對黨參多糖的提取、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的分析與研究

周麗梅，詹 敏，張 濤★

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴州 遵義 563000）

對黨參多糖的提取、結(jié)構(gòu)及抗氧化活性的分析與研究

周麗梅1，詹 敏2，張 濤2★

（1. 遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 遵義 563000；2. 遵義醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，貴州 遵義 563000）

目的：對黨參中提取黨參多糖、黨參多糖的結(jié)構(gòu)及黨參多糖的體外抗氧化活性進(jìn)行分析與研究。方法：采用熱水煮提法和Sevag脫蛋白法制備黨參多糖，采用高效液相色譜儀和分子篩柱層析法分析黨參多糖的基本結(jié)構(gòu)，聯(lián)合采用四種方法研究黨參多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果：黨參多糖中含有RG-I型、HG型果膠，可能含有部分淀粉或淀粉樣葡聚糖。黨參多糖具有顯著的清除DPPH、·OH、O2-·自由基及H2O2的作用，且其活性呈現(xiàn)出一定程度的濃度依賴性。結(jié)論：黨參多糖含有多種結(jié)構(gòu)類型的結(jié)構(gòu)域，具有顯著的體外抗氧化作用。

黨參；多糖；抗氧化

中藥黨參（Codonopsis pilosula Nannf.）是桔?？贫嗄晟荼局参稂h參、素花黨參、川黨參及其同屬多種植物的根。黨參具有健脾益肺、降血糖、抗缺氧、免疫調(diào)節(jié)等作用[1]。研究表明，黨參的活性成分包括多糖、皂苷、甾醇類化合物等[2]。在上世紀(jì)八十年代左右，人們就已經(jīng)開始研究黨參多糖的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用[3]。但是，直到目前為止，臨床上關(guān)于黨參抗氧化活性方面的研究仍不夠全面，對黨參多糖的理化性質(zhì)也未完全明確。在本文中，筆者初步分析了黨參多糖的結(jié)構(gòu)，并聯(lián)合采用四種方法對黨參多糖的抗氧化活性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本次研究所用的材料和試劑主要包括：1）黨參（購于貴州仙龍藥業(yè)有限公司）。2）無水葡萄糖、乙醇、苯酚、濃硫酸等化學(xué)試劑（購于北京化工廠）。3）考馬斯亮藍(lán)G-250（購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。4）牛血清白蛋白組分V（購于羅氏制藥有限公司）。5）Sepharose CL-6B（購于Sigma-Aldrich）。

1.2 儀器和設(shè)備

本次研究所用的儀器和設(shè)備主要包括：1）723可見分光光度計(jì)（購于上海光譜儀器有限公司）。2）BT100-2J恒流泵（購于蘭格恒流泵有限公司）。3）SF-TDL-5A離心機(jī)（購于上海菲恰爾分析儀器有限公司）。4）SL3001N電子分析天平（購于上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司）。5）冷凍干燥器（購于北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。6）電熱恒溫水浴鍋（購于北京泰澤瑞達(dá)科技有限公司）。

1.3 黨參粗多糖的提取

稱取干燥的黨參根500 g，加入蒸餾水8 L，于100 ℃的沸水中煮提4 h。過濾后，再向?yàn)V渣中加入蒸餾水6 L，繼續(xù)于100 ℃的沸水中煮提3 h，過濾后將2次過濾所得的濾液混合。于60 ℃的條件下將濾液濃縮至800 mL，采集上清液。向上清液中加入4倍體積的濃度為95%的乙醇溶液，于4 ℃下靜置過夜。靜置完成后，以4500 r/min的速度離心15 min，收集沉淀物，對沉淀物進(jìn)行凍干處理，即得黨參粗多糖。

1.4 黨參粗多糖的脫蛋白處理

將黨參粗多糖復(fù)溶于800 mL的蒸餾水中，充分?jǐn)嚢枞芙夂?，向溶液中加入Sevag試劑（氯仿：正丁醇=4:1，V/V）200 mL，于水平振蕩器中振蕩2 h，以4500 r/min的速度離心15 min，收集水層，重復(fù)離心2次。將除去蛋白的多糖溶液凍干，即得黨參多糖。

1.5 黨參多糖中糖含量、糖醛酸及蛋白質(zhì)含量的測定

分別采用苯酚-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法和考馬斯亮藍(lán)法測定黨參多糖中的糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量[4]。

1.6 黨參多糖中單糖組成的測定

稱取黨參多糖2 mg，置于水解小瓶中，加入1 mL含2M HCl的甲醇溶液，于80 ℃的烘箱中水解16 h。取出水解小瓶，將甲醇吹干，加入1 mL的TFA溶液，于120 ℃下水解1 h。取出水解小瓶，將多糖水解液移入蒸發(fā)皿中，加入適量的無水乙醇，置于60 ℃的水浴鍋上干燥。2）向蒸發(fā)皿中加入0.5 mL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮試劑和0.5 mL 0.3 M的氫氧化鈉溶液，混勻后，于70 ℃下反應(yīng)0.5 h，然后加入0.5 mL 0.3 M的鹽酸溶液并混勻。用氯仿或乙酸乙酯萃取過量的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮試劑，得到多糖水解產(chǎn)物的衍生物。3）采用島津LC-20A液相色譜儀對黨參多糖中的單糖組成進(jìn)行測定。色譜柱為島津牌Inertsil ODS-3型（規(guī)格為：250×4.6 mm，5 mm），進(jìn)樣量為20 ml，柱溫箱溫度為35 ℃，洗脫液為乙腈（濃度為18%）和磷酸鹽緩沖液（0.1 M，濃度為82%，pH=7.0），洗脫模式為等濃度洗脫，洗脫流速為1.0 mL/min，檢測波長為245 nm[5]。

1.7 黨參多糖分子量分布的測定

稱取黨參多糖5～10 mg，將其溶于約1 mL 0.15M的NaCl溶液中，以10000 r/min的速度離心5 min，采集上清液，置于分子篩柱中用Sepharose CL-6B（1.5×90 cm）進(jìn)行層析，洗脫液為0.15 M的NaCl溶液，洗脫流速為0.15 mL/min。洗脫液每3 mL收集1管，采用苯酚-硫酸法對每個(gè)試管中糖含量的分布進(jìn)行測定。

1.8 黨參多糖抗氧化活性的測定

將黨參多糖溶于蒸餾水中，配制成不同濃度（0.25 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL） 的溶液各10 mL。2）取不同濃度的黨參多糖溶液各4 mL與1 mL 0.1 M的DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼）甲醇溶液混合，振蕩均勻后，置于暗處反應(yīng)20 min。3）以蒸餾水作為空白對照，以抗壞血酸作為陽性對照。DPPH清除率的計(jì)算公式為 DPPH清除率=(1–A黨參多糖/A蒸餾水)×100%，其中A黨參多糖和A蒸餾水為517 nm處的吸光值。4）取不同濃度的黨參多糖溶液各0.1 mL置于不同的試管中，均加入0.4 mL的磷酸鹽緩沖液（50 mM，pH=7.5）、0.1 mL的EDTA溶液（1 mM）、0.1 mL的 H2O2（10 mmol/L）、0.1 mL抗壞血酸溶液（2 mM）、0.1 mL的脫氧核糖溶液（60 mM）和0.1 mL 的FeCl3溶液（1 mM），混勻后置于37 ℃的水浴中加熱1 h。反應(yīng)完畢后，依次加入1.0 mL濃度為10%的TFA溶液、1.0 mL濃度為1%的硫代巴比妥酸溶液，混勻后，置于100 ℃的水浴中加熱15 min。羥基自由基（?OH）清除率的計(jì)算公式為羥基自由基（?OH）清除率=(1–A黨參多糖/A蒸餾水)×100%，其中 A黨參多糖和 A蒸餾水為 532 nm 處的吸光值。5）取不同濃度的黨參多糖溶液各1 mL，依次加入1 mL的氯化硝基四氮唑（300 μM）、1 mL的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（936 μM）和1 mL的吩嗪硫酸二甲酯（120 μM），混勻后，置于25℃的水浴中反應(yīng)5 min。超氧負(fù)離子（O2-·）清除率的計(jì)算公式為超氧負(fù)離子（O2-·）清除率 =(1–A黨參多糖/A蒸餾水)×100%，其中 A黨參多糖和 A蒸餾水為560 nm處的吸光值。6）取不同濃度的黨參多糖溶液各1 mL，依次加入0.4 mL的H2O2（5 mM）、0.6 mL的辣根過氧化物酶（300 μg/mL）和4.5 mM的苯酚紅，置于25℃的水浴中反應(yīng)10 min。H2O2清除率的計(jì)算公式為H2O2清除率=(1–A黨參多糖/A蒸餾水)×100%，其中 A黨參多糖和 A蒸餾水為 610 nm處的吸光值[6]。

2 結(jié)果

2.1 黨參多糖的制備

黨參多糖的制備流程如圖1所示，黨參根分別用8 L和6 L的蒸餾水在100 ℃下連續(xù)煮提2次，過濾后，將2次過濾所得的濾液混合。于60 ℃的條件下將濾液濃縮至800 mL，加入濃度為80%的乙醇溶液，沉淀后于4 ℃下靜置過夜。對濾液進(jìn)行離心處理，對離心處理所得沉淀物進(jìn)行干燥處理，得到淺棕黃色的黨參粗多糖41.3 g，收率約為8.26%。取40 g的黨參粗多糖，用Sevag法去除掉黨參粗多糖中的蛋白質(zhì)，得到31.5 g的脫蛋白黨參多糖，收率約為78.8%。采用苯酚-硫酸法、間羥基聯(lián)苯法及考馬斯亮藍(lán)法分析黨參多糖中的糖含量、糖醛酸含量和蛋白質(zhì)含量。分析結(jié)果顯示，黨參多糖的糖含量約為87.6%，糖醛酸含量約為18.3%，蛋白質(zhì)含量約為0.7%。

圖1 黨參多糖的制備流程

2.2 黨參多糖的單糖組成

采用柱前衍生化高效液相色譜法分析黨參多糖的單糖組成，結(jié)果如圖2所示。黨參多糖主要含有半乳GalA（33.2%）、Rha（5.3%）、Ara（14.7%）、Gal（16.8%）、Glc（23.9%）及少量的 Man（1.8%）、GlcA（2.4%）、Xly（1.9%）。Rha與GalA的比值屬于RG-I型果膠的定義范圍，且GalA的含量明顯高于Rha，表明黨參多糖中含有HG型和RG-I型果膠結(jié)構(gòu)域。Glc的含量約占黨參多糖中單糖總量的16.8%，表明黨參多糖中可能含有淀粉或淀粉樣葡聚糖。

圖2 黨參多糖的單糖組成

2.3 黨參多糖的分子量分布

采用Sepharose CL-6B分子篩柱層析法對黨參多糖進(jìn)行分子量分布分析，結(jié)果如圖3所示。黨參多糖的分子量分布較寬，約為21 kDa～170 kDa。

圖3 黨參多糖的分子量分布

2.4 黨參多糖的抗氧化活性

對不同濃度黨參多糖的DPPH清除能力、羥基自由基（?OH）清除能力、超氧負(fù)離子（O2-·）清除及H2O2清除能力進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示。黨參多糖均展現(xiàn)出良好的活性，且活性的強(qiáng)弱隨著多糖濃度的增加而增強(qiáng)，存在一定程度的濃度依賴關(guān)系。在黨參多糖的濃度為2 mg/mL時(shí)，其清除能力大于或接近50%。

圖4 黨參多糖的抗氧化活性

綜上所述，黨參多糖含有多種結(jié)構(gòu)類型的結(jié)構(gòu)域，具有顯著的體外抗氧化作用。

[1] 劉恩荔, 秦雪梅. 黨參研究進(jìn)展[J]. 山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2002,33(6):567-569.

[2] 朱恩圓, 賀慶, 王崢濤,等. 黨參化學(xué)成分研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào), 2001, 32(2):94-95.

[3] 陳克克, 王喆之. 黨參多糖的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007, 7(4):635-637.

[4] Zhang X, Yu L, Bi H, et al. Total fractionation and characteriza tion of the water-soluble polysaccharides isolated from Panax ginseng C. A. Meyer[J]. Carbohydrate Polymers, 2009, 77(3):544-552.

[5] Zhang X, Li S, Sun L, et al. Further analysis of the structure and immunological activity of an RG-I type pectin from Panax ginseng.[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 89(2):519-25.

[6] Bi H, Gao T, Li Z, et al. Structural elucidation and antioxidant activity of a water-soluble polysaccharide from the fruit bo dies of Bulgaria inquinans (Fries).[J]. Food Chemistry, 2013,138(2-3):1470-1475.

R917

B

2095-7629-（2017）17-0162-03

周麗梅，女，黑龍江加格達(dá)奇人，碩士學(xué)歷，主要從事植物科學(xué)的研究。由遵義醫(yī)學(xué)院2016年碩士啟動基金資助完成。

＊通訊作者：張濤，男，湖北襄陽人，博士學(xué)歷，講師，主要從事生物大分子結(jié)構(gòu)與功能的研究，E-mail：zhangt760@hotmail.com