2012～2016年四川重點(diǎn)原種豬場豬瘟病毒感染及其抗體監(jiān)測分析

李英林 ，陳弟詩 ，陳斌 ，任玉鵬 ，邱明雙

（1.四川省涼山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615000；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

2012～2016年四川重點(diǎn)原種豬場豬瘟病毒感染及其抗體監(jiān)測分析

李英林1，陳弟詩2，陳斌2，任玉鵬3，邱明雙2

（1.四川省涼山州動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 西昌 615000；2.四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041；3.西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，四川 成都 610041）

根據(jù)2012～2016年度中國動(dòng)物疫控中心對(duì)四川省5個(gè)重點(diǎn)原種豬場垂直傳播性疫病的監(jiān)測結(jié)果以及四川省動(dòng)物疫控中心對(duì)豬瘟流行病學(xué)的跟蹤調(diào)查結(jié)果，筆者進(jìn)行了整理分析。結(jié)果顯示：四川省重點(diǎn)原種豬場的豬瘟免疫抗體水平呈逐年上升趨勢，免疫效果達(dá)到較高水平，且所有豬場均無豬瘟野毒感染，特別是種公豬無豬瘟野毒帶毒情況，表明近年來四川省原種場在豬瘟防控方面取得了較好成績。

原種豬場；豬瘟病毒；抗體水平；免疫；監(jiān)測

近年來，以慢性、非典型特征為主的豬瘟在我國不間斷的出現(xiàn)，影響母豬繁殖性能，并引起豬體免疫抑制，從而加重種豬場的經(jīng)濟(jì)損失[1]。雖然國內(nèi)大部分規(guī)模化豬場通過規(guī)范疫苗免疫程序和逐步完善綜合防控措施，使豬瘟得到一定程度的控制，但仍然不能徹底清除[2]。豬瘟的計(jì)劃免疫在我國已實(shí)行多年，特別是2007年下半年以來國家將豬瘟免疫納入重大動(dòng)物疫病強(qiáng)制免疫的范疇，使得豬瘟的免疫步入科學(xué)化、規(guī)模化的軌道。原種豬場對(duì)推動(dòng)我國良種豬繁育、品種改良、現(xiàn)代養(yǎng)殖技術(shù)以及生豬產(chǎn)業(yè)發(fā)展等具有重要作用。原種豬的生產(chǎn)不僅影響商品豬的安全，而且影響肉品供給和食物鏈的其他環(huán)節(jié)[3]。對(duì)原種豬場疫病的持續(xù)監(jiān)測將有助于提高原種豬場的綜合防控能力，降低疫病的暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。本研究根據(jù)2012～2016年度中國動(dòng)物疫控中心對(duì)四川省5個(gè)重點(diǎn)原種豬場垂直傳播性疫病的監(jiān)測結(jié)果，結(jié)合四川省動(dòng)物疫控中心對(duì)豬瘟流行病學(xué)的跟蹤調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，精準(zhǔn)掌握了四川省原種豬場的豬瘟流行狀況，為研究制定本省種豬豬瘟凈化策略，加強(qiáng)種豬場防疫監(jiān)管提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測試劑盒，購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；豬瘟病毒抗體檢測試劑盒，購自美國愛德士生物技術(shù)有限公司。

1.2 樣品采集及處理 2012～2016年，每年度在四川省綿陽、樂山、德陽、南充、遂寧5個(gè)地區(qū)5個(gè)重點(diǎn)原種豬場采集豬只扁桃體及對(duì)應(yīng)血清樣品40～50份/場，并隨機(jī)采集種公豬精液樣品5份/場，進(jìn)行病原檢測和抗體監(jiān)測（見表1），5年共檢測血清樣品1081份，扁桃體樣品1094份，精液樣品125份，總計(jì)2300份。

表1 2012～2016年樣品采集情況 份

扁桃體樣品用專用采樣器進(jìn)行采樣，樣品裝入無菌離心管，-20℃保存。用無菌注射器采集豬只前腔靜脈血，分裝于無菌離心管中，室溫放置1～2h后，以4000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入新的無菌離心管，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原學(xué)檢測 豬瘟病毒檢測按照豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行。首先提取扁桃體樣品RNA，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。RT-PCR 反應(yīng)體系為 25μL：RNase-free H2O 6.6μL，RT-PCR反應(yīng)液12.5μL，酶混合液1μL，熒光探針2.9μL，模板 RNA 2μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃ 5min、95℃10s，循環(huán) 95℃ 5s、60℃ 35s，共 40次，在每個(gè)循環(huán)第二步收集熒光信號(hào)（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）。若陽性對(duì)照Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，陰性對(duì)照無Ct值且無特定擴(kuò)增曲線，則結(jié)果成立。被檢樣品Ct值≤30并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，判定為CSFV陽性；30＜Ct值＜37并出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，則需重提樣品RNA擴(kuò)增后判定，若仍為可疑，則判定為陽性；當(dāng)Ct值≥37時(shí)，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn)S型曲線，但本底較高的樣品，應(yīng)判為陰性。1.4 血清學(xué)檢測 血清樣品的豬瘟抗體檢測按照豬瘟病毒抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行，采用阻斷ELISA原理。根據(jù)檢測結(jié)果計(jì)算被檢樣品的平均OD450（ODTEST）、陽性對(duì)照的平均值（ODPOS）、陰性對(duì)照的平均值（ODNEG），再根據(jù)公式計(jì)算被檢樣品及陽性對(duì)照的阻斷率。

當(dāng)陰性對(duì)照的平均OD450大于0.50，陽性對(duì)照的阻斷率大于50%時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果有效。若待檢樣品阻斷率≥40%，則判為CSFV抗體陽性；若待檢樣品阻斷率≤30%，則判為CSFV抗體陰性；若待檢樣品阻斷率介于30%～40%之間，則判為可疑。

2 結(jié)果

2.1 CSFV病原檢測結(jié)果 豬瘟病毒野毒株實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測結(jié)果顯示：2012～2016年，5個(gè)原種豬場1094份扁桃體樣品的Ct值均大于37，表明這些抽檢樣品中均未檢出豬瘟野毒；125份種公豬精液樣品中也未檢出豬瘟野毒。

2.2 血清學(xué)檢測結(jié)果

2.2.1 不同年份血清樣品抗體總陽性率比較 2012～2016年，所有原種豬場血清樣品抗體總陽性率分別為：2012 年 72.19%（95%CI：66.8%～77.2%），2013 年64.77%（95%CI：57.2%～71.8%），2014 年 79.05%（95%CI：72.9%～84.3%），2015 年 86.43%（95%CI：81.2%～90.7%），2016 年 95.50%（95%CI：91.9%～97.8%）。在2013年后原種豬場抗體總陽性率呈逐年上升的趨勢，到2016年抗體總陽性率高于90%，遠(yuǎn)超國家規(guī)定的70%標(biāo)準(zhǔn)，表明這幾個(gè)重點(diǎn)原種豬場的豬瘟疫苗免疫情況較好，免疫效果達(dá)到較高水平（見圖1）。

圖1 不同年份樣品總體陽性率變化趨勢

2.2.2 不同來源、不同年份樣品陽性率比較 對(duì)2012～2016年采集的1 081份血清樣品進(jìn)行ELISA檢測，結(jié)果顯示：2014年后各原種豬場血清抗體陽性率均高于75%，而在2015、2016年抗體陽性率呈現(xiàn)明顯上升趨勢，部分豬場甚至達(dá)到100.00%（95%CI：91.2%～100.0%），但不同群體間的數(shù)據(jù)差異較大（見圖2和表2）。2012年B場豬只的抗體陽性率為96.08%（95%CI：86.5%～99.5%），顯著高于其他四個(gè)豬場；此后4年的檢測數(shù)據(jù)顯示，B場抗體陽性率變化趨勢相對(duì)穩(wěn)定，且一直處于較高水平。A場和C場的抗體陽性率相對(duì)較低，尤其是2013年A場的抗體陽性率僅為 7.69%（95%CI：1.6%～20.9%），推測原因可能與采樣豬只的免疫時(shí)間、疫苗因素、免疫程序以及其他免疫抑制疾病等有關(guān)，但也不完全排除部分樣品運(yùn)輸保存等原因。2016年檢測結(jié)果顯示，5個(gè)豬場抗體陽性率均達(dá)到90%以上（95%CI：76.3%～99.5%），表明這些原種豬場豬瘟免疫的整體效果很好。

圖2 不同來源、不同年份樣品抗體陽性率比較

2.2.3 不同來源樣品平均阻斷率比較 對(duì)5個(gè)重點(diǎn)種豬場的樣品平均阻斷率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示：不同豬場、不同年份樣品平均阻斷率的變化趨勢與抗體陽性率趨勢基本一致。2012～2015年的數(shù)據(jù)顯示，血清樣品中CSFV抗體阻斷率的離散程度均較高，其標(biāo)準(zhǔn)差值在0.163～0.262，表明此期間豬群中不同個(gè)體的CSFV抗體水平差異較大。因此，不能單純用平均阻斷率或平均抗體陽性率作為唯一判定標(biāo)準(zhǔn)，在對(duì)CSFV監(jiān)測過程中，還應(yīng)對(duì)其阻斷率數(shù)據(jù)的離散度進(jìn)行分析。到2016年，所有豬場平均阻斷率標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.1（見圖3），表明這5個(gè)重點(diǎn)種豬場群體免疫穩(wěn)定，豬瘟風(fēng)險(xiǎn)壓力很小。

表2 不同來源、不同年份各種豬場抗體陽性率比較

圖3 不同來源、不同年份樣品抗體平均阻斷率比較

3 討論與結(jié)論

規(guī)?；i場穩(wěn)定生產(chǎn)與持續(xù)發(fā)展是以種豬的健康穩(wěn)定為前提，豬場豬瘟控制的好壞直接關(guān)系到整個(gè)種豬群的健康狀況[4]。種豬群攜帶豬瘟病毒或機(jī)體免疫受到抑制，會(huì)造成仔豬先天性感染豬瘟或新生仔豬得不到母源抗體的充分保護(hù)而感染上包括豬瘟在內(nèi)的各種疫病，成為豬場的隱患[5]。飼養(yǎng)管理不規(guī)范，免疫程序不合理，免疫注射方法不當(dāng)，甚至豬只個(gè)體差異都會(huì)直接影響豬瘟疫苗的免疫效果[6]。因此，規(guī)?；B(yǎng)殖過程中通過嚴(yán)格引種，從源頭上降低豬瘟感染風(fēng)險(xiǎn)，是預(yù)防、控制、消滅和凈化豬瘟最有效的手段之一。本研究調(diào)查了2012～2016年四川省5個(gè)重點(diǎn)原種豬場的豬瘟流行情況，對(duì)豬瘟病毒感染情況和抗體水平進(jìn)行了監(jiān)測分析。

3.1 2012～2016年度調(diào)查了5個(gè)代表性的省重點(diǎn)原種豬場，其中樂山檢測扁桃體222份，精液25份；綿陽檢測扁桃體228份，精液25份；德陽檢測扁桃體217份，精液25份；遂寧檢測扁桃體201份，精液25份；南充檢測扁桃體226份，精液25份。結(jié)果表明，5個(gè)年度所調(diào)查的5個(gè)重點(diǎn)原種豬場均未發(fā)現(xiàn)豬瘟野毒，特別是種公豬無野毒帶毒情況。原種豬是養(yǎng)豬界傳播疫病的關(guān)鍵載體，尤其種公豬精液帶毒是目前造成臨床發(fā)病率升高的主要原因之一。據(jù)報(bào)道，廣西部分中小規(guī)模種豬場的種公豬精液有16.94%（42/248）感染攜帶CSFV野毒，與該省臨床上CSFV發(fā)病率升高吻合[7]，而四川省抽檢的重點(diǎn)原種場均未發(fā)現(xiàn)野毒感染，表明四川省原種豬場的豬瘟防控已經(jīng)取得較好成效，能有效控制和降低其他環(huán)節(jié)商品豬的疫病風(fēng)險(xiǎn)。

3.2 本次調(diào)查中，樂山檢測豬只血清207份，綿陽檢測豬只血清200份，德陽檢測豬只血清225份，遂寧檢測檢測豬只血清219份，南充檢測豬只血清230份。結(jié)果表明，除2013年外，其余4個(gè)年度所調(diào)查的原種場豬瘟免疫合格率均達(dá)到《國家動(dòng)物疫病監(jiān)測與流行病學(xué)調(diào)查計(jì)劃》中群體免疫合格70%的要求，且均達(dá)到了相對(duì)較高的水平。各年總體陽性率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，2012年總體平均陽性率為72.19%，到2016年達(dá)到95.50%，且所有抽樣場抗體陽性率均高于90%，表明5個(gè)原種豬場的豬瘟免疫效果總體較好，豬群具有較好的群體免疫力，這大大降低了豬瘟的易感性和傳染性，同時(shí)降低了其他疫病感染的風(fēng)險(xiǎn)，此外也間接反映出持續(xù)的抗體監(jiān)測會(huì)促進(jìn)豬場疫病防控意識(shí)和水平不斷提升。

3.3 在對(duì)抗體水平分析的同時(shí)，本研究還對(duì)豬瘟抗體阻斷率及同群樣品的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行了分析，反映出數(shù)據(jù)的離散度，并通過離散度來評(píng)價(jià)群體免疫整齊度。結(jié)果表明，不同豬場、不同年份樣品的平均阻斷率變化趨勢與抗體陽性率變化趨勢基本一致，但2012～2015年間5個(gè)場的豬瘟抗體阻斷率離散度均較高，其標(biāo)準(zhǔn)差值在0.163～0.262，表明豬群抗體整齊度較差，存在不穩(wěn)定的風(fēng)險(xiǎn)。到2016年豬場平均阻斷率標(biāo)準(zhǔn)差均小于0.1，表明這些原種豬場在不斷提高飼養(yǎng)管理水平的同時(shí)，可能根據(jù)抗體監(jiān)測數(shù)據(jù)科學(xué)地調(diào)整了免疫程序，并通過篩選使用優(yōu)質(zhì)疫苗、開展CSFV凈化、強(qiáng)化其他免疫抑制性疾病防控等措施，使得CSFV群體免疫水平越來越穩(wěn)定，免疫效果越來越好。

綜上，近年來四川省按照國家政策大力推行豬瘟強(qiáng)制免疫，已經(jīng)取得較好成效，加上原種豬場不斷健全防疫制度、嚴(yán)格生物安全管理，使用高效養(yǎng)殖設(shè)施設(shè)備，保持良好的豬群健康水平和合理的飼養(yǎng)密度等，使得豬瘟防控水平走上了新臺(tái)階。同時(shí)，規(guī)?；i場定期開展豬瘟病毒和免疫抗體水平監(jiān)測，及時(shí)掌握豬瘟群體免疫力，對(duì)于豬瘟的預(yù)防、控制和凈化具有積極的推動(dòng)作用。

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Monitoring Analysis of Classical Swine Fever Virus in the Representative Pig Breeding Farms From 2012 to 2016 in Sichuan Region

Li Yinglin1，Chen Dishi2，Ren Yupeng3，et al.
（1.Animal Disease Prevention and Control Center of Liangshan Prefecture，Sichuan Xichang 615000；2.Animal Disease Preventio and Control Center of Sichuan Province，Sichuan Chengdu 610041；3.College of Life Science and Technology，Southwest University for Nationalities，Sichuan Chengdu 610041，China）

According to the Chinese animal disease prevention and control center′s monitoring results of several vertical transmission diseases in five representative pig breeding farms in Sichuan，and the animal disease prevention and control center of Sichuan Province′s investigation results of CSFV′s epidemiology，the author had made some collection and analysis.The results showed that the antibody level of CSFV increased from one year to the next，at the same time，all the pig farms were free of CSFV，especially in boars.It indicated that the Sichuan province had achieved good results on the prevention and control for CSFV in recent years.

Pig breeding farm；CSFV；Antibody level；Immune；Monitoring

S852.651

B

1001-8964（2017）11-0028-04

2017-08-15

李英林（1971-），男（彝族），四川美姑人，大學(xué)本科，獸醫(yī)師，現(xiàn)從事動(dòng)物疫病防控工作。

*通訊作者：陳弟詩（1981-），男，預(yù)防獸醫(yī)博士，高級(jí)獸醫(yī)師，現(xiàn)從事動(dòng)物傳染病病原分子生物學(xué)研究。