翅果油樹種子CO2超臨界萃取物抗炎及神經(jīng)保護活性初步研究

權(quán)洪峰，楊 婷，彭曉東

·論 著·

翅果油樹種子CO2超臨界萃取物抗炎及神經(jīng)保護活性初步研究

權(quán)洪峰1，楊 婷2，彭曉東1

目的本研究對翅果油樹(Elaeagnus mollis Diels) 種子CO2超臨界萃取物(EMSC)進行成分分析,并初步篩選其抗炎及神經(jīng)保護活性，旨在為其開發(fā)利用提供實驗依據(jù)。方法采用CO2超臨界萃取技術(shù)對翅果油樹種子進行萃取，并通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)法檢測主要化學(xué)成分，采用峰面積歸一化法得出各組分的相對百分含量。以二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型和大鼠皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷模型初步考察超臨界萃取物(EMSC)抗炎及神經(jīng)保護活性。結(jié)果翅果油樹種子CO2超臨界萃取出油率為35.6%，通過GC-MS鑒定了4種脂肪酸成分，分別為棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸。EMSC低、中和高劑量組小鼠耳腫脹度與空白對照組小鼠耳腫脹度比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；低、中和高劑量組小鼠耳腫脹的抑腫率分別為52.63%、65.27%和74.22%。EMSC在0.2～40 μg/mL的劑量下均有顯著的神經(jīng)保護活性，且在0.5～10 μg/mL劑量下細胞生存率均值可達80%以上。結(jié)論EMSC在二甲苯致小鼠耳腫脹模型中表現(xiàn)出較好的抗炎活性，在大鼠皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪模型中具有顯著的神經(jīng)保護活性。

翅果油樹種子；CO2超臨界萃取物；抗炎活性；神經(jīng)保護作用

翅果油樹(Elaeagnus mollis Diels)為胡頹子科(Elaeagnaceae)胡頹子屬(Elaeagnus)灌木或落葉小喬木,法國植物分類學(xué)家Diels于1905 年根據(jù)在陜西省戶縣采集到的翅果油樹模式標本而定名。翅果油樹自然分布范圍狹窄，主要分布于山西省鄉(xiāng)寧、翼城等地的低山、丘陵區(qū)和陜西省秦嶺北麓的戶縣，是中國特有的木本油料植物[1-6]。據(jù)文獻報道，翅果油樹種仁蛋白質(zhì)含量達32.21%,由17種氨基酸組成,其中有7種人體必需氨基酸，并富含維生素類，具有抗氧化、抗衰老等作用，種仁出油率高達40%左右，其中油酸及亞油酸極為豐富，具有降血壓、降血脂、防治動脈硬化等作用。然而上述藥理作用以及作用機制研究未見詳細報道，鑒于此，本論文利用CO2超臨界萃取技術(shù)制備翅果油樹種子萃取部位，對此部位進行化學(xué)成分分析，并采用二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型和大鼠皮層神經(jīng)元細胞氧糖剝奪損傷模型初步考察其抗炎及神經(jīng)保護活性，為該藥進一步的研究開發(fā)及應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：翅果油樹種子采自山西省臨汾市鄉(xiāng)寧縣，經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院趙云生教授鑒定為胡頹子科胡頹子屬植物翅果油樹(Elaeagnus mollis Diels)種子。吲哚美辛(山西云鵬制藥有限公司)，二甲苯(分析純，天津禹王科技有限公司)，正己烷(色譜純，F(xiàn)isher Chemicals)，DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)，MTT(Bioswamp)，胎牛血清(Gibco公司)，0.25%胰蛋白酶(Bioswamp)，Neurobasal -A培養(yǎng)基(Gibco公司)，左旋多聚賴氨酸(Sigma公司)，羊抗兔FITC標記二抗(Bioswamp)。

1.2 儀器：TH32-100X3 型超臨界CO2萃取裝置(上海震樨機電科技發(fā)展有限公司)，GC-MS-QP201氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本Shimadzu)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)，酶標儀(Thermo公司)。

1.3 實驗動物：雄性ICR小鼠，體重為18～22 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供[動物合格證號：SYXK(寧)2011-0001]。動物均在室溫(22±2)℃、相對濕度50%～60%、自然光照的條件下飼養(yǎng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 CO2超臨界萃取物的制備及樣品的甲酯化處理[7]：取翅果油樹種仁5 kg，粉碎后投入萃取釜中。萃取壓力為300 Bar； 萃取溫度為55 ℃。稱取翅果油樹種仁CO2超臨界萃取物100 mg，置50 mL錐形瓶中，分別加入0.5 mol/L氫氧化鉀甲醇溶液、15%三氟化硼甲醇溶液以及正己烷，每步反應(yīng)均在60 ℃水浴中加熱回流，冷卻后，加飽和氯化鈉溶液洗滌，搖勻，靜置使分層，上層液經(jīng)無水硫酸鈉干燥。

1.4.2 GC-MS分析條件及成分分析：①GC條件：HP-5 MS彈性石英毛細管柱(30 μm×250 μm×0.25 μm)；載氣為氦氣；升溫程序：從100 ℃開始，先以3 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；載氣流量1.50 mL/min；分流比為20∶1；進樣量1 μl。②MS條件：EI源，接口溫度220 ℃，離子源溫度200 ℃，電子能量70 eV，質(zhì)量掃描范圍m/z 40～600 amu?？傠x子流圖中的各峰通過MS檢測后所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)經(jīng)NIST 數(shù)據(jù)庫匹配，通過面積歸一化法計算各化合物的相對百分含量。

1.4.3 抗炎活性研究[8]：將小鼠隨機分為空白對照組、陽性對照組(10 mg/kg，吲哚美辛)，EMSC低劑量組(50 mg/kg)、中劑量組(100 mg/kg)和高劑量組(200 mg/kg)。連續(xù)灌胃給藥7 d，末次給藥 1 h 后，于小鼠左耳均勻涂抹50 μl二甲苯致炎，右耳為空白對照。2 h 后處死小鼠，沿耳廓基線剪下兩耳，用直徑 8 mm的打孔器分別在小鼠左右耳同一部位打下圓耳片，稱重。

1.4.4 神經(jīng)保護活性研究：取培養(yǎng)7 d的原代大腦皮層細胞，吸去神經(jīng)元培養(yǎng)液，加入無糖 DMEM，置于含5% CO2、3% O2和92% N2的37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)孵育1～6 h，而后用正常培養(yǎng)基復(fù)糖復(fù)氧24 h。氧糖剝奪(oxygen-glucose deprivation,OGD)前24 h給藥至復(fù)氧 (reoxygenation，R)24 h后停止給藥。EMSC劑量為0.2、0.5、1.5、2.0、40 μg/mL。采用MTT法在490 nm 處測量各組吸光值，計算細胞存活率。

2 結(jié)果

2.1 GC-MS成分分析:采用CO2超臨界萃取法提取翅果油樹種子油，出油率為35.6%；樣品經(jīng)GC-MS對EMSC的化學(xué)成分進行分析，得到總離子流圖(圖1，目錄后)。實驗結(jié)果表明：EMSC主要成分為棕櫚酸、亞油酸、油酸和硬脂酸，其中亞油酸和油酸占脂肪酸總量的90.47%，見表1。

表1 翅果油樹種仁CO2超臨界萃取物GC-MS分析結(jié)果

2.2 翅果油樹種子CO2超臨界萃取物抗炎活性:實驗結(jié)果表明空白組小鼠耳部經(jīng)二甲苯處理后，表現(xiàn)出明顯的炎癥反應(yīng)。與空白對照組比較，EMSC低、中和高劑量組可顯著抑制二甲苯致小鼠耳腫脹的程度；低、中和高劑量組的抑腫率分別為52.63%、65.27%和74.22%，見表2。

表2 EMSC對小鼠耳腫脹的影響結(jié)果

注：*與空白對照組給藥后耳腫脹度比較，P<0.05。

2.3 翅果油樹種子CO2超臨界萃取物神經(jīng)保護活性：見圖2(目錄后)，大鼠皮層神經(jīng)元細胞經(jīng)OGD損傷后，模型組神經(jīng)元細胞存活率降低至(48.88±1.87)%。在0.2～40 μg/mL劑量下，EMSC對OGD損傷皮層神經(jīng)元細胞均有保護作用。在0.2～10 μg/mL劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的保護活性，細胞生存率分別為(85.91±5.11)%、(87.21±3.01)%、(84.77±2.75)%、(80.78±3.23)%。

3 討論

3.1 超臨界萃取技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用:超臨界萃取技術(shù)在中藥領(lǐng)域的應(yīng)用是近些年發(fā)展起來的一項新的研究方向，其在中藥提取領(lǐng)域的優(yōu)勢日益受到研究者的青睞。近年來，國內(nèi)外使用CO2超臨界萃取技術(shù)提取揮發(fā)油和油脂等低極性的成分取得了良好效果。與傳統(tǒng)香料提取方法(水蒸氣蒸餾和溶劑萃取)相比，超臨界萃取技術(shù)有著突出的優(yōu)勢：萃取溫度較低(CO2萃取溫度常為40～50 ℃)，可有效防止熱不穩(wěn)定的化學(xué)成分分解變性； CO2超臨界萃取過程不使用有機溶劑，無有機溶劑殘留，因此萃取產(chǎn)物無污染； CO2超臨界萃取過程周期較短，一般1～2 h即可萃取完成；超臨界CO2具有殺菌的功效，獲得的提取物安全性較高[9]。

3.2 二甲苯致小鼠耳腫脹模型在篩選藥物抗炎活性中的應(yīng)用:對于藥物的抗炎活性篩選而言，二甲苯致小鼠耳腫脹模型是常用、便捷的急性炎癥模型[10]。耳腫脹涉及組胺、緩激肽、前列腺素等炎癥介質(zhì)。這些炎癥介質(zhì)是通過血管舒張和增加血管通透性引起腫脹的[11]。本實驗結(jié)果表明，翅果油樹種子油低、中和高劑量組能夠消除炎癥反應(yīng)，推測可能是通過干擾炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗炎作用。其作用機制還待進一步研究。

3.3 氧糖剝奪模型在篩選藥物神經(jīng)保護活性中的應(yīng)用:腦缺血常伴隨神經(jīng)元細胞的損傷和凋亡，神經(jīng)細胞保護藥的發(fā)現(xiàn)對腦缺血的治療有十分重要的意義。離體實驗?zāi)Ｐ鸵驅(qū)嶒灄l件易于控制、耗費藥量少、試驗周期短等優(yōu)勢被廣泛用于神經(jīng)保護藥物活性篩選。目前氧糖剝奪模型已被普遍用來評價藥物對腦神經(jīng)保護的治療作用[12]。實驗對EMSC進行活性篩選發(fā)現(xiàn)，其在0.2～40 μg/mL劑量下對OGD損傷皮層神經(jīng)元細胞均有保護作用，在0.5～10 μg/mL劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出較高的保護活性。然而當劑量增加至40 μg/mL時，細胞生存率略有降低，原因可能是過高的藥物濃度抑制了損傷神經(jīng)元細胞的恢復(fù)或者過度刺激神經(jīng)元細胞。體外細胞實驗中藥物的代謝途徑和方式不同于機體，因此，其體內(nèi)作用及作用機制仍需深入研究。

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2017-07-31責任編輯馬興忠

關(guān)于撰稿的要求

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Preliminarystudyonanti-inflammatoryandneuroprotectiveactivityoftheSCF-CO2extractfromElaeagnusmollisseeds

QUANHongfeng1,YANGTing2,PENGXiaodong1.

1.CollegeofPharmacy,NingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China；2.PharmacyDepartment,TheThirdPeople'sHospitalofNingxia,750011,China

PENGXiaodong,Email:pxd-123@126.com

ObjectiveTo analyzed the chemical constituents of SCF-CO2extract from Elaeagnus mollis seeds (EMSC) by GC-MS.The anti-inflammatory and neuroprotective effect of EMSC were screened to provide experimental basis for its exploitation and utilization.MethodsThe seeds of Elaeagnus mollis were extracted by supercritical fluid CO2.The chemical profiles of extract were analyzed by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS),and the relative percentage content of each composition were calculated by peak area normalization method. The anti-inflammatory effect of EMSC were observed by the inflammation model on mouse ear swelling induced by xylene,and the neuroprotective effects of which were investigated by MTT assay in oxygen-glucose deprivation induced cortical neurons injury model.ResultsThe yield of oil recipe of EMSC was 35.6%. Four fatty acid components were identified by GC-MS,which were palmitic acid,linoleic acid,oleic acid and stearic acid. The mouse ear edema in low,medium and high dose group of EMSC had significant difference compared with the blank control group (P<0.05). The swollen suppression rate for mouse?ear?edema in low,medium and high dose group were respectively 52.63%,65.27% and 74.22%. The EMSC at dose of 5～200 uM had significant protect effect in OGD-induced cortical neurons injury model compared with model group,and the cell viabilities were over 80% at dose of 10～80 μM.ConclusionThe EMSC show better anti-inflammatory activity on the inflammation model in mouse ear swelling induced by xylene,and which can protect cortical neurons injured by oxygen-glucose deprivation model.

SeedsofElaeagnusmollisDiels;SCF-CO2extract;Anti-inflammatoryactivity

R917

A

10.13621/j.1001-5949.2017.11.0980

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，寧夏 銀川 750004 2.寧夏第三人民醫(yī)院藥劑科，寧夏 銀川 750011

權(quán)洪峰(1981-)，男，實驗師，主要從事中藥藥理研究。

彭曉東,Email:pxd-123@126.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20171109.1543.028.html