腰椎間盤退行性改變患者ADAMTS-7表達(dá)及其機(jī)制研究

姜棚菲，馬張穩(wěn)，張民澤，鄧亞軍

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，陜西 延安 716000)

腰椎間盤退行性改變患者ADAMTS-7表達(dá)及其機(jī)制研究

姜棚菲，馬張穩(wěn)，張民澤，鄧亞軍

(延安大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，陜西 延安 716000)

目的探討新型金屬蛋白酶(ADAMTS-7)在腰椎間盤退行性改變患者中表達(dá)情況，并探討其作用機(jī)制。方法2014年3月至2016年2月我院手術(shù)切除腰椎間盤突出癥患者退變的椎間盤組織40例(依據(jù)后外層纖維破裂與否分為破裂組及未破裂組)及同期腰椎骨折患者正常腰椎間盤組織20例(對(duì)照組)，采用半定量RT-PCR及免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)不同髓核組織中腫瘤壞死因子(TNF-α)、ADAMTS-7進(jìn)行定性定量檢測(cè)。結(jié)果TNF-α表達(dá)量隨腰椎間盤退變程度加重而增加，ADAMTS-7蛋白在對(duì)照組腰椎間盤髓核組織呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈陽(yáng)性表達(dá)及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)；3組ADAMTS-7蛋白表達(dá)量、mRNA表達(dá)量及TNF-α mRNA表達(dá)量由高到低排序?yàn)槠屏呀M>未破裂組>對(duì)照組(P< 0.05)。結(jié)論ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性改變患者髓核組織中存在高表達(dá)現(xiàn)象，并且退變程度越重其表達(dá)量越多，而作用機(jī)制可能與7 ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性病變中表達(dá)呈正反饋通路加速其病程進(jìn)展有關(guān)。

腰椎間盤；退行性改變；ADAMTS-7；TNF-α；機(jī)制

腰椎間盤屬于人體重要組成部分，主要位于脊柱兩椎體之間，并由髓核、纖維環(huán)及軟骨終板組成，近年來腰椎間盤突出癥已成為中老年人中較為常見脊柱退行性疾病之一[1]。臨床將腰椎間盤突出癥定義為椎間盤纖維環(huán)破裂后，突入到椎管內(nèi)的髓核、殘留纖維環(huán)及覆蓋在其表面的后韌帶壓迫鄰近神經(jīng)根而產(chǎn)生的臨床綜合征，對(duì)患者身心健康造成嚴(yán)重影響[2]。目前臨床對(duì)其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，早期學(xué)者研究指出在長(zhǎng)期不良機(jī)械負(fù)荷下，當(dāng)施加在椎間盤壓力超過椎間盤自身膨脹力時(shí)，會(huì)引發(fā)髓核破裂出血，表明機(jī)械應(yīng)力損傷在椎間盤突出癥病理過程中發(fā)揮重要作用[3]；而隨著臨床對(duì)本病病理研究的逐漸深入，細(xì)胞因子、炎性介質(zhì)等在椎間盤突出癥中的作用的研究日益廣泛，近期有研究報(bào)告指出ADAMTS-7可能參與腰椎間盤退行性改變疾病演變過程中[4]，但尚未完全明確，為此筆者展開臨床對(duì)照研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年3月至2016年2月我院手術(shù)切除腰椎間盤突出癥患者退變的椎間盤組織40例(依據(jù)后外層纖維破裂與否分為破裂組及未破裂組)及同期20例腰椎骨折患者正常腰椎間盤組織(對(duì)照組)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合腰椎間盤突出癥相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)；②入院后經(jīng)MRI診斷確診；③納入研究前無慢性腰背痛史；④符合赫爾辛基宣言，自愿簽署相關(guān)知情同意書；⑤首次確診為腰椎間盤突出癥。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤；②妊娠期及哺乳期婦女；③合并急慢性炎癥性疾?。虎芎喜⒆陨砻庖咝约膊』蚪Y(jié)締組織疾?。虎輰?duì)本研究依從性不好。所有標(biāo)本在采集前均已告知，患者及其家屬知情并自愿簽署知情同意書，本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。其中破裂組18例，男12例，女6例，年齡25～60歲[(45.18±6.25)歲]，椎間盤節(jié)段：L3-4、L4-5、L5-S1各3、10、5例；未破裂組22例，男14例，女8例，年齡27～58歲[(46.31±6.58)歲]，椎間盤節(jié)段：L3-4、L4-5、L5-S1各5、12、5例；對(duì)照組20例，男15例，女5例，年齡24～58歲[(44.98±6.52)歲]，椎間盤節(jié)段：L3-4、L4-5、L5-S1各5、10、5例。三組基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)；具有可比性。

1.2方法石蠟切片HE染色：①石蠟切片制作：將采集的髓核組織制成標(biāo)本，采用4%的甲醛固定液將其固定10 h，固定后的組織塊在脫水前必須采用流水液將其固定液清洗干凈，脫水硬化后，將組織塊由無水酒精中取出，并放入二甲苯及無水酒精等量混合溶劑中1 h左右，隨后包埋，并修整蠟塊，展片的同時(shí)將其粘好，最后烘干待用；②切片HE染色：脫蠟處理后，對(duì)切片進(jìn)行染色處理，染色成功后取出切片以蓋玻片蓋住，將封好的切片放置于恒溫箱中干燥處理。ADAMTS-7 mRNA表達(dá)量測(cè)定：①RNA提?。簭?70 ℃超低溫冰箱中取出腰椎間盤髓核組織標(biāo)本80 mg放在研缽內(nèi)，將組織塊放置于研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加入少量液氮研磨，重復(fù)3次將組織加入Trizol后，室溫下靜置5 min使其完全裂解，并將其放入-70 ℃低溫處保存，常規(guī)離心去除沉淀后，并經(jīng)過純化最終待用；②RNA濃度測(cè)定，定量取RNA樣品2 μL，采用紫外分光光度計(jì)Q5000對(duì)RNA在260 nm下的吸光度進(jìn)行定量，并最終采用RT-PCR檢測(cè)RNA。ADAMTS-7蛋白質(zhì)表達(dá)量測(cè)定：①烤片將切片置于60 ℃烤箱中3 h，脫蠟入水，放入1%甲醇雙氧水，室溫10 min后，蒸餾水洗1次，于切片上滴加抗原修復(fù)液，室溫放置10 min，在切片上滴定正常山羊血清封閉液，室溫20 min后，將多余液體甩出去，隨后在切片上滴加生物素化第二抗體，室溫20 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，直至DAB顯色，蘇木素染色1 min后，用自來水沖洗干凈，采用中性樹脂封片，每次實(shí)驗(yàn)采用PBS代替第一抗體做陰性對(duì)照；②結(jié)果判斷：ADAMTS-7蛋白在免疫組織化學(xué)檢測(cè)中，細(xì)胞漿著色呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞，深棕黃色表明強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，深棕黃色為弱陽(yáng)性表達(dá)，而無著色為陰性表達(dá)。

1.3觀察指標(biāo)與檢測(cè)判定①人體腰椎間盤髓核組織TNF-α、ADAMTS-7表達(dá)情況。②髓核組織中ADAMTS-7蛋白表達(dá)量比較。③髓核組織中TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達(dá)量比較。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人體腰椎間盤髓核組織TNF-α、ADAMTS-7表達(dá)情況對(duì)照組髓核細(xì)胞多為單個(gè)髓核細(xì)胞(圖1a)，未破裂組髓核細(xì)胞輕度聚集，呈現(xiàn)雙核形態(tài)(圖1b)，破裂組髓核細(xì)胞高度聚集，呈多核形態(tài)，細(xì)胞聚集，成纖維細(xì)胞增多，纖維化明顯，并且隨著腰椎間盤退變程度加重，TNF-α表達(dá)量隨之增加(圖1c)。ADAMTS-7在對(duì)照組腰椎間盤髓核組織髓核組織呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)(圖2a)；ADAMTS-7蛋白在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(圖2b，2c)。

2.2三組髓核組織中ADAMTS-7蛋白表達(dá)量比較

三組ADAMTS-7蛋白表達(dá)量由高到低排序?yàn)槠屏呀M>未破裂組>對(duì)照組(P< 0.05)，見表1。

圖1 髓核組織TNF-α表達(dá) a：對(duì)照組；b：未破裂組；c：破裂組

圖2 髓核組織ADAMTS-7表達(dá) a：對(duì)照組；b：未破裂組；c：破裂組

組別ADAMTS?7蛋白表達(dá)量對(duì)照組(n=20)028±010破裂組(n=18)066±030未破裂組(n=22)051±021

2.3三組髓核組織中TNF-α、ADAMTS-7mRNA表達(dá)量比較破裂組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達(dá)量高于未破裂組及對(duì)照組，而未破裂組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組(P< 0.05)，見表2。

表2 三組TNF-α、ADAMTS-7 mRNA表達(dá)量比較

3 討論

腰椎間盤是一種位于相鄰兩腰椎椎體之間的纖維軟骨盤，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明椎間盤退變過程較為復(fù)雜，其不僅表現(xiàn)在形態(tài)學(xué)上的變化，并伴隨著椎間盤組織學(xué)及生化性質(zhì)的系統(tǒng)性變化，而一旦椎間盤退變時(shí)，其基質(zhì)降解會(huì)隨之增加，使得髓核突出而壓迫脊神經(jīng)根或脊髓，最終會(huì)引起椎間盤源性腰背部疼痛及相應(yīng)的神經(jīng)根的病變[5]。腰椎間盤生理性退變與患者年齡、椎間盤營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)減少、自身免疫、炎性間質(zhì)、細(xì)胞因子等有關(guān)，而近期相關(guān)指出ADAMTS-7在腰椎間盤突出癥疾病發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮著重要作用[6]。

ADAMTS-7是一種含有Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序解聚蛋白樣金屬蛋白酶，早期研究就證實(shí)了其在哺乳動(dòng)物及無脊椎動(dòng)物的體內(nèi)廣泛存在[7]，其與解聚蛋白樣金屬蛋白酶ADAMs及基質(zhì)金屬蛋白水解酶等屬于家屬蛋白酶家族成員，其中蛋白多糖聚酶ADAMTS-7被認(rèn)為參與椎間盤退變過程，由于髓核一半成分為聚集蛋白聚糖，而蛋白聚糖的降解可引起髓核的退變，因而臨床考慮其可能參與腰椎間盤退行性病變過程中[8]。筆者于本文展開臨床對(duì)照性研究，本研究結(jié)果顯示，隨著腰椎間盤退變程度加重，TNF-α表達(dá)量隨之增加，ADAMTS-7蛋白在對(duì)照組腰椎間盤髓核組織呈現(xiàn)弱陽(yáng)性表達(dá)，而其在未破裂組及破裂組椎間盤髓核組織中分別呈陽(yáng)性表達(dá)及強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。研究結(jié)果還顯示，三組ADAMTS-7蛋白表達(dá)量、mRNA表達(dá)量及TNF-α mRNA表達(dá)量由高到低排序：破裂組>未破裂組>對(duì)照組，初步證實(shí)了ADAMTS-7在腰椎間盤退行性病變患者中存在高表達(dá)現(xiàn)象，并且隨著腰椎間盤退行性病變患者疾病嚴(yán)重程度加重，其ADAMTS-7及TNF-α表達(dá)量隨著增加，與既往文獻(xiàn)報(bào)告相符[9]。由于ADAMTS是髓核細(xì)胞退變過程中的一類重要關(guān)鍵酶，很長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)，ADAMTS與髓核退變關(guān)系成為臨床研究熱點(diǎn)，而早期研究中主要發(fā)現(xiàn)了ADAMTS-4、ADAMTS-5在髓核組織中呈明顯高表達(dá)現(xiàn)象[10]，而有關(guān)ADAMTS-7在腰椎間盤退行性病變患者中的相關(guān)性研究較少；國(guó)外學(xué)者動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究指出ADAMTS-7的高表達(dá)可引起幼鼠短趾畸形和軟骨骨化障礙，并且當(dāng)其高表達(dá)時(shí)可加速關(guān)節(jié)軟骨破壞及骨性關(guān)節(jié)病程進(jìn)展[11，12]；而本研究結(jié)果證實(shí)了ADAMTS-7及TNF-α在腰椎間盤退行性病變過程中起到重要作用，與另一骨性關(guān)節(jié)炎模型試驗(yàn)得出的ADAMTS-7可上調(diào)TNF-α的表達(dá)及活性，而TNF-α可通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)ADAMTS-7表達(dá)，并證實(shí)在軟骨退變和骨性關(guān)節(jié)炎病程進(jìn)展中ADAMTS-7與TNF-α共同促進(jìn)正反饋回路的觀點(diǎn)相符[13]。

綜上所述，ADAMTS-7與TNF-α在腰椎間盤退行性病變過程中發(fā)揮重要作用，ADAMTS-7促進(jìn)腰椎間盤退行性病變進(jìn)展的可能機(jī)制與TNF-α通過NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)ADAMTS-7表達(dá)有關(guān)。

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ExpressionofADAMTS-7anditsmechanisminpatientswithdegenerativechangesinlumbarintervertebraldisc

JIANGPeng-fei，MAZhang-wen，ZHANGMin-ze，DENGYa-jun

(DepartmentofOrthopedics，AffiliatedHospital，Yan’anUniversity，Yan’an716000，China)

ObjectiveTo investigate the expression of new type metalloproteinase (ADAMTS-7) in patients with degenerative lumbar disc and explore its mechanism.MethodsThe degenerative lumbar disc tissue samples from 40 patients with lumbar disc herniation undergoing the surgical resection of the degenerative disc tissue in our hospital from March 2014 to February 2016 were collected.The samples were divided into the rupture group and the non-rupture group based on whether the posterior outer fiber ruptured or not.At the same time，normal lumber disc tissue samples from 20 patients with lumbar vertebrae fractures were also collected as the control group.Qualitative and quantitative detection of tumor necrosis factor α (TNF-α) and ADAMTS-7 were performed by using semi-quantitative RT-PCR and immunohistochemistry.ResultsThe expression levels of TNF-α was increased with the degree of degeneration of lumbar intervertebral disc.ADAMTS-7 protein was shown weakly positive expression in the nucleus pulposus of the lumbar intervertebral disc in the control group while it was positive and strongly positive expression in the nucleus pulposus of the rupture group and the non-rupture group.The expression levels of ADAMTS-7 protein，mRNA and TNF-α in the three groups ranged from high to low：the rupture group > the non-rupture group > the control group (P< 0.05).ConclusionThere are high expressions of ADAMTS-7 and TNF-α in the nucleus pulposus of patients with degenerative changes in lumbar intervertebral disc.The more serious degeneration is，the higher expression level is.The mechanism may be related to the expressions of ADAMTS-7 and TNF-α as the positive feedback pathways，which can accelerate the disease progression of the degenerative lesions in lumbar intervertebral disc.

Lumbar intervertebral disc；Degenerative changes；ADAMTS-7；TNF-α；Mechanism

陜西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：2012 JM741203)

R681.5+3

A

1672-6170(2017)06-0101-04

2017-03-21；

2017-05-23)