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    前列腺干細(xì)胞抗原特異性MR分子探針體外成像實(shí)驗(yàn)研究

    2010-09-25 10:54:24魏光全葛雅麗常英娟楊安鋼
    磁共振成像 2010年2期
    關(guān)鍵詞:信號(hào)強(qiáng)度微粒探針

    任 靜,楊 勇,王 芳,魏光全,葛雅麗,常英娟,楊安鋼,宦 怡*

    近年來(lái)前列腺癌(prostatic cancer, PCa)在我國(guó)發(fā)病率逐年上升[1],分子影像學(xué)(molecular imaging)的發(fā)展為PCa診斷及治療開辟了新的領(lǐng)域[2]。前列腺干細(xì)胞抗原(prostate stem cell antigen, PSCA)是PCa的腫瘤標(biāo)志物之一[3];納米金磁微粒是一種具有Fe3O4/Au核/殼結(jié)構(gòu)的納米微粒,它既具有超順磁性又具備膠體金的特點(diǎn),可以通過(guò)簡(jiǎn)便的方法偶聯(lián)微量抗體[4]。本實(shí)驗(yàn)室首次以金磁微粒作為MR對(duì)比劑標(biāo)記抗人PSCA單抗7F5,構(gòu)建了PCa特異性MR分子探針7F5@GoldMag,本文擬重點(diǎn)探討該特異性分子探針在體外MR成像檢測(cè)前列腺癌細(xì)胞的可行性。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    細(xì)胞:前列腺癌PC-3細(xì)胞株由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院泌尿外科提供,對(duì)照組人肝癌細(xì)胞株SMMC-7721由本實(shí)驗(yàn)室保存。

    主要試劑:實(shí)驗(yàn)組PSCA特異性分子探針7F5@GoldMag及對(duì)照組小鼠抗人非特異性抗體IgG@GoldMag均由本實(shí)驗(yàn)室制備并保存;RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)、胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)、二甲基亞砜(DMSO)和胰蛋白酶(Sigma公司,USA),GoldMagTM-CS納米金磁微??贵w固定化試劑盒(陜西西大北美基因股份有限公司)。

    主要設(shè)備:SHEL-LAB CO2孵箱(美國(guó)Shelton機(jī)械制造公司)、磁共振成像系統(tǒng)(Siemens Magnetom trio#tim 3.0T,德國(guó))。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    細(xì)胞培養(yǎng):在37℃、5%CO2濃度條件孵箱中培養(yǎng),每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%時(shí),顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)良好,倒去培養(yǎng)液,0.1% PBS液清洗一遍,加入0.1%胰蛋白酶約3 ml,顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮變圓后加入4 ml新鮮培養(yǎng)液,吹打均勻,吸出移入離心管,800rpm離心5 min,棄上清,加入新鮮培養(yǎng)液吹打至懸浮,1∶3傳代,標(biāo)記后放恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的可行性:將金磁微粒原液(5mg/mL)100μL以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋(1∶40~1∶1280)混勻后置入1.5 ml離心管,標(biāo)記,放置于4℃環(huán)境下至凝膠凝固;另取PBS分別加入1.5 ml離心管,放入特制試管架,MR成像。掃描參數(shù): T2WI:TR 4000ms/TE 90ms,層厚2 mm,F(xiàn)OV 120mm。

    7F5@GoldMag體外標(biāo)記前列腺癌細(xì)胞:PC-3和SMMC-7721細(xì)胞分別與7F5@GoldMag、無(wú)關(guān)抗體@GoldMag交叉配對(duì);將兩種細(xì)胞分別接種于100mm培養(yǎng)皿,細(xì)胞鋪滿皿底約80%時(shí)棄去培養(yǎng)液,PBS漂洗3次;7F5@GoldMag及無(wú)關(guān)抗體@GoldMag(金磁微粒1 mg/ml,抗體濃度約60μg/ml)各取 2 ml,加入相應(yīng)PC-3和SMMC-7721培養(yǎng)皿內(nèi);同時(shí)加入50μL羊血清;37℃孵育1 h;PBS漂洗5 min×3次;細(xì)胞刮刀刮取細(xì)胞,PBS沖洗后收集細(xì)胞,800rpm離心6 min;按實(shí)驗(yàn)分組將細(xì)胞團(tuán)塊與1%瓊脂糖凝膠混勻注入1.5 ml離心管,分組標(biāo)記(a: PC-3+7F5@GoldMag;b: PC-3+無(wú)關(guān)抗體@GoldMag;c: SMMC-7721+7F5@GoldMag;d:SMMC-7721+無(wú)關(guān)抗體@GoldMag),4℃放置至凝膠凝固。

    MR體外成像:在分別裝有以上四組細(xì)胞凝膠的1.5 ml離心管分別加入PBS,置于充滿PBS的4 ml試管內(nèi),放入特制試管架,行MR軸位及冠狀位成像,掃描參數(shù):T2WI:TR 4000ms/TE 90ms,層厚2 mm,F(xiàn)OV 120mm。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    對(duì)所得圖像測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度,每個(gè)感興趣區(qū)包括40(5×8)個(gè)像素,采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件包,各組間信號(hào)差異比較用單因素方差分析,P<0.05認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 GoldMagTM-CS納米金磁微粒用于MR成像的結(jié)果

    圖1 不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微粒T2WI圖像Fig.1 T2WI of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

    圖2 不同濃度金磁微粒T2WI信號(hào)強(qiáng)度箱圖比較Fig.2 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of GoldMagTM-CS nanoparticles in different saturation

    不同濃度GoldMagTM-CS納米金磁微T2WI 序列MR成像結(jié)果見圖1,其信號(hào)差異比較統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果見圖2,GoldMagTM-CS稀釋至1∶640與1%瓊脂糖凝膠相比,T2WI序列信號(hào)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。

    2.2 7F5@GoldMag作用于前列腺癌細(xì)胞體外MR成像結(jié)果

    7F5@GoldMag標(biāo)記PC-3細(xì)胞(管a)T2WI信號(hào)強(qiáng)度明顯降低,標(biāo)記的SMMC-7721細(xì)胞(管c)信號(hào)強(qiáng)度無(wú)降低;而無(wú)關(guān)抗體@GoldMag標(biāo)記的兩種細(xì)胞(管b、d)信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)降低(見圖3)。

    圖3 T2WI各試管軸位及冠狀位掃描,各試管依次為a:PC-3+7F5@GoldMag,b: PC-3+無(wú)關(guān)抗體@GoldMag,c: SMMC-7721+7F5@GoldMag,d: SMMC-7721+無(wú)關(guān)抗體@GoldMag。管a信號(hào)強(qiáng)度明顯降低Fig.3 T2WI of the tubes (a: PC-3 +7F5@GoldMag,b: PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 + 7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag), T2 signal intensity of tube a showed signi fi cantly decrease.

    2.3 各組細(xì)胞MR信號(hào)強(qiáng)度差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    管a、b之間信號(hào)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000);管b、c、d之間信號(hào)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.618)(見圖4)。

    3 討論

    3.1 MR分子影像探針構(gòu)建策略

    分子影像探針是指對(duì)某一特定生物分子(如蛋白質(zhì)、DNA、RNA)具有特異性、靶向性并能夠進(jìn)行體內(nèi)和/或體外示蹤的標(biāo)記化合物分子,它能夠在體和/或離體反映靶生物分子的量和/或功能。目前,MR分子成像以其高分辨率及成像參數(shù)的多元性而被大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為是最理想的分子影像學(xué)技術(shù)之一[5],具有非常好的前景,但其敏感度相對(duì)較差。靶向性MR分子探針由與靶具有高親和力的配體(如抗體、肽或小分子化合物)經(jīng)特定的方法與順磁性對(duì)比劑連接構(gòu)成,利用靶特異性探針與靶目標(biāo)直接結(jié)合而成像[6]。目前亟需研究開發(fā)新型分子探針,使MR不僅具有極高的空間分辨力,還具有較高的敏感性。

    圖4 各組細(xì)胞T2WI信號(hào)強(qiáng)度箱圖比較Fig.4 Boxplot showed comparisons of T2WI signal intensity of the tubes (a: PC-3 + 7F5@GoldMag, b:PC-3 + non-related IgG @GoldMag, c: SMMC-7721 +7F5@GoldMag, d: SMMC-7721 + non-related IgG@GoldMag).

    3.2 納米金磁微粒及其對(duì)MR信號(hào)的影響

    納米金磁微粒是具有Fe3O4(核)/Au(殼)結(jié)構(gòu)的復(fù)合超順磁性納米微粒[4],本實(shí)驗(yàn)首次采用直徑50nm的金磁微粒作為MR信號(hào)組件,其Fe3O4核直徑約20nm,金殼厚度約15 nm,其創(chuàng)新點(diǎn)在于將氧化鐵納米微粒用金殼來(lái)包被,使其既具有超順磁性,又具有膠體金的性質(zhì)[7],從而通過(guò)表面靜電作用、疏水相互作用、蛋白氨基酸殘基側(cè)鏈的巰基與金的作用等[7-9]將其與單抗偶聯(lián),可最大限度保留被偶聯(lián)分子的生物活性,同時(shí)操作簡(jiǎn)便,抗體固定化效率高。與其他MR對(duì)比劑相比,優(yōu)勢(shì)明顯。它本質(zhì)上仍屬于SPIO范疇,對(duì)MR信號(hào)的影響也主要表現(xiàn)為產(chǎn)生較強(qiáng)的T2負(fù)性對(duì)比,因此本實(shí)驗(yàn)的MR掃描序列以T2WI為主。在操作中將金磁微粒以1%瓊脂糖凝膠倍比稀釋后4℃放置至凝膠凝固,主要是為了避免金磁微粒沉淀引起的信號(hào)不均勻現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),稀釋至1∶640的金磁微粒T2WI信號(hào)強(qiáng)度仍顯著低于1%瓊脂糖凝膠(P=0.000)。更低濃度的金磁微粒對(duì)MR信號(hào)影響輕微。金磁微粒在臨床應(yīng)用的3.0T場(chǎng)強(qiáng)MR掃描儀條件下具備作為對(duì)比劑的條件,基于這一結(jié)果,可以認(rèn)為以金磁微粒作為對(duì)比劑所構(gòu)建的探針能夠應(yīng)用于MR成像。

    3.3 7F5@GoldMag對(duì)前列腺癌細(xì)胞體外MR信號(hào)的影響

    用高親和力分子探針來(lái)辨認(rèn)和證實(shí)相關(guān)受體是分子成像的先決條件。我們用抗人PSCA單抗7F5與納米金磁微粒偶聯(lián)構(gòu)建前列腺癌特異性分子探針7F5@GoldMag,將其與PC-3細(xì)胞孵育,行MR掃描,結(jié)果發(fā)現(xiàn)它可特異性降低PC-3細(xì)胞的T2WI信號(hào)強(qiáng)度,對(duì)SMMC-7721細(xì)胞T2WI信號(hào)無(wú)明顯影響。利用類似方法檢測(cè)無(wú)關(guān)抗體@GoldMag對(duì)兩種細(xì)胞T2WI信號(hào)強(qiáng)度均無(wú)明顯影響。7F5@GoldMag與PSCA陽(yáng)性細(xì)胞PC-3的特異性結(jié)合是其作為前列腺癌特異性分子探針的基礎(chǔ)。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以PSCA為靶向分子的MR探針7F5@GoldMag用于體外前列腺癌細(xì)胞MR成像,可特異性降低PC-3細(xì)胞的T2WI信號(hào),從而為下一步體內(nèi)MR成像實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

    [1]顧方六.現(xiàn)代前列腺病學(xué).北京:人民軍醫(yī)出版社,2002.Gu FL.Modern Prostatic Disease.Beijing: People's Military Medical Press, 2002.

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