脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠勃起功能障礙的研究

李煜罡，王俞，潘恩山，陳錫鈞，朱曉光

（南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州510315）

脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病大鼠勃起功能障礙的研究

李煜罡，王俞，潘恩山，陳錫鈞，朱曉光

（南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，廣東 廣州510315）

目的探討脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 （AD－MSCs）移植到糖尿病 （DM）勃起功能障礙 （ED）大鼠后，改善相關(guān)勃起功能的可能機(jī)制。方法制備、分離、培養(yǎng)AD－MSCs，研究其體內(nèi)、外特性。新生雄性大鼠腹腔注射5－乙炔基－2－脫氧尿苷以跟蹤內(nèi)源性MSCs，8周后隨機(jī)選擇8只大鼠作為正常對照組 （N組），其余大鼠以劑量60 mg／kg鏈脲佐菌素 （STZ）行腹腔注射誘導(dǎo)DM，DM大鼠模型中隨機(jī)選擇8只作為糖尿病組 （DM組），另8只DM大鼠經(jīng)AD－MSC治療 （DM＋MSCs組）。所有大鼠通過檢測陰莖海綿體內(nèi)壓 （ICP／MAP）等評估大鼠勃起功能，隨后，取陰莖組織行組織學(xué)檢查。結(jié)果AD－MSCs在體內(nèi)、外可分化為肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。AD－MSCs移植后，DM大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓 （ICP／MAP）值顯著改善 （P＜0．05），陰莖組織中nNOS表達(dá)明顯提高。結(jié)論AD－MSCs可治療糖尿病ED，其可能機(jī)制是通過提高陰莖海綿體nNOS陽性神經(jīng)、內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)，這可能也與介導(dǎo)內(nèi)源性MSCs聚集有關(guān)。

脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 （AD-MSCs）；糖尿病 （DM）；勃起功能障礙 （ED）；一氧化氮合酶 （nNOS）

糖尿病 （DM）是勃起功能障礙 （ED）發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素［1］，其中部分糖尿病ED患者對磷酸二酯酶－5抑制劑反應(yīng)不佳［2］，目前干細(xì)胞治療ED是研究的策略之一［3］，脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞 （AD-MSCs）因取材方便，具有自我更新能力［4］，同時(shí)保持其多向分化潛能，被認(rèn)為是治療糖尿病ED的有效方法。本實(shí)驗(yàn)從脂肪組織中分離間充質(zhì)干細(xì)胞檢測其生物學(xué)特性，并研究其對糖尿病ED模型大鼠的治療作用。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物

本研究中的所有動物實(shí)驗(yàn)均獲動物保護(hù)及使用委員會批準(zhǔn)。懷孕的Sprague－Dawley大鼠購自查爾斯河實(shí)驗(yàn)室 （Wilmington，MA），新生雄性大鼠用于本研究。為跟蹤內(nèi)源性MSCs，每只大鼠出生后立即腹腔注射5－乙炔基－2－脫氧尿苷（50 mg／kg， Invitrogen， Carlsbad， CA）［5］， 在 8 周齡時(shí)， 隨機(jī)選擇8只大鼠作為正常對照組 （N組）。其余大鼠均腹腔注射 60 mg／kg STZ （Sigma－Aldrich， St．Louis， MO）， 每周取鼠尾靜脈血進(jìn)行血糖監(jiān)測 （Roche Diagnostics，Indianapolis，IN），血糖≥200 mg／dL，大鼠被認(rèn)定為糖尿病并進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，選取16只DM大鼠隨機(jī)分為糖尿病組 （DM組）和陰莖海綿體內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞治療組 （DM＋MSCs），每組8只。

1．2 脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞的制備

初始脂肪是通過負(fù)壓抽脂術(shù)從獲得知情并同意捐助者處采集，并經(jīng)過首都醫(yī)科大學(xué)北京世紀(jì)壇醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)后執(zhí)行。初始抽吸脂肪用D－Hanks液洗滌去除廣泛污染的血細(xì)胞和局部麻醉藥。洗滌細(xì)胞2次再置入密度為2×106／mL的T－75組織培養(yǎng)瓶中， 在含有 57%DMEM／F－12、 40%MCDB－201、2%胎牛血清、10 ng／mL表皮生長因子、10 ng／mL血小板衍生生長因子BB，100 U／mL青霉素、100 lg／mL鏈霉素?cái)U(kuò)張。當(dāng)貼壁細(xì)胞70%以上匯合，用0．125%胰蛋白酶和0．01%EDTA分離，并種植在1∶3稀釋的相同培養(yǎng)條件下。

1．3 熒光激活細(xì)胞分選 （FACS）

為進(jìn)行免疫表型分析，擴(kuò)增脂源性干細(xì)胞，以抗Flk1、CD29、CD31、CD34、CD44、CD45、CD106抗體染色。細(xì)胞內(nèi)抗原的檢測，4℃下細(xì)胞被固定在2%多聚甲醛15 min，然后室溫下在0．1%皂苷滲透1 h。細(xì)胞洗滌以異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的羊抗鼠二抗，山羊抗兔、羊antigoat抗體 （Sigma），然后洗凈，用FACSCalibur流式細(xì)胞儀分析。

1．4 免疫印跡分析

SDS－PAGE可鑒定修飾酶譜，凝膠在缺乏明膠的情況下聚合在PAG（Serva，Heidelberg，Germany）網(wǎng)格裝置，使用MMP－9通過 microsep超濾設(shè)備 （Pall Filtron，Dreireich，Germany）檢測3次。樣品 （40 mL）與加樣緩沖液混合，然后在還原條件DL－DTT沸騰下分離或在非還原條件不沸騰情況下分離。電泳后，用半干印跡裝置 （Pharmacia）把蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚氟乙烯膜（Pall Filtron），用鼠單克隆抗體探針加入s－ICAM－1（0．4 mg／mL） 或 MMP－9 （0．2 mg／mL）， 并用過氧化物酶標(biāo)記的二抗（Amersham，Braunschweig，Germany）孵育。按制造商的說明采用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng) （Amersham）檢測。

1．5 RT－PCR

核糖核酸的分離和反向轉(zhuǎn)錄與先前研究一致。寡核苷酸引物序列如下：β肌動蛋白 （264 bp）， 正向：5－GAGAC CTTCAACAC CCCAGCC －3； 反 向 ： 5 －AATGTCACGCAC GATTTCCC－3； s－ICAM－1 （264 bp）， 正向： 5－CTGGCGGAG CACAACGAACT －3， 反 向 ： 5 －AGGATATCTCCATTGGGCT GAAAG－3； MMP－9 （201 bp）， 正向： 5－TCCCCATCGCCATCC CC－3， 反向： 5－CACCATGGCCTCGGCTGG－3。 所有上述基因，在相同的循環(huán)條件（94℃、1 min，57℃、50 s，72℃、1 min）下進(jìn)行擴(kuò)增，特定基因 （s－ICAM－1、MMP－9）除外。

1．6 流式細(xì)胞儀檢測

離心收集細(xì)胞，PBS洗滌，棄含雜物上清液，在－20℃以70%酒精固定保存過夜，再用磷酸洗 3次。用 0．5 mg／mL RNase A 溶解 30 min， 再以 65 μg／mL PI染色 1 h。 用 FACS流式細(xì)胞分析儀 （BD Biosciences）分析。以給定的陽性細(xì)胞百分比值和熒光相對強(qiáng)度作為表達(dá)水平的標(biāo)準(zhǔn)。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13．3統(tǒng)計(jì)軟件處理，按多樣本均數(shù)比較的方差分析處理數(shù)據(jù)，運(yùn)用LSD法進(jìn)行多重比較。由于mRNA相對表達(dá)量各組間方差不齊 （P＝0．025），采用Welch近似方差分析，運(yùn)用Tambane＇s T2法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果

2．1 AD－MSCs細(xì)胞形態(tài)和表面標(biāo)志物

來源于脂肪組織的MSCs是梭形纖維狀的。CD11a、CD31、CD34、 CD45、 CD184、 Flk－1和 HLA－DR 均為陰性， 而 CD29、CD44、CD73、CD105、CD166和表面標(biāo)志 HLA－ABC均為陽性。見圖1。

圖1 hAD－MSCs的生物學(xué)特性

2．2 AD－MSCs移植提高糖尿病大鼠的勃起功能

與N組比較，DM組大鼠勃起功能嚴(yán)重受損，陰莖海綿體內(nèi)壓 （ICP／MAP）值顯著降低，AD－MSC治療后，以三種不同電流峰值 （0．5 mA、 1．0 mA、 1．5 mA） 刺激陰莖神經(jīng)， DM ＋MSCs 組的 ICP／MAP 值顯著改善（P ＜0．05）， 在 1．0 mA 和 1．5 mA時(shí)接近正常對照組，見圖2。

2．3 AD－MSCs可促進(jìn)神經(jīng)再生

免疫組化檢測大鼠陰莖組織中有nNOS表達(dá)，組織學(xué)圖像顯示染成紅色、綠色、藍(lán)色分別代表nNOS陽性神經(jīng)纖維，平滑肌和細(xì)胞核，見圖3。為清晰起見，組織學(xué)圖像分為背神經(jīng)（圖A~C）、背動脈 （圖D~F）和海綿體血竇 （圖G~I）。 箭頭指向代表nNOS陽性點(diǎn)，DM＋MSCs組在這三個(gè)部位nNOS表達(dá)的定量數(shù)據(jù)與DM組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0．05）。

圖2 N組、DM組、DM＋MSCs組的ICP／MAP值

圖3 N組、DM組、DM＋MSCs組nNOS的表達(dá)

3 討論

近十年ED的研究有巨大進(jìn)步［6］，但DM合并ED治療仍較困難?，F(xiàn)提出一種干細(xì)胞療法治療策略，且在某些領(lǐng)域已進(jìn)行了一些臨床和臨床前試驗(yàn)［7］。AD-MSCs移植治療糖尿病ED尚未在臨床前研究。因此，本研究以STZ誘導(dǎo)建立糖尿病ED大鼠模型，并用AD-MSCs移植治療，探索其作用機(jī)理。

STZ誘導(dǎo)的DM大鼠伴有勃起功能差［8］，引起大鼠陰莖nNOS陽性神經(jīng)受損［9］且明顯減少［10］。本研究發(fā)現(xiàn)AD-MSCs移植能顯著改善STZ誘導(dǎo)的DM大鼠勃起功能且能顯著提高nNOS陽性神經(jīng)纖維表達(dá)，包括背神經(jīng)、背動脈和海綿體血竇。這種nNOS陽性神經(jīng)纖維高表達(dá)是AD-MSCs移植治療糖尿病ED的潛在機(jī)制。糖尿病ED患者和DM動物模型陰莖海綿體組織中均出現(xiàn)血管內(nèi)皮損傷和內(nèi)皮功能障礙［11］，這已得到一致確認(rèn)。本研究發(fā)現(xiàn)AD-MSCs移植能顯著恢復(fù)上述兩種組織內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量。因此，內(nèi)皮的保護(hù)或再生是AD-MSCs移植治療糖尿病ED的另一種可能機(jī)制。

綜上所述，STZ誘導(dǎo)的糖尿病ED與陰莖勃起相關(guān)組織細(xì)胞減少有關(guān) （神經(jīng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌），AD-MSCs移植能夠顯著恢復(fù)這些組織細(xì)胞功能。此外，AD-MSCs有益的作用是否與介導(dǎo)內(nèi)源性MSCs聚集有關(guān)尚待進(jìn)一步研究。

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Study on Adpose-Derived Mesenchymal Stem Cells Transplantation in the Treatment of Erectile Dysfunction in Diabetic Rats

LI Yugang,WANG Yu,PAN Enshan,CHEN Xijun,ZHU Xiaoguang
(TCM-Integrated Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510315,China)

ObjectiveTo explore the possible mechanism of adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs)transplantation to improve the relative erectile function of rats with diabetes mellitus(DM)associated erectile dysfunction(ED).MethodsAD-MSCs were prepared,separated and developed to study their characteristics in vivo and in vitro.Newborn male rats were intraperitoneally injected with 5-ethynyl-2-deoxyuridine for tracking endogenous MSCs.8 weeks later,eight of these rats were randomly selected as the normal control group(N group).The remaining rats were injected intraperitoneally with 60 mg/kg of streptozotocin(STZ)to induce DM.Eight of these DM rats were randomly selected as the DM group,while another eight rats were treated with AD-MSC(DM+MSCs group).All rats'erectile function were evaluated by intracavernous pressure(ICP/MAP)detection.Afterward,their penile tissues were collected for histological examination.ResultsAD-MSCs could differentiate into muscle cells and endothelial cells in vivo and in vitro.After AD-MSCs transplantation,the ICP/MAP of DM rats significantly improved(P＜0.05).The nNOS expression in penile tissues significantly increased.ConclusionsAD-MSC can be used in the treatment of erectile function in rats with DM associated ED.The possible mechanism is to improve the expression of nNOS-positive nerves and endothelium in cavernosa,and may be related to mediate the recruitment of endogenous MSCs.

Adipose-derived mesenchymal stem cells(AD-MSCs);Diabetes mellitus(DM);Erectile dysfunction(ED);nNOS

R587.2；R698

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.11.1528

2017－06－19

2017-08-17

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目 （項(xiàng)目編號：20140211）；南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院長基金 （項(xiàng)目編號：1201401001）

李煜罡 （1973－），男，陜西西安人，副主任醫(yī)師，從事泌尿外科及男科學(xué)的臨床、教學(xué)及科研工作。

（責(zé)任編輯：常海慶）