與亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)的結(jié)果吻合。

通過SWISS MODEL程序，以擬南芥花青素雙加氧酶蛋白(PDB code：2brt.1.A)預(yù)測(cè)得到的2號(hào)和36號(hào)GA20ox1蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型如圖8所示。

2.4 蘋果砧木GA20ox1基因的熒光定量分析

由圖9可以看出，不同時(shí)期矮化砧木2號(hào)、36號(hào)和八棱海棠以及各砧木上嫁接品種內(nèi)GA20ox1基因均有表達(dá)。

各砧木內(nèi)GA20ox1基因在不同時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量有明顯差異。在6-8月份，2號(hào)砧木內(nèi)GA20ox1

圖8 GA20ox1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖中不同時(shí)期不同小寫字母表示在P<0.05水平上差異顯著。The small-letter of each time means significantly different at the P<0.05 level.

基因的相對(duì)表達(dá)量下降，6月份的相對(duì)表達(dá)量為1.71，顯著高于八棱海棠，7-8月份則均顯著低于八棱海棠。36號(hào)砧木內(nèi)GA20ox1基因在6月份的相對(duì)表達(dá)量僅為0.03，顯著低于八棱海棠，而在8月份上升到3.07，顯著高于八棱海棠。與6月份相比，八棱海棠內(nèi)GA20ox1基因的相對(duì)表達(dá)量在8月份上升到1.42。

不同時(shí)期2號(hào)、36號(hào)及八棱海棠上的品種內(nèi)GA20ox1基因的表達(dá)不同。7月份2號(hào)砧木上品種內(nèi)GA20ox1基因的相對(duì)表達(dá)量為0.74，36號(hào)砧木上的相對(duì)表達(dá)量為0.55，均顯著低于以八棱海棠為砧木的品種。8月份八棱海棠上品種內(nèi)GA20ox1基因的相對(duì)表達(dá)量為4.39，顯著高于2號(hào)砧木上品種的相對(duì)表達(dá)量3.38，而與以36號(hào)為砧木的紅富士樹體沒有差異。與7月份相比，8月份3個(gè)砧木上品種內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量均上升，并維持在較高的水平。

3 討論

本研究從蘋果矮化砧木2號(hào)和36號(hào)中首次克隆到GA20氧化酶基因，該基因CDS序列都由1 179個(gè)核苷酸組成并存在3處差異核苷酸，與蘋果全基因組預(yù)測(cè)得到的序列相似性達(dá)99.8%；均編碼一個(gè)393個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(包括終止密碼子)。通過分析氨基酸序列和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域顯示，GA20ox1蛋白具有20G-Fe Ⅱ_Oxy 超家族蛋白共有的Fe2+結(jié)合域。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，2號(hào)和36號(hào)GA20ox1與蘋果SH40的親緣性最高，達(dá)到96.9%，并且與木本高等植物的GA20氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在80%以上。需要特別指出的是，本研究得到的GA20氧化酶基因與Kusaba等[17]從富士中克隆出的GA20ox基因(Malus×domestica，AB037114.1)的氨基酸序列同源性為93.1%，存在較大差異。肖景華[18]對(duì)番茄GA20ox基因的研究表明，番茄GA20ox多基因家族由3個(gè)成員GA20ox1、GA20ox2和GA20ox3組成，編碼的氨基酸序列具有72%～76%的同源性。本試驗(yàn)試材為莖尖的幼嫩組織而Kusaba等[17]利用的是富士蘋果的種子，蘋果GA20ox基因家族的不同成員在不同組織間的特異性表達(dá)可能造成試驗(yàn)結(jié)果與已發(fā)表的蘋果基因存在較大的差異性，具體原因有待進(jìn)一步研究。

GA20氧化酶催化從GA12到GA9和GA53到GA20過程中的一系列氧化反應(yīng)，最終形成具有生物活性的赤霉素。赤霉素是調(diào)控植株高矮的重要激素，GA20氧化酶基因的表達(dá)影響了植株內(nèi)赤霉素的含量。本試驗(yàn)以實(shí)時(shí)熒光定量PCR法研究了在6-8月份蘋果矮化砧木2號(hào)、36號(hào)和對(duì)照八棱海棠以及在各砧木上嫁接紅富士品種內(nèi)GA20ox1基因的表達(dá)情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，2號(hào)砧木在6月份的GA20ox1基因表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照，在7-8月份砧木及嫁接品種的表達(dá)強(qiáng)度均顯著低于對(duì)照；36號(hào)砧木內(nèi)GA20ox1基因在6月份幾乎不表達(dá)而在7-8月份的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照，其上嫁接品種內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度在7-8月均低于對(duì)照。本研究的田間觀察發(fā)現(xiàn)，2號(hào)砧木的生長勢(shì)較弱，屬矮生型砧木；36號(hào)砧木長勢(shì)旺盛，枝條發(fā)育粗壯，屬非矮生型砧木。因此7-8月份GA20ox1基因在2號(hào)砧木內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度顯著低于對(duì)照，而在36號(hào)砧木內(nèi)的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于對(duì)照。宣利利等[19]發(fā)現(xiàn)梨矮生突變體矮1號(hào)中PcGA20ox1基因表達(dá)量顯著低于喬化對(duì)照早酥梨。GA20ox1基因在矮化砧木上嫁接的品種內(nèi)表達(dá)強(qiáng)度低于對(duì)照，說明在嫁接品種內(nèi)GA20氧化酶活性受到矮化砧木的抑制，矮化砧木沒有能力將本身合成的赤霉素傳遞到接穗中，植株內(nèi)赤霉素含量較低從而表現(xiàn)出矮化的性狀。姜志昂等[20]對(duì)嫁接在不同矮化砧木上嘎啦品種內(nèi)的MdGA20ox1基因分析得出，半矮化類型砧木 SH28 嫁接嘎啦的基因表達(dá)量均高于矮化類型 SH40 嫁接嘎啦，不同矮化砧木嫁接嘎啦MdGA20ox1 表達(dá)量與其生長量趨勢(shì)基本相同。