單萜烯物質(zhì)檢測(cè)方法建立及自選酵母KDLYS9-16對(duì)單萜烯產(chǎn)生的影響

李 艷，周立華

單萜烯物質(zhì)檢測(cè)方法建立及自選酵母KDLYS9-16對(duì)單萜烯產(chǎn)生的影響

李 艷1,2，周立華1

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

采用液液萃取法結(jié)合氣相色譜氫火焰離子檢測(cè)器建立一種可同時(shí)檢測(cè)葡萄酒中13 種游離態(tài)單萜烯類物質(zhì)的方法，并采用所建方法檢測(cè)了商品菌SC和自選菌KDLYS9-16兩種釀酒酵母發(fā)酵的河北省沙城和昌黎2 個(gè)產(chǎn)區(qū)的赤霞珠和美樂(lè)葡萄酒中的單萜烯類物質(zhì)。結(jié)果顯示，方法的R2為0.996 7～0.999 3，檢出限為0.580～1.073 mg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.58%～3.18%，回收率為89.98%～107.34%。4 種葡萄酒中的單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度都比發(fā)酵前的葡萄汁中高，尤以采用自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶釀酒酵母KDLYS9-16發(fā)酵的昌黎產(chǎn)區(qū)赤霞珠干紅葡萄酒中最高，達(dá)到2.855 mg/L，比葡萄汁中增加約3.1 倍。赤霞珠葡萄及葡萄酒中單萜烯物質(zhì)質(zhì)量濃度比美樂(lè)葡萄高，沙城產(chǎn)區(qū)的2 種葡萄汁中單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度比昌黎的高，選用不同菌種發(fā)酵的葡萄酒中單萜烯物質(zhì)質(zhì)量濃度和種類不同。綜上，本研究建立方法簡(jiǎn)單、靈敏性高、重復(fù)性好，可用于葡萄及葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)的檢測(cè)。

液液萃??；氣相色譜氫火焰離子檢測(cè)器；單萜烯類物質(zhì)；葡萄酒香氣

萜烯類物質(zhì)具有特殊的香氣，是葡萄酒中重要的香氣成分[1-4]，主要包括單萜烯類、倍半萜烯類以及二萜烯類化合物等[5]。葡萄酒中的香氣成分主要以游離態(tài)和結(jié)合態(tài)香氣前體物的形式存在，結(jié)合態(tài)物質(zhì)本身沒(méi)有香氣，必須經(jīng)過(guò)分解釋放才能產(chǎn)生香氣[6]。通常葡萄漿果中以葡萄糖苷鍵形式存在的結(jié)合態(tài)萜烯類香氣物質(zhì)的含量比游離態(tài)萜烯類的呈香物質(zhì)豐富[7]。研究表明，結(jié)合態(tài)萜烯類香氣糖苷物質(zhì)是葡萄酒活性香氣成分的儲(chǔ)備庫(kù)，比其對(duì)應(yīng)的游離態(tài)配基多幾倍，甚至幾十倍[8]。β-D-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄中與糖苷結(jié)合的萜類物質(zhì)進(jìn)行水解，從而釋放糖苷及單萜烯、倍半萜烯類等提高葡萄酒的香氣[9-11]，進(jìn)而增加葡萄酒的香氣物質(zhì)含量，提高葡萄酒的感官品質(zhì)。

目前對(duì)于單萜烯的檢測(cè)方法及種類還不夠全面，對(duì)高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母對(duì)單萜烯類物質(zhì)產(chǎn)生的影響的研究較少。本研究是在建立一種以葡萄酒為基礎(chǔ)的檢測(cè)單萜烯物質(zhì)的方法，并對(duì)高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶自選酵母的單萜烯的產(chǎn)生影響進(jìn)行了研究，為今后對(duì)該菌的商業(yè)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

本研究建立一種可同時(shí)檢測(cè)葡萄酒中13 種單萜烯類物質(zhì)的方法，并對(duì)選自不同產(chǎn)區(qū)的不同釀酒葡萄，采用自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母和商品酵母菌發(fā)酵的葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，判斷檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和產(chǎn)區(qū)、葡萄品種以及酵母菌對(duì)葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄：美樂(lè)和赤霞珠葡萄，2015年葡萄成熟季節(jié)，分別采摘于河北省昌黎和沙城葡萄酒產(chǎn)區(qū)，基礎(chǔ)檢測(cè)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 釀酒葡萄基礎(chǔ)數(shù)據(jù)Table 1 Basic data of wine grapes

釀酒酵母KDLYS9-16：自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶釀酒酵母，本研究室分離篩選于河北省沙城葡萄酒產(chǎn)區(qū)，GenBank登錄號(hào)KX119943；SC：商品釀酒酵母購(gòu)自意大利Esseco公司。

α-蒎烯、β-蒎烯、月桂烯、D-（＋）-樟腦、L-薄荷醇、右旋香芹酮、（Z）-香葉基丙酮、（E）-香葉基丙酮（均為分析純） 成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司；芳樟醇、香葉醇（均為分析純） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；香茅醇、橙花醇（均為分析純） 美國(guó)Acros Organics USA公司；α-萜品醇（分析純） 梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二氯甲烷、偏重亞硫酸鉀（均為分析純） 天津市永大化學(xué)試劑有限公司；HE果膠酶（食品級(jí)） 法國(guó)Laffort公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC 7820A配有氫火焰檢測(cè)器 美國(guó)安捷倫公司；RE52CS-1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；DC-12氮吹儀 上海安譜科技儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 干紅葡萄酒釀造過(guò)程

干紅葡萄酒釀造采用傳統(tǒng)工藝于實(shí)驗(yàn)室釀造，基本工藝流程為[12]：釀酒葡萄→分選→除?！止て扑椤尤牍z酶和SO2（果膠酶加量40 mg/L，SO2加量50 mg/L），室溫浸漬過(guò)夜→接種酵母酒精發(fā)酵（酵母菌接種量1×106個(gè)/mL）→壓榨分離皮渣→葡萄原酒去沉淀→過(guò)濾→封存檢測(cè)。

1.3.2 單萜烯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以二氯甲烷為溶劑配制單萜烯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為α-蒎烯464 mg/L、β-蒎烯828 mg/L、月桂烯778 mg/L、D-（＋）-樟腦634 mg/L、芳樟醇858 mg/L、L-薄荷醇748 mg/L、α-萜品醇494 mg/L、右旋香芹酮558 mg/L、香茅醇494 mg/L、橙花醇496 mg/L、（Z）-香葉基丙酮319 mg/L、香葉醇354 mg/L和（E）-香葉基丙酮478 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液原液，然后稀釋1、2、5、10、50、100 倍和1 000 倍，利用這7 個(gè)梯度稀釋后的溶液建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行氣相色譜氫火焰離子檢測(cè)器（gas chromatography-flame ion detector，GC-FID）分析，以單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)畫(huà)圖。

1.3.3 單萜烯類物質(zhì)的萃取[13]

分別取葡萄果汁和葡萄酒各50 mL，倒入250 mL分液漏斗中，加入等體積二氯甲烷萃取24 h，萃取過(guò)程中反復(fù)振蕩達(dá)到充分混合，靜置分層后分離萃取液和萃余液，萃取液倒入圓底燒瓶中，封口待用。萃余液再分別加入30 mL溶劑進(jìn)行第2次和第3次萃取，均萃取24 h。將3 次萃取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至3 mL左右，轉(zhuǎn)入5 mL試管中，再用2 mL溶劑洗滌圓底燒瓶，洗液一并倒入試管中，氮吹至1 mL以下，再補(bǔ)充溶劑至1mL，用0.45 μm膜過(guò)濾，濾液用于香氣物質(zhì)檢測(cè)，此樣品為濃縮50 倍。每個(gè)樣品平行檢測(cè)3 次。1.3.4 GC-FID分析條件

Agilent 7820A GC-FID，色譜柱為HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為氮?dú)?，流? mL/min；升溫程序：初始溫度為50 ℃，保持10 min；以3 ℃/min升溫至140 ℃，保持10 min；以5 ℃/min升溫至200 ℃，保持1 min；然后以10 ℃/min升至250 ℃，保持1 min。

色譜參數(shù)[14]：1 μL樣品不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣口溫度250 ℃；檢測(cè)溫度280 ℃；尾吹氣流量25 mL/min；氫氣流量40 mL/min；空氣流量400 mL/min。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)的測(cè)定

回收率用來(lái)評(píng)價(jià)測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，一般測(cè)定方法為向已知物質(zhì)質(zhì)量濃度的樣品中加入純目標(biāo)物質(zhì)，利用儀器測(cè)定濃度，然后進(jìn)行分析，按公式（1）計(jì)算[15-16]：

檢出限為所建立的方法所能檢測(cè)到的目標(biāo)物質(zhì)的最低質(zhì)量濃度，本研究檢出限的測(cè)定時(shí)通過(guò)不斷稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品，直至無(wú)法檢測(cè)到為止，此時(shí)的質(zhì)量濃度為該物質(zhì)的檢出限，為該物質(zhì)檢測(cè)與否的一個(gè)界點(diǎn)。

1.3.6 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度測(cè)定

本研究檢測(cè)的樣品包括河北省沙城產(chǎn)區(qū)和昌黎產(chǎn)區(qū)的美樂(lè)葡萄和赤霞珠葡萄，以及分別采用商品酵母菌SC和自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶的釀酒酵母KDLYS9-16釀造的4 種干紅葡萄原酒，共計(jì)12 個(gè)樣品，每個(gè)樣品做3 個(gè)平行，定量時(shí)取3 次測(cè)定結(jié)果的平均值，按公式（2）計(jì)算：

葡萄汁發(fā)酵后的葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)相對(duì)增加量按公式（3）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性回歸處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單萜烯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

以單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，使用Origin 8.0軟件進(jìn)行線性回歸，得到GC-FID分析線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表2。13 種單萜烯類物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC圖見(jiàn)圖1。

表2 單萜烯類物質(zhì)的GC-FID分析結(jié)果Table 2 Figures of merit of GC-FID for detecting monoterpenes

圖1 單萜烯標(biāo)準(zhǔn)品分離GC圖Fig. 1 GC Chromatogram for standard mixture of monoterpenes

由圖1可知，通過(guò)儀器數(shù)據(jù)計(jì)算13 種單萜烯類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品分離度都大于1.5，且峰形窄尖，分離效果較好，符合分離檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明檢測(cè)方法適于對(duì)這13 種單萜烯類物質(zhì)進(jìn)行分析檢測(cè)。

由表2可知，13 種單萜烯類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系較好，R2在0.996 7～0.999 3之間，說(shuō)明線性方程可用于物質(zhì)定量。

方法的檢出限一般為該物質(zhì)質(zhì)量濃度基線噪聲的3 倍，在實(shí)驗(yàn)中可以反映對(duì)待測(cè)目標(biāo)物質(zhì)的靈敏性，測(cè)得的檢出限越小，說(shuō)明儀器方法對(duì)所要測(cè)定的物質(zhì)靈敏性越高，所建方法對(duì)目標(biāo)物質(zhì)比較適合[17-18]。表2中各種單萜烯類物質(zhì)的檢出限在0.580～1.073 mg/L之間，滿足檢測(cè)要求，說(shuō)明所建方法的靈敏性適合對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的檢測(cè)。方法的重復(fù)性可以用目標(biāo)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard devition，RSD）來(lái)表示，RSD越小說(shuō)明重復(fù)性越好，所建方法的各種單一物質(zhì)的RSD都在0.58%～3.18%之內(nèi)，RSD較小，說(shuō)明方法的重復(fù)性較好。

所建方法的回收率為89.98%～107.34%，說(shuō)明該方法對(duì)物質(zhì)的定性與定量均較準(zhǔn)確，適于對(duì)單萜烯類物質(zhì)的檢測(cè)。

2.2 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)的測(cè)定結(jié)果

表3 葡萄汁和葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度Table 3 Monoterpene concentrations in grape juice and wine mg/L

圖2 葡萄汁與葡萄酒中13 種單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度的變化Fig. 2 Comparative concentrations of 13 monoterpenes in grape juice and wine

萜烯及C13-降異戊二烯類物質(zhì)對(duì)葡萄酒品種香氣的形成起到了決定關(guān)鍵的作用，這類物質(zhì)通常都具有濃郁的香氣和較低的感官閾值[19]，這些物質(zhì)是釀酒葡萄原料中潛在的非常重要的香氣成分，對(duì)葡萄酒品質(zhì)起著舉足輕重的作用。由表3和圖2可以看出，沙城和昌黎產(chǎn)區(qū)的美樂(lè)和赤霞珠葡萄汁、分別經(jīng)過(guò)SC和KDLYS9-16酵母發(fā)酵后的美樂(lè)和赤霞珠干紅葡萄酒等12 個(gè)樣品中分別檢測(cè)到5、7、9、6、8、11、4、7、10、7、7 種和11 種單萜烯類物質(zhì)，發(fā)酵后葡萄酒中的單萜烯物質(zhì)種類和總質(zhì)量濃度普遍明顯增加，且自選菌高于商品菌。由表3可以看出，經(jīng)自選菌發(fā)酵的昌黎赤霞珠干紅葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度增加最多，達(dá)到308.88%，而經(jīng)SC發(fā)酵后的沙城美樂(lè)葡萄酒中質(zhì)量濃度增加最高僅為90.80%，由此表明自選菌在增香上優(yōu)于商品菌，具有很好的增香效果，并且對(duì)赤霞珠干紅酒的作用要好于對(duì)美樂(lè)葡萄酒的增香作用。

2.2.1 自選菌對(duì)沙城產(chǎn)區(qū)葡萄酒中單萜烯質(zhì)量濃度的影響

沙城產(chǎn)區(qū)美樂(lè)葡萄經(jīng)過(guò)2 種酵母的發(fā)酵作用后，單萜烯類物質(zhì)的質(zhì)量濃度和種類數(shù)都呈現(xiàn)了增加的趨勢(shì)，葡萄汁中的總質(zhì)量濃度為0.502 mg/L，經(jīng)過(guò)SC和KDLYS9-16酵母發(fā)酵后分別增長(zhǎng)為0.959 mg/L和1.416 mg/L。在葡萄汁和葡萄酒中均檢測(cè)到芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇和香葉醇，且質(zhì)量濃度有明顯增大，尤其芳樟醇的質(zhì)量濃度在KDLYS9-16發(fā)酵后的葡萄酒中為0.391 mg/L，說(shuō)明這些物質(zhì)在葡萄中天然存在一部分游離態(tài)，同時(shí)也存在結(jié)合態(tài)。結(jié)合態(tài)的物質(zhì)經(jīng)酵母的發(fā)酵作用而水解為游離態(tài)，使質(zhì)量濃度增加；月桂烯和（Z）-香葉基丙酮只在經(jīng)KDLYS9-16發(fā)酵后的葡萄酒中被檢出，說(shuō)明了自選菌發(fā)酵過(guò)程中釋放的酶可以水解月桂烯和（Z）-香葉基丙酮結(jié)合態(tài)物質(zhì)釋放單體，這2 種物質(zhì)是典型的油脂香型物質(zhì)。

沙城產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄汁和葡萄酒中單萜烯物質(zhì)質(zhì)量濃度明顯高于美樂(lè)葡萄，葡萄汁中總質(zhì)量濃度為0.750 mg/L，商品菌SC發(fā)酵后總質(zhì)量濃度達(dá)到1.142 mg/L，而KDLYS9-16發(fā)酵后總質(zhì)量濃度達(dá)到2.454 mg/L，在果汁的基礎(chǔ)上提高了227.05%。2-茨酮、芳樟醇、α-萜品醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇是葡萄汁和葡萄酒中都具有的，在葡萄汁中芳樟醇的質(zhì)量濃度最高為0.206 mg/L，經(jīng)過(guò)自選菌發(fā)酵后增加了198%，達(dá)到0.614 mg/L，成為沙城產(chǎn)區(qū)赤霞珠葡萄酒中質(zhì)量濃度最高的單萜烯物質(zhì)，這些物質(zhì)是閾值很低的物質(zhì)[20-23]，使葡萄酒呈現(xiàn)了濃郁的玫瑰花香和果香[24-28]；L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香葉基丙酮僅在KDLYS9-16發(fā)酵的葡萄酒中被檢出，說(shuō)明該菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的β-D-葡萄糖苷酶可以水解這3 種物質(zhì)的結(jié)合態(tài)，釋放出游離態(tài)單體物質(zhì)，而SC酵母則不具備這種水解作用；此外，α-蒎烯、2-茨酮在美樂(lè)葡萄汁中則未被檢出，而2 種發(fā)酵酒中都被檢出，說(shuō)明它們是發(fā)酵的產(chǎn)物，從質(zhì)量濃度上來(lái)說(shuō)，自選菌高于商品菌。

沙城產(chǎn)區(qū)的美樂(lè)葡萄和赤霞珠葡萄經(jīng)過(guò)2 種酵母的發(fā)酵作用后，單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度都增加，以自選菌發(fā)酵的葡萄酒中增加顯著，尤其赤霞珠葡萄單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度從葡萄汁中的0.750 mg/L增加為葡萄酒中的2.454 mg/L，且種類從6 種增加到11 種。通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析可知，自選高產(chǎn)β-D-葡萄糖苷酶酵母菌KDLYS9-16對(duì)沙城產(chǎn)區(qū)的美樂(lè)和赤霞珠葡萄酒增香作用優(yōu)于商品菌SC。

2.2.2 自選菌對(duì)昌黎產(chǎn)區(qū)葡萄酒中單萜烯質(zhì)量濃度的影響

昌黎美樂(lè)葡萄汁及葡萄酒中總共檢測(cè)出10 種單萜烯物質(zhì)，有4 種為3 個(gè)樣品所共有，分別為芳樟醇、香茅醇、橙花醇和香葉醇，其中芳樟醇在樣品中質(zhì)量濃度最高，在KDLYS9-16發(fā)酵酒中質(zhì)量濃度最高為0.645 mg/L，是葡萄汁中質(zhì)量濃度的3.12 倍。香葉醇從葡萄汁經(jīng)過(guò)SC酵母發(fā)酵后質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯增加，而經(jīng)過(guò)KDLYS9-16發(fā)酵后質(zhì)量濃度大量增加，從0.093 mg/L增加到0.207 mg/L，增加了122.58%；月桂烯、L-薄荷醇和（Z）-香葉基丙酮僅在KDLYS9-16的發(fā)酵酒中被檢測(cè)到，總質(zhì)量濃度為0.074 mg/L，這些物質(zhì)分別具有香脂香氣、薄荷香氣和香葉氣息[29]；另外，α-蒎烯、2-茨酮和α-萜品醇是經(jīng)過(guò)酵母發(fā)酵后產(chǎn)生，α-蒎烯的質(zhì)量濃度在2 種菌的發(fā)酵酒中相差不大，說(shuō)明該物質(zhì)不會(huì)因β-D-葡萄糖苷酶的存在而急劇的增加。2-茨酮和α-萜品醇的質(zhì)量濃度經(jīng)KDLYS9-16發(fā)酵后增加，尤其α-萜品醇的質(zhì)量濃度SC菌發(fā)酵酒中為0.077 mg/L，而KDLYS9-16發(fā)酵酒中0.318 mg/L，說(shuō)明β-D-葡萄糖苷酶可以促進(jìn)α-萜品醇由結(jié)合態(tài)水解為游離態(tài)。

由圖2可以看出，昌黎產(chǎn)區(qū)赤霞珠經(jīng)KDLYS9-16發(fā)酵后單萜烯的質(zhì)量濃度增加最多，從葡萄汁中的0.698 mg/L增加到葡萄酒中的2.855 mg/L，相對(duì)增加量為309%，而對(duì)照菌SC酵母的發(fā)酵酒中的單萜烯物質(zhì)質(zhì)量濃度在葡萄汁的基礎(chǔ)相對(duì)增加量為58.09%，變化不大。與其他實(shí)驗(yàn)組相似，芳樟醇無(wú)論在葡萄汁還是葡萄酒中單萜烯的質(zhì)量濃度都最高，在經(jīng)KDLYS9-16發(fā)酵后的葡萄酒中質(zhì)量濃度高達(dá)0.825 mg/L，是葡萄汁中質(zhì)量濃度的3.29 倍，由于其閾值為25 μg/L[30]，所以芳樟醇對(duì)昌黎赤霞珠亞種16發(fā)酵酒風(fēng)味香氣影響較大，使酒體花香比較突出，此外，香茅醇、α-萜品醇和香葉醇在KDLYS9-16發(fā)酵酒中的質(zhì)量濃度也較高，僅次于芳樟醇，分別達(dá)到0.617、0.367 mg/L和0.305 mg/L，是葡萄汁中質(zhì)量濃度的6.86、11.12 倍和2.40 倍，這3 種物質(zhì)使KDLYS9-16發(fā)酵酒具有了花香、果香和青葉油香。α-蒎烯、月桂烯、L-薄荷醇、右旋香芹酮和（E）-香葉基丙酮僅存在于KDLYS9-16發(fā)酵酒中，在葡萄汁和SC發(fā)酵酒中未被檢測(cè)到，說(shuō)明這些物質(zhì)是經(jīng)KDLYS9-16在發(fā)酵過(guò)程中釋放的酶水解相應(yīng)的結(jié)合態(tài)物質(zhì)而釋放的；2-茨酮和橙花醇同時(shí)存在于葡萄汁和葡萄酒中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵后質(zhì)量濃度全部升高，尤其在KDLYS9-16的發(fā)酵酒中質(zhì)量濃度增加明顯。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種同時(shí)檢測(cè)葡萄汁和葡萄酒中13 種單萜烯類物質(zhì)的方法，先以有機(jī)溶劑二氯甲烷進(jìn)行液液萃取，然后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、氮吹濃縮，再結(jié)合GC檢測(cè)技術(shù)，對(duì)2 個(gè)產(chǎn)區(qū)的2 種葡萄的葡萄汁和經(jīng)2 種菌發(fā)酵后的酒，共12 個(gè)樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示：自選釀酒酵母KDLYS9-16在葡萄酒增香上相對(duì)于商品菌SC酵母具有明顯的優(yōu)勢(shì)，使酒中單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度增加幅度較大，極大地促進(jìn)了葡萄中結(jié)合態(tài)單萜烯前體物質(zhì)水解成游離態(tài)單萜烯物質(zhì)，且數(shù)據(jù)顯示赤霞珠干紅酒中的單萜烯質(zhì)量濃度高于美樂(lè)葡萄酒。經(jīng)自選菌發(fā)酵的昌黎赤霞珠干紅葡萄酒中單萜烯類物質(zhì)質(zhì)量濃度增加最多，相對(duì)增加量為308.88%，而經(jīng)SC發(fā)酵后的沙城美樂(lè)葡萄酒中相對(duì)增加量最高僅為90.80%，經(jīng)過(guò)自選酵母發(fā)酵后的4 種葡萄酒中分別檢測(cè)到9、11、10 種和11 種單萜烯物質(zhì)，都高于相同發(fā)酵基質(zhì)的SC發(fā)酵葡萄酒。這些都證明了自選酵母對(duì)單萜烯類物質(zhì)在發(fā)酵過(guò)程種具有增加的作用，為今后對(duì)該菌的商業(yè)應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本研究所建對(duì)葡萄酒中13 種單萜烯的檢測(cè)方法具有簡(jiǎn)單、靈敏性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以對(duì)葡萄及葡萄酒中的單萜烯物質(zhì)進(jìn)行定性定量測(cè)定。

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Establishment of a Method for the Detection of Monoterpene Compounds and Effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on Monoterpenes Production during Wine Fermentation

LI Yan1,2, ZHOU Lihua1
(1. College of Bioscience and Bioengineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China;2. Hebei R&D Center for Fermentation Engineering, Shijiazhuang 050018, China)

A method for simultaneously detecting 13 free monoterpene compounds in wine was established by liquid-liquid extraction coupled with gas chromatography with flame ionization detection (GC-FID). The monoterpene compounds in Cabernet Sauvignon and Merlot wines fermented by a commercial yeast strain SC or laboratory isolated Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from two wine producing areas in Shacheng and Changli, Hebei province, respectively were detected by this method. The results showed that the calibration curves exhibited a correlation coefficient (R2) of 0.996 7–0.999 3, and the limits of detection (LOD) varied between 0.580 and 1.073 mg/L. The recoveries were in the range of 89.98%–107.34% with relative standard deviations of 0.58%–3.18%. All four wines were higher in monoterpenes than grape must. The Cabernet Sauvignon dry red wine fermented by Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 from Changli had the highest monoterpene concentration of 2.855 mg/L among the four wines, which was about 3.1 folds higher than that of grape must. Cabernet Sauvignon wine and must had a higher monoterpene concentration than Merlot wine and must. For both cultivars, the monoterpene concentration was higher in Shacheng must than in Changli must. The types and concentrations of monoterpenes in wine varied with cultivar. In conclusion, the established method in this study is simple,sensitive, and reproducibile and can be used for the detection of monoterpene compounds in grape and wine.

liquid-liquid extraction; GC-FID; monoterpene compounds; wine aroma

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020

TS261.1

A

1002-6630（2017）24-0124-06

李艷, 周立華. 單萜烯物質(zhì)檢測(cè)方法建立及自選酵母KDLYS9-16對(duì)單萜烯產(chǎn)生的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(24):124-129.

10.7506/spkx1002-6630-201724020. http://www.spkx.net.cn

2017-03-30

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（C2011208028）

李艷（1958—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)閭鹘y(tǒng)發(fā)酵工程創(chuàng)新技術(shù)、葡萄酒和果酒釀造。

E-mail：Lymdh5885@163.com

LI Yan, ZHOU Lihua. Establishment of a method for the detection of monoterpene compounds and effect of Saccharomyces cerevisiae KDLYS9-16 on monoterpenes production during wine fermentation[J]. Food Science, 2017, 38(24)∶ 124-129. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201724020. http∶//www.spkx.net.cn