可吸收防粘連液的生物安全性評(píng)價(jià)

張 巖，鄭紫燕，張曉敏

·經(jīng)驗(yàn)交流·

可吸收防粘連液的生物安全性評(píng)價(jià)

張 巖，鄭紫燕，張曉敏

目的對(duì)可吸收防粘連液進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)，為產(chǎn)品成功應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。方法參照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，對(duì)可吸收防粘連液進(jìn)行熱原試驗(yàn)、體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)、遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)及小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)(mLA試驗(yàn))等生物相容性試驗(yàn)研究。結(jié)果可吸收防粘連液經(jīng)熱原檢測(cè)最高升溫0.1℃，無致熱性，細(xì)胞毒性1級(jí)，急性全身毒性反應(yīng)陰性，遲發(fā)型超敏反應(yīng)陰性，遺傳毒性檢測(cè)均為陰性。以市售醫(yī)用幾丁糖為對(duì)照品，經(jīng)動(dòng)物血液學(xué)一般檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，動(dòng)物體重/臟器系數(shù)與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，結(jié)果顯示無亞慢性全身毒性。結(jié)論可吸收防粘連液具有良好的生物相容性和生物學(xué)安全性，可為產(chǎn)品應(yīng)用于臨床提供依據(jù)。

可吸收防粘連液；褐藻寡糖；海藻酸鈉；熱原試驗(yàn)； 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

可吸收防粘連液是由天然海洋植物褐藻經(jīng)生物酶解反應(yīng)提取的褐藻寡糖、海藻酸鈉等高分子材料精制而成的液狀膠體。研究表明，褐藻寡糖具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤及增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等生物活性[1-4]。海藻酸鈉為天然高分子聚合物，生物相容性良好，可在體內(nèi)降解，毒性低，來源廣泛，作為藥用輔料應(yīng)用越來越廣泛[5-6]。羧甲基纖維素鈉對(duì)活性物質(zhì)具有良好的包載能力，可用作針劑的乳化穩(wěn)定劑和片劑的粘結(jié)劑，還可作為載體材料用于活性物質(zhì)的控制釋放，經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明還是可靠的抗癌藥物載體[7]。本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，采用細(xì)胞毒性試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、皮內(nèi)刺激反應(yīng)試驗(yàn)、急性全身毒性試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、遺傳毒性試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、植入試驗(yàn)及亞慢性毒性試驗(yàn)對(duì)可吸收防粘連液進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 動(dòng)物：本試驗(yàn)于2015年3月在北京醫(yī)療器械監(jiān)督檢驗(yàn)中心開展，所用動(dòng)物均由該單位提供。其中家兔3只,昆明小鼠5只，豚鼠30只，SD大鼠46只，雌雄不限。

1.1.2 試藥：可吸收防粘連液[中英阿諾康(寧夏)生物科技有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：15012901]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熱原試驗(yàn):將樣品與生理鹽水1∶2 比例稀釋后，按照0.1 g/mL的比例，(37±1)℃條件下浸提(72±2)h，以無菌無熱原的生理鹽水為浸提介質(zhì)，按照《中國(guó)藥典》2010 版(二部)附錄Ⅺ D 的方法進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果應(yīng)無熱原反應(yīng)。

1.2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn):將樣品與生理鹽水1∶2 比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，使用細(xì)胞完全培養(yǎng)基，在(37±1)℃條件下浸提24 h，按照 GB/T 16886.5-2003 中 8.2 浸提液試驗(yàn)規(guī)定 MTT 方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)不>1級(jí)。

1.2.3 急性全身毒性試驗(yàn):將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照 0.1 g/mL 的比例，在生理鹽水中(37±1)℃條件下浸提(72±2)h，按照 GB/T 16886.11-2011 中第五章規(guī)定試驗(yàn)方法，采用 A.8 尾靜脈注射途徑進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)無急性全身毒性。

1.2.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn):將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，在生理鹽水中(37±1)℃條件下浸提(72±2)h，按照 GB/T 16886.10-2005 中 7.4 最大劑量試驗(yàn)規(guī)定進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)GB/T 16886.10-2005 中 7.4.6 對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果應(yīng)無遲發(fā)型超敏反應(yīng)。

1.2.5 遺傳毒性試驗(yàn)

1.2.5.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))，將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，分別以生理鹽水和DMSO為浸提介質(zhì)，(37±1)℃條件下浸提(72±2)h,按照 GB/T 16886.3-2008 中規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.2.5.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn):將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，以細(xì)胞完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，(37±1)℃條件下浸提 24 h，根據(jù)GB/T 16886.3-2008 中規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.2.5.3 小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)(mLA試驗(yàn))，將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，以細(xì)胞完全培養(yǎng)基為浸提介質(zhì)，(37±1)℃條件下浸提 24 h，根據(jù) GB/T 16886.3-2008 中規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)為陰性。

1.2.6 溶血試驗(yàn):按照GB/T 14233.2-2005 中第七章規(guī)定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，溶血率應(yīng)不>5%。

1.2.7 植入試驗(yàn):以大小適宜的PE軟管作為載體，將樣品附著其上，按照 GB/T 16886.6-1997 中第四章規(guī)定采用皮下組織植入方式進(jìn)行試驗(yàn)，植入期為12周，與對(duì)照組相比，樣品組應(yīng)無明顯局部生物學(xué)反應(yīng)。

1.2.8 亞慢性毒性試驗(yàn):將樣品與生理鹽水1∶2比例稀釋，取稀釋液按照0.1 g/mL的比例，以生理鹽水為浸提介質(zhì)，(37±1)℃條件下浸提(72±2)h，按照 GB/T 16886.11-2011 中第六章規(guī)定試驗(yàn)方法，采用 A.7 腹腔注射90 d方法進(jìn)行試驗(yàn)，與對(duì)照組相比，樣品組應(yīng)無明顯亞慢性毒性反應(yīng)。

2 結(jié)果

2.1 熱原試驗(yàn):在3 h觀察時(shí)間內(nèi)，3只家兔體溫升高值的總數(shù)在1.3 ℃以下，符合《中國(guó)藥典》可接受的限度范圍，試驗(yàn)材料無致熱性。

2.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn):在本試驗(yàn)條件下，被檢試驗(yàn)材料細(xì)胞毒性1級(jí)。

2.3 急性全身毒性試驗(yàn):所有動(dòng)物在整個(gè)試驗(yàn)觀察過程中表現(xiàn)正常，沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，體重均在可接受的范圍內(nèi)，表明被檢試驗(yàn)材料急性全身毒性反應(yīng)陰性。

2.4 遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn):動(dòng)物經(jīng)激發(fā)(24±2)h，去除敷貼后24 h和48 h分別觀察試驗(yàn)組和對(duì)照組動(dòng)物激發(fā)部位皮膚過敏情況，結(jié)果顯示動(dòng)物皮膚反應(yīng)記分均為0分，即無皮膚紅斑和水腫反應(yīng)情況，表明可吸收防粘連液遲發(fā)型超敏反應(yīng)陰性。

2.5 遺傳毒性試驗(yàn)

2.5.1 鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)(Ames試驗(yàn))：在本試驗(yàn)條件下，被檢試驗(yàn)材料的生理鹽水浸提液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變陰性。

2.5.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)：在本試驗(yàn)條件下，試驗(yàn)材料浸提液的染色體畸變率低于陰性對(duì)照組，試驗(yàn)結(jié)果陰性。

2.5.3 小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)(mLA試驗(yàn))：在本試驗(yàn)條件下，被檢樣品小鼠淋巴瘤細(xì)胞(L5178Y)TK基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果陰性，覆蓋兩個(gè)終點(diǎn)。

2.6 溶血試驗(yàn):根據(jù)醫(yī)療器械預(yù)期臨床用途和器械材料特性確定適宜的合格判定指標(biāo)。按本試驗(yàn)檢驗(yàn)醫(yī)療器械時(shí)，合格判定指標(biāo)一般為溶血率應(yīng)<5%。在本試驗(yàn)條件下，樣品溶血率為3.5%，符合醫(yī)療器械的溶血試驗(yàn)要求。

2.7 植入試驗(yàn)：與對(duì)照組相比，樣品在皮下植入 12 周后無明顯局部生物學(xué)反應(yīng)。

2.8 亞慢性毒性試驗(yàn)：動(dòng)物血液學(xué)一般檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，試驗(yàn)組大鼠丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶和鉀濃度低于對(duì)照組，肌酐高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但以上指標(biāo)的結(jié)果在本試驗(yàn)室參考區(qū)間。動(dòng)物體重/臟器系數(shù)與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，說明樣品組無明顯的亞慢性毒性反應(yīng)，見表1-表3。

表1 2組動(dòng)物血液學(xué)檢驗(yàn)指標(biāo)比較

表2 2組動(dòng)物血液學(xué)生化指標(biāo)比較

表3 2組動(dòng)物體重/臟器系數(shù)比較

3 討論

本研究按照GB/T 16886《醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)》的要求，采用熱原、細(xì)胞毒性、致敏、皮內(nèi)刺激反應(yīng)、急性全身毒性、溶血、遺傳毒性(Ames試驗(yàn)、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)和mLA試驗(yàn))、植入及亞慢性全身毒性試驗(yàn)對(duì)制備的可吸收防粘連液進(jìn)行生物學(xué)安全性評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：在3 h觀察時(shí)間內(nèi)，3只家兔體溫升高值的總數(shù)在1.3 ℃以下，符合《中國(guó)藥典》可接受的限度范圍，無致熱性。在本試驗(yàn)條件下，可吸收防粘連液的細(xì)胞毒性1級(jí)，急性全身毒性反應(yīng)陰性，遲發(fā)型超敏反應(yīng)陰性，可吸收防粘連液的生理鹽水浸提液對(duì)鼠傷寒沙門氏菌TA97、TA98、TA100、TA102誘變陰性，染色體畸變率低于陰性對(duì)照組，試驗(yàn)結(jié)果陰性。在本試驗(yàn)條件下，可吸收防粘連液對(duì)小鼠淋巴瘤細(xì)胞(L5178Y)TK基因突變?cè)囼?yàn)結(jié)果陰性。在本試驗(yàn)條件下，樣品溶血率為3.5%，符合醫(yī)療器械的溶血試驗(yàn)要求。 與對(duì)照組相比，樣品在皮下植入 12 周后無明顯局部生物學(xué)反應(yīng)。動(dòng)物血液學(xué)一般檢驗(yàn)、生化檢驗(yàn)，試驗(yàn)組與對(duì)照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，樣品無亞慢性毒性，因此，結(jié)果證明可吸收防粘連液具有良好的生物相容性。

防粘連產(chǎn)品對(duì)人體應(yīng)安全，不能對(duì)人體組織、血液、免疫等系統(tǒng)產(chǎn)生不良反應(yīng)。產(chǎn)品所使用材料的生物相容性優(yōu)劣是防粘連產(chǎn)品研究設(shè)計(jì)中首先考慮的重要問題。理想的防粘連產(chǎn)品應(yīng)具有良好的生物相容性、自動(dòng)黏附性、可降解吸收性、足夠的體內(nèi)存留時(shí)間、促進(jìn)傷口愈合并將纖維組織增生降至最低程度等特性。可吸收防粘連液是由天然海洋植物褐藻經(jīng)生物酶解反應(yīng)提取的褐藻寡糖、海藻酸鈉等高分子材料精制而成的液狀膠體，適用于預(yù)防和減少盆腹腔粘連的發(fā)生。本研究結(jié)果表明，可吸收防粘連液具有良好的生物相容性，然而，要想將可吸收防粘連液應(yīng)用于臨床，還需進(jìn)一步對(duì)其安全性進(jìn)行驗(yàn)證。

[1] 孫麗萍，薛長(zhǎng)湖，許家超，等.褐藻膠寡糖體外清除自由基活性的研究[J].中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2005，35(5)：811-814.

[2] 王媛媛，郭文斌，王淑芳.褐藻寡糖的生物活性與應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(10)：122-125.

[3] Hu Xiaoke，Jiang Xiaolu.Antitumour activities of alginate-derived oligosaccharides and their sulphated substitution derivatives[J].European Journal of Phycology，2004，39(1):67-71.

[4] 陳麗，張林維，薛婉立.褐藻寡糖的制備及抑菌性研究[J].中國(guó)飼料，2007(9)：34-35，42.

[5] Jain D，Bar Shalom D.Alginate drug delivery systems:application in context of pharmaceutical and biomedical research[J].Drug Development and Industrial Pharmacy，2014，40(12):1576-1584.

[6] Tucu Demir z F，Acartürk F，Takka S，et al.Evaluation of alginate based mesalazine tablets for intestinal drug delivery[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics:Official Journal of Arbeitsgemeinschaft Fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V，2007，67(2):491-497.

[7] 吳奧麗，鄭利強(qiáng).羧甲基纖維素鈉凝膠載體的制備及其控制釋放作用的研究[J].中國(guó)洗滌用品工業(yè)，2016(2)：66-70.

R965.3

B

10.13621/j.1001-5949.2017.11.1025

中英阿諾康(寧夏)生物科技有限公司，寧夏 銀川 750101

2017-09-19責(zé)任編輯馬興忠