葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響

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(1.陸軍總醫(yī)院263臨床部婦產(chǎn)科，北京 101149；2.首都兒科研究所遺傳研究室，北京 100020)

[專題研究]

葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響

趙琳琳1，盧曉琳2，劉鑫麗1，王理2，姚秀英1

(1.陸軍總醫(yī)院263臨床部婦產(chǎn)科，北京101149；2.首都兒科研究所遺傳研究室，北京100020)

目的探討葉酸缺乏對胚胎停育患者絨毛印記基因甲基化的影響。方法選取2015年4月至2017年4月在陸軍總醫(yī)院263臨床部婦科門診224例胚胎停育患者(研究組)以及同期同比例自愿來陸軍總醫(yī)院263臨床部人工流產(chǎn)孕婦(對照組)，按照是否葉酸缺乏分為葉酸正常亞組和葉酸缺乏亞組，分析不同組別胰島素生長因子2、父系表達(dá)基因3以及生長因子受體結(jié)合蛋白10甲基化狀態(tài)。結(jié)果對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10的甲基化指數(shù)均低于研究組葉酸缺乏亞組、葉酸正常亞組(t值分別為8.21、7.54、6.12、5.29，均Plt;0.05)。對照組與研究組IGF2、GRB10異常甲基化率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為6.11、6.34，均Plt;0.05)。研究組組內(nèi)葉酸缺乏亞組IGF2、GRB10異常甲基化率顯著高于葉酸正常亞組(χ2值分別為5.02、5.44，均Plt;0.05)；對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10異常甲基化率均顯著低于研究組葉酸缺乏亞組(χ2值分別為6.17、6.43，均Plt;0.05)。結(jié)論葉酸缺乏可能導(dǎo)致IGF2、PEG3基因甲基化程度以及異常甲基化率增高，從而引起胚胎停育。

胚胎停育；葉酸缺乏；絨毛組織；基因甲基化

胚胎停止發(fā)育是妊娠早期由于某種或者某些因素導(dǎo)致胚胎發(fā)育停止從而引起胚胎或者胎兒死亡。研究顯示，胎兒的生長發(fā)育狀態(tài)與母體的健康狀態(tài)密切相關(guān)[1]。近年來隨著工業(yè)交通等環(huán)境污染以及女性工作壓力不斷增加，胚胎停止發(fā)育的孕婦日益增加，給孕婦及家庭帶來了嚴(yán)重的生理、心理傷害，同時也增加了家庭的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。葉酸缺乏與多種胚胎發(fā)育異常相關(guān)，如先天性心臟病、神經(jīng)管畸形、唇腭裂以及DOWN綜合征等[2-3]?；蛴∮浽谠缙谂咛グl(fā)育過程中起著重要作用，印記基因甲基化異常與胎兒生長受限、自然流產(chǎn)有一定的相關(guān)性[4]。臨床上已經(jīng)證實葉酸缺乏與胚胎停育有關(guān)，但是葉酸缺乏是否對早期胚胎發(fā)育過程中印記基因甲基化產(chǎn)生影響是研究的熱點，也是亟待解決的問題。本研究收集胚胎停育以及人工流產(chǎn)孕婦的絨毛組織，分析葉酸缺乏對胰島素生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)、父系表達(dá)基因3(paternally expressed gene 3，PEG3)以及生長因子受體結(jié)合蛋白10(growth factor receptor-bound protein 10，GRB10)的影響，以期為臨床早期診斷胚胎異常發(fā)育、胚胎停育等提供理論基礎(chǔ)。

1對象與方法

1.1研究對象

隨機(jī)選取2015年4月至2017年4月在陸軍總醫(yī)院263臨床部婦科門診就診的胚胎停育患者224例(研究組)，年齡23～35歲，平均年齡(29.17±3.42)歲，宮內(nèi)孕6～10周，平均孕周為(8.26±1.34)周。根據(jù)美國超聲放射醫(yī)生協(xié)會提出的評估標(biāo)準(zhǔn)，B超診斷需要符合以下要求：頭臀長度在7mm及以上且無心跳；孕囊平均直徑在25mm且無胚胎；檢查出無卵黃囊的孕囊2周后不見有心跳的胚胎；檢查出有卵黃囊的孕囊11天后仍然未見有心跳。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：①研究對象身體健康，月經(jīng)規(guī)律(月經(jīng)周期為28～30d)，備孕及孕周內(nèi)未服用葉酸；②既往未出現(xiàn)不良孕史，近期沒有服用過任何甾體類藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，內(nèi)分泌及激素水平經(jīng)檢查正常；③夫妻雙方染色體檢查顯示正常；④排除生殖器官后天性缺失或者器質(zhì)性病變；⑤排除自身免疫性疾病、子宮肌瘤、人工輔助技術(shù)妊娠者；⑥排除合并有心、肝、腦、腎功能疾病患者。研究組對象經(jīng)B超檢查顯示：妊娠囊變性或者不增長、輪廓模糊、小于妊娠月份；胚芽枯萎縮小或者無心血管搏動，且1周復(fù)查仍然無改變。

選擇同期來本院因社會原因要求人工流產(chǎn)婦女224例(對照組)，年齡24～35歲，平均年齡(29.49±3.51)歲，宮內(nèi)孕6～10周，平均孕周為(8.33±1.29)周。納入及排除標(biāo)準(zhǔn)：①正常妊娠婦女，身體健康，月經(jīng)規(guī)律(月經(jīng)周期為28～30d)，備孕期及孕周內(nèi)未服用葉酸；②夫妻雙方染色體檢查顯示正常；③自愿要求人工流產(chǎn)；④研究對象知情同意；⑤既往未出現(xiàn)不良孕史，近期沒有服用過任何甾體類藥物，未放置宮內(nèi)節(jié)育器，內(nèi)分泌及激素水平經(jīng)檢查正常；⑥排除生殖器官后天性缺失或者器質(zhì)性病變；⑦排除自身免疫性疾病、子宮肌瘤、人工輔助技術(shù)妊娠者；排除合并有心、肝、腦、腎功能疾病患者；⑧婦科檢查時排除陰道炎、宮頸糜爛或者宮頸息肉等合并妊娠癥患者。研究組與對照組按照是否出現(xiàn)葉酸缺乏(lt;3μg/L)[5]分為葉酸正常亞組和葉酸缺乏亞組，所有研究對象的臨床資料見表2。

1.2血清葉酸檢測

所有受試對象均于妊娠組織娩出前1d清晨抽取肘靜脈血3mL，靜置半小時后采用高速離心機(jī)以3 500r/min離心20min，靜置后取上層血清并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆茫捎梅派涿庖咴噭┖?美國MP Biomedicals LLC生物有限公司)測定血清中葉酸水平。

1.3絨毛組織標(biāo)本收集及處理

所有研究對象均在妊娠組織娩出后，在較短時間內(nèi)將大小為1cm3的絨毛組織取下，置于生理鹽水中沖洗，除去多余血塊等雜質(zhì)，而后置于無菌培養(yǎng)皿中，于體視鏡下剪取絨毛組織，并置于1.5mL離心管內(nèi)，將絨毛組織剪碎成直徑約1mm的組織塊，分裝于離心管內(nèi)，放于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。待所有組織標(biāo)本收集后，解凍組織標(biāo)本，向離心管內(nèi)加入600μL細(xì)胞核裂解液以及20μL蛋白酶K(20mg/mL)，55℃水浴3h，直到絨毛組織完全被消化。冷卻至室溫，向管內(nèi)加入200μL蛋白沉淀液，渦旋振蕩30s，冰上放置5min，25 000r/min離心5min，取上清置于EP管中。向EP管中加入600μL異丙醇，輕輕顛倒混勻，至可見白色絮狀沉淀，采用20 000r/min室溫離心3min，棄去上清，在沉淀物種加入600μL乙醇進(jìn)行洗滌，再次以20 000r/min室溫離心2min，棄去上清液，而后加入50μLTE緩沖液，置于4℃冰箱張過夜以溶解沉淀的DNA，將溶解的DNA置于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4甲基化特異PCR法檢測IGF2、GRB10、PEG3基因甲基化狀態(tài)

絨毛組織標(biāo)本經(jīng)DNA純化試劑盒純化，并采用Nanodrop-1000分光光度計測定DNA濃度，確定較為理想的純化濃度后，采用重亞硫酸鹽對基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化。將重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)后的基因組DNA作為模板，采用熱啟動PCR擴(kuò)增IGF2、GRB10、PEG3的印跡基因片段。PCE引物序列、產(chǎn)物大小見表1。引物合成由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。甲基化特異PCR(methylation specific PCR, MSP)反應(yīng)體系為25μL，其中含有2.5μL的10×緩沖液、1.5μL氯化鎂(濃度為25 mmol/L)、2μL的dNTP(濃度為2.5mmol/L)、PCR引物各1.25μL、DNA模板2μL，0.5μLTag DNA合成酶，剩余加上雙蒸水至25μL。擴(kuò)增的條件為：IGF2及GRB10的條件是：95℃預(yù)變性3min，94 ℃變性30s，56℃退火40s，73℃延伸30s，共計39個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后73℃延伸10min；PEG3的擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性2min，94℃變性30s，60℃退火45s，72℃延伸45s，共計30個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5min。第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈系顯影，采用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒純化凝膠，將純化后的片段與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化涂板后每一組絨毛組織標(biāo)本挑去10個單一的陽性克隆送上海生工生物技術(shù)公司測序，每個實驗重復(fù)3次。甲基化狀態(tài)采用Labworks 圖像采集及分析處理軟件( 英國劍橋紫羅蘭科技有限公司) 對凝膠電泳圖片進(jìn)行灰度掃描計算甲基化值(methylation index，MI)。

表1 基因IGF2、GRB10、PEG3引物序列

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1臨床資料比較

對照組與研究組在母親年齡、孕周以及孕前體質(zhì)比方面差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均Plt;0.05)，見表2。

表2 對照組與研究組臨床資料比較

2.2 IGF2、GRB10、PEG3經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳檢測結(jié)果

MSP法擴(kuò)增印記基因IGF2、GRB10、PEG3的產(chǎn)物片段見圖1。每次MSP擴(kuò)增均將純水作為空白對照，電泳檢測結(jié)果顯示空白對照組為出現(xiàn)假陽性的甲基化條帶或非甲基化條帶。研究結(jié)果顯示，在所有絨毛組織中均可以檢測到上述3個基因的甲基化條帶和非甲基化條帶，如圖1，提示絨毛組織中未發(fā)現(xiàn)完全的甲基化丟失或者非甲基化丟失。

2.3不同組別IGF2、GRB10、PEG3甲基化水平比較

研究結(jié)果顯示，對照組、研究組組內(nèi)葉酸正常亞組IGF2、GRB10的MI均顯著低于葉酸缺乏亞組(t值分別為5.27、4.66、5.29、4.53，均Plt;0.05)。對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10的MI低于研究組葉酸缺乏亞組、葉酸正常亞組(t值分別為8.21、7.54、6.12、5.29，均Plt;0.05)，見表3。

圖1 GF2、GRB10、PEG3經(jīng)PCR擴(kuò)增后電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of GF2, GRB10 and PEG3 amplified by PCR

表3 同組別IGF2、GRB10、PEG3甲基化水平比較

注：與研究組葉酸缺乏亞組比較，*Plt;0.05；與研究組葉酸正常組比較，#Plt;0.05；組內(nèi)比較，▲Plt;0.05。

2.4不同組別IGF2、GRB10、PEG3異常甲基化率比較

研究結(jié)果顯示，對照組與研究組IGF2、GRB10異常甲基化率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2值分別為6.11、6.34，均Plt;0.05)。研究組組內(nèi)葉酸缺乏亞組IGF2、GRB10異常甲基化率顯著高于葉酸正常亞組(χ2值分別為5.02、5.44，均Plt;0.05)；對照組葉酸正常亞組IGF2、GRB10異常甲基化率均顯著低于研究組葉酸缺乏亞組(χ2值分別為6.17、6.43，均Plt;0.05)，見表4、圖2。

表4 不同組別IGF2、GRB10、PEG3異常甲基化率比較[n(%)]

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

注：與研究組葉酸缺乏亞組比較，*Plt;0.05；組內(nèi)比較，▲Plt;0.05。

注：A為IGF2；B為GRB10；C為PEG3，黑圓圈(●)表示離群值，星號(*)表示極端值，兩者均被認(rèn)為是異常的甲基化值，縱坐標(biāo)為甲基化值的百分?jǐn)?shù)表示。

圖2 Boxplot分析IGF2、GRB10、PEG3甲基化值分布情況

Fig. 2 Boxplot analysis of methylation distribution of IGF2,GRB10 and PEG3

3討論

3.1葉酸與胚胎發(fā)育的關(guān)系

葉酸是人體必需的B族維生素，其在體內(nèi)參與氨基酸的相互轉(zhuǎn)換、DNA的合成以及甲基化反應(yīng)等機(jī)體內(nèi)諸多重要的化學(xué)反應(yīng)，在細(xì)胞的生長、分化、增殖以及修復(fù)的過程中起著重要作用。研究顯示，葉酸在胚胎發(fā)育早期出現(xiàn)的兩次表觀遺傳編程當(dāng)中起著重要的作用[6]。各種原因?qū)е氯~酸攝入不足、吸收障礙以及利用代謝障礙等，都將會影響機(jī)體內(nèi)葉酸水平，從而影響細(xì)胞內(nèi)核酸的合成以及甲基化反應(yīng)等。臨床已經(jīng)證實，葉酸缺乏與多種胚胎發(fā)育異常相關(guān)，如先天性心臟病、神經(jīng)管畸形、唇腭裂以及DOWN綜合征等。

3.2葉酸與印記基因甲基化的關(guān)系

囊胚期時，分化出的內(nèi)細(xì)胞群以及滋養(yǎng)層開始不斷重新甲基化，從而建立胚胎與胎盤的DNA甲基化模式[7]。研究發(fā)現(xiàn)用富含維生素B12、葉酸等食物飼養(yǎng)孕雌鼠，其后代DNA甲基化水平顯著升高，證實胚胎發(fā)育早期葉酸對生殖細(xì)胞在內(nèi)所有組織均有重要的調(diào)節(jié)作用[8]。DNA甲基化主要是通過修飾啟動子附件的印記控制區(qū)來調(diào)控等位基因的部隊稱表達(dá)，而這一修飾作用主要發(fā)生于胚胎發(fā)育早期，如葉酸以及維生素B12供應(yīng)不足，將造成DNA甲基化紊亂，基因印記將無法得到精確的傳遞，最終導(dǎo)致胎兒生長以及發(fā)育缺陷。目前的流行病調(diào)查發(fā)現(xiàn)[9]。研究發(fā)現(xiàn)缺乏葉酸以及維生素的小鼠會出現(xiàn)印記丟失，給予正常飲食后這一作用仍不可逆轉(zhuǎn)[10]。目前臨床上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，印記丟失與AS綜合征、臍疝-巨舌-巨人癥綜合征等疾病有關(guān)[11]。

3.3 IGF2、PEG3及GRB10基因甲基化與胚胎發(fā)育的關(guān)系

在胚胎期，滋養(yǎng)細(xì)胞較內(nèi)細(xì)胞團(tuán)對環(huán)境因素的干擾的敏感性更強，絨毛組織較胎兒更容易發(fā)生表觀遺傳修飾異常，這也是本研究選擇絨毛組織作為研究標(biāo)本的原因。研究顯示，印記基因甲基化狀態(tài)異?？赡芘c早期自然流產(chǎn)相關(guān)，且甲基化程度越高越易出現(xiàn)自然流產(chǎn)[12]。本研究納入了IGF2、PEG3及GRB10三種印記基因作為研究對象，觀察葉酸缺乏對上述三種印記基因甲基化的影響。IGF2也被稱為生長調(diào)節(jié)素A，是母源印記、父源表達(dá)的基因。研究顯示，IGF2編碼一種能夠促進(jìn)胎兒胎盤生長的因子，而這一因子表達(dá)受阻則會導(dǎo)致胎盤胎兒生長受限[13]。在人類早期胎盤組織形成過程中，IGF2高表達(dá)于那些增殖最快的細(xì)胞內(nèi)，如外滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎兒血管內(nèi)皮細(xì)胞等。PFG3基因位于人類染色體的19q13.4，動物研究證實PEG3敲除的小鼠生長發(fā)育受限，同時胎盤體積也明顯減小[14]。GRB10能夠編碼一種生長因子受體結(jié)合蛋白，而這一蛋白能夠與酪氨酸激酶受體相互作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。GRB10基因母本只表達(dá)于胎盤絨毛層中，其印記狀態(tài)在人類及小鼠的胎盤組織中保持著高度的保守性，研究發(fā)現(xiàn)，GRB10可以通過調(diào)節(jié)胰島素/IGF-1信號途徑參與胚胎發(fā)育[15]。通過本研究顯示，胚胎停育患者IGF2、PEG3甲基化率及甲基化指數(shù)均顯著高于人工流產(chǎn)組，提示IGF2、PEG3基因甲基化程度高(基因印記)與胚胎停止發(fā)育有關(guān)，其可能是IGF2、PEG3經(jīng)甲基化后，不能編碼促進(jìn)胎盤生長的因子，導(dǎo)致胎兒生長受限，引起胚胎發(fā)育停止。通過進(jìn)一步研究顯示，胚胎停止發(fā)育組中葉酸缺乏亞組IGF2、PEG3甲基化率及甲基化指數(shù)最高，尤其是異常甲基化率顯著高于對照組，提示葉酸缺乏可能導(dǎo)致IGF2、PEG3甲基化異常，從而導(dǎo)致胚胎停止發(fā)育。本研究發(fā)現(xiàn)，研究組和對照組比較，無論葉酸是否缺乏，GRB10基因甲基化以及異常甲基化率均無顯著性差異，這可能與GRB10印記基因的高度保守性有關(guān)。

綜上，葉酸缺乏可能導(dǎo)致IGF2、PEG3基因甲基化程度及異常甲基化率增高，從而引起胚胎停育。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：于學(xué)文]

Effectsoffolicaciddeficiencyonmethylationoffluffimprintinggeneinpatientswithembryonicincontinence

ZHAO Lin-lin1, LU Xiao-lin2, LIU Xin-li1, WANG Li2, YAO Xiu-ying1

(1.DepartmentofObstetricsandGynecology,ArmyGeneralHospital263DepartmentofClinical,Beijing101149,China;2.MolecularImmunologyofCapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020,China)

ObjectiveTo investigate the effect of folate deficiency on methylation of fluff imprinting gene in patients with embryonic incontinence.Methods224 patients with embryonic incontinence (study group) and same proportion of patients with spontaneous abortion (control group) in Army General Hospital 263 Department of Clinical were randomly divided into normal subgroup of folic acid and folic acid deficiency subgroup. Methylation status of insulin growth factor 2 (IGF2), paternal expression gene 3 and growth factor receptor-bound protein 10 (GRB10) were analyzed in different groups.ResultsThe methylation index of IGF2 and GRB10 in the normal subgroup of the control group was lower than that in subgroups of study group (tvalue was 8.21, 7.54, 6.12 and 5.29, respectively, allPlt;0.05). Abnormal methylation rate of IGF2 and GRB10 between the control group and the study group was statistically significant (χ2value was 6.11 and 6.34, respectively, bothPlt;0.05). The abnormal methylation rate of IGF2 and GRB10 in folic acid deficiency subgroup was significantly higher than that in the normal subgroup (χ2value was 5.02 and 5.44, respectively, bothPlt;0.05). The methylation rate of IGF2 and GRB10 in the normal subgroup of the control group was significantly lower than that in folic acid deficiency subgroup of the study group (χ2value was 6.17 and 6.43, respectively, bothPlt;0.05).ConclusionFolic acid deficiency may lead to increase of the methylation degree of IGF2 and paternally expressed gene 3 (PEG3) and abnormal methylation rate, which might cause embryo incontinence.

embryo incontinence; folic acid deficiency; villi tissue; gene methylation

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.11.001

R5/R33

A

1673-5293(2017)11-1317-04

2017-07-07

國家自然科學(xué)基金資助項目(編號：81370967)

趙琳琳(1978—)，女，主治醫(yī)師，主要從事婦產(chǎn)科臨床工作。

劉鑫麗，副主任醫(yī)師。