污泥中嗜酸酵母菌的分離鑒定及其重金屬耐受性研究*

邱秀文 周桂香，3 王天峰 單瑤瑤 楊期勇#

(1.九江學(xué)院鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟(jì)研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理與生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(九江學(xué)院)，江西 九江 332005；3.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008；4.九江學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江西 九江 332005)

污泥中嗜酸酵母菌的分離鑒定及其重金屬耐受性研究*

邱秀文1，2周桂香1，2，3王天峰4單瑤瑤4楊期勇1，2#

(1.九江學(xué)院鄱陽湖生態(tài)經(jīng)濟(jì)研究中心，江西 九江 332005；2.九江市流域管理與生態(tài)保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(九江學(xué)院)，江西 九江 332005；3.土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，江蘇 南京 210008；4.九江學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江西 九江 332005)

從污水處理廠的活性污泥中分離純化出一株嗜酸異養(yǎng)菌，命名為JJU-2，并對其進(jìn)行了形態(tài)觀察、生理生化特性測試及26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析，鑒定該菌株為假絲酵母菌(Candidapalmioleophila)。進(jìn)一步對JJU-2菌株的生長特性和重金屬耐受性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：該菌株最適生長pH為3～6，且能適應(yīng)pH<3的極端酸性環(huán)境，最適生長溫度為25 ℃，最高耐受溫度為40 ℃，當(dāng)培養(yǎng)至3 h，JJU-2菌株進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)至18 h進(jìn)入穩(wěn)定期。Cr3+、Ni2+、Pb2+對JJU-2菌株的最低抑菌摩爾濃度分別為20、2.0、40 mmol/L。

嗜酸性 序列分析 重金屬耐受性 假絲酵母菌

隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展和城市化進(jìn)程的加快，生活污水的排放量和處理比例也快速增加[1]。污泥是污水生物處理過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物，隨著污水處理力度的不斷加大，污泥產(chǎn)量也在快速增加[2]。污泥中含有豐富的有機(jī)質(zhì)、氮、磷、鉀等，所以污泥農(nóng)用成為污泥資源化利用的有效途徑之一[3]。污泥農(nóng)用可提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，改善土壤物理性狀并提供植物需要的養(yǎng)分，但是城市污泥中高含量的重金屬是限制污泥農(nóng)用的重要因素之一[4]。目前，脫除污泥中重金屬的方法有吸附法、化學(xué)法和生物淋濾法等[5]。其中，生物淋濾法因耗酸量小、成本低、重金屬去除率高、實(shí)用性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而越來越受關(guān)注[6]。

生物淋濾法是指利用自然界中一些微生物的直接作用或其代謝產(chǎn)物的間接作用，產(chǎn)生氧化、還原、絡(luò)合、吸附或溶解作用，將固相中某些不溶性成分(如重金屬、硫等)浸出的一種技術(shù)[7]。目前，用于生物淋濾的微生物主要是化能自養(yǎng)微生物，該類微生物生長緩慢，重金屬去除效果差[8-9]。有研究表明，自養(yǎng)微生物的一些代謝產(chǎn)物對其自身的生長有抑制作用[10-11]。若在生物淋濾過程中加入以有機(jī)物為能源物質(zhì)的嗜酸異養(yǎng)菌，就可在一定程度上解除這種抑制作用，有利于自養(yǎng)微生物的生長，充分發(fā)揮其去除污泥中重金屬的作用，提高去除率[12-13]。因此，篩選嗜酸異養(yǎng)菌對于提高自養(yǎng)微生物生物淋濾去除重金屬效率具有重要意義。從污水處理廠的活性污泥中分離得到一株嗜酸異養(yǎng)菌，命名為JJU-2，對該菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和分子鑒定，同時(shí)對該菌株的生理生化特征、生長特性和重金屬耐受性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)鹽溶液：(NH4)2SO42.5 g/L、KCl 0.1 g/L、K2HPO41 g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、Ca(NO3)20.2 g/L，用稀硫酸調(diào)pH至4，在121 ℃滅菌15 min。

BSYG液體培養(yǎng)基：1 L基礎(chǔ)鹽溶液中配入1 g/L葡萄糖、1 g/L酵母膏。

BSYG固體培養(yǎng)基：BSYG液體培養(yǎng)基加1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂。

1.2 菌株的富集與分離

JJU-2菌株的富集培養(yǎng)采用BSYG液體培養(yǎng)基。JJU-2菌株的純化采用平板涂布分離法，pH用稀硫酸調(diào)至4。將涂布的平板置于30 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d，即可長出單菌落。然后，選擇具有代表性的單菌落在顯微鏡下觀察，重復(fù)數(shù)次，直至獲得目的菌株的純培養(yǎng)。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)及生理生化鑒定

將富集純化的JJU-2菌株經(jīng)平板涂布置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，觀察單菌落形態(tài)，并于顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。參照文獻(xiàn)[14]對JJU-2菌株做進(jìn)一步鑒定。

1.3.2 菌株基因組DNA的提取

離心收集5 mL JJU-2菌體，用pH=8的TE緩沖液洗滌3次，棄上清液，沉淀備用。采用Ezup柱式基因組DNA提取試劑盒(SK8257)提取JJU-2菌株的基因組DNA。

1.3.3 26S rDNA的D1/D2區(qū)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增

26S rDNA的D1/D2區(qū)的PCR擴(kuò)增采用引物為：正向引物NL1(5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAAAAG-3’)和反向引物NL4(5’-GGT CCG TGTTTC AAG ACG G-3’)。PCR反應(yīng)體系(50 μL)：模板1 μL，10×Buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸(dNTP) 2 μL，高保真(Taq) DNA聚合酶0.4 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，加去離子水至50 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s、52 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min，32個(gè)循環(huán)后72 ℃ 10 min。取5 μL產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1.3.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化與測序

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒(SK8131)純化。純化產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成測序工作。

1.3.5 序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

根據(jù)供試菌株的26S rDNA的D1/D2區(qū)序列，運(yùn)用BLAST程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源序列搜索。下載相關(guān)菌種的序列，用MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

1.4 菌株生理生化特征分析

1.4.1 碳源發(fā)酵測定

利用14種有機(jī)物進(jìn)行發(fā)酵測試，25 ℃培養(yǎng)3 d。

1.4.2 最適初始pH的測定

各取99 mL BSYG液體培養(yǎng)基裝于6個(gè)250 mL三角瓶中，將pH分別調(diào)節(jié)為1～6，121 ℃下滅菌15 min。然后，接種處于對數(shù)生長期的1 mL菌液至培養(yǎng)基中，置于25 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至3 h后，每隔2 h測定600 nm處的吸光度(OD600)。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3 最適生長溫度的測定

各取99 mL BSYG液體培養(yǎng)基裝于6個(gè)250 mL三角瓶中，將pH調(diào)節(jié)為5，121 ℃下滅菌15 min，接種處于對數(shù)生長期的1 mL菌液至培養(yǎng)基中，分別置于不同溫度(20～45 ℃)下，180 r/min振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)至3 h后，每隔2 h測定OD600。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 菌株對重金屬的耐受能力測定

將培養(yǎng)至對數(shù)期的JJU-2菌株涂布于設(shè)置了不同濃度重金屬(Cr3+、Ni2+、Pb2+，分別以硫酸鉻、硫酸鎳、硝酸鉛配制)的BSYG固體培養(yǎng)基中，置于25 ℃的培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d，觀察JJU-2菌株的生長情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的形態(tài)和碳源發(fā)酵測定

如圖1所示，JJU-2菌株在BSYG固體培養(yǎng)基上形成白色菌落，菌落表面呈圓形凸起，表面濕潤光滑且有光澤，不透明，質(zhì)地黏稠，邊緣齊整；JJU-2菌株細(xì)胞呈圓形或卵圓形，出芽增殖。

如表1所示，該菌株可利用大部分有機(jī)物進(jìn)行繁殖，但不利用尿素、L-半胱氨酸、甘油、乙酸、草酸銨。根據(jù)文獻(xiàn)[15]，初步判斷JJU-2菌株為酵母菌。

圖1 JJU-2菌株的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 The morphological characteristics of the strain JJU-2

2.2 26S rDNA的D1/D2區(qū)序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

表1 JJU-2菌株的碳源發(fā)酵測定1)

注：1)“+”表示可利用；“-”表示不可利用。

依據(jù)形態(tài)及生理特征難以對酵母菌進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，而分子鑒定技術(shù)是一種更有效且準(zhǔn)確的鑒定手段。目前，一般認(rèn)為酵母菌同一個(gè)種的不同菌株其26S rDNA的Dl/D2區(qū)堿基差異不超過1%，因此大多數(shù)種都可通過該序列分析進(jìn)行區(qū)別。KURTZMAN等[16]通過26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析對500余種酵母菌進(jìn)行了鑒定，確定了大部分菌種的系統(tǒng)發(fā)育地位。謝婕等[17]利用26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析，對采自西藏羊八井地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸乳中的酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，結(jié)果表明，該方法可有效鑒定不同的酵母菌種。褚學(xué)英等[18]借助分子技術(shù)對7株酵母菌進(jìn)行鑒定，通過同源性比較和系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，其中6株菌與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知酵母有較高的相似性和親緣關(guān)系，另外1株菌確定為新種。本實(shí)驗(yàn)對JJU-2菌株進(jìn)行了26S rDNA的D1/D2區(qū)分子鑒定，結(jié)果見圖2。JJU-2菌株的26S rDNA的D1/D2區(qū)序列與假絲酵母菌(Candidapalmioleophila)17323(KJ705005.1)序列處于同一分支，其相似度最高。因此，結(jié)合其形態(tài)、生理生化特征和分子鑒定技術(shù)，鑒定JJU-2菌株屬假絲酵母菌。

2.3 JJU-2菌株的生長曲線

由圖3可見，JJU-2菌株在1～3 h為延滯期。3～12 h為對數(shù)生長期，該時(shí)期由于營養(yǎng)充足，環(huán)境條件適宜，菌體生長速率大，胞內(nèi)酶系活躍、代謝旺盛，JJU-2菌株數(shù)量呈指數(shù)增長。12～18 h，JJU-2菌株數(shù)量上升變緩，增殖率降低，開始向穩(wěn)定期過渡。JJU-2菌株接種18 h數(shù)量達(dá)到最大值，此后數(shù)量無明顯變化，說明JJU-2菌株進(jìn)入穩(wěn)定期，該時(shí)期JJU-2菌株數(shù)量沒有凈增長或凈減小，保持在相對平衡狀態(tài)。

圖2 JJU-2菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析Fig.2 The phylogenetic tree of the strain JJU-2

圖3 JJU-2菌株的生長曲線Fig.3 The growth curve of the strain JJU-2

2.4 pH對JJU-2菌株的生長活性影響

從圖4可以看出，JJU-2菌株在不同的pH情況下生長存在差異，最適生長pH為3～6，當(dāng)pH=2時(shí)生長仍良好，當(dāng)pH=1時(shí)仍能生存。這表明，JJU-2菌株能適應(yīng)極端的酸性環(huán)境。當(dāng)pH從5增至6時(shí)，JJU-2菌株的OD600反而下降。當(dāng)pH>6或pH<1時(shí)，菌株細(xì)胞酶活力受到抑制，不利于菌株的生長[19]。酵母菌在自然界中分布廣泛，在陸地、城市污泥和水環(huán)境中均有發(fā)現(xiàn)[20-25]。酵母菌主要生長在偏酸性環(huán)境中，可利用各種底物進(jìn)行生長。到目前為止，關(guān)于酵母菌在極端酸性環(huán)境(pH<3)的研究鮮見報(bào)道。JJU-2菌株的分離為嗜酸異養(yǎng)菌協(xié)助去除污泥中的重金屬提供了良好的材料。

圖4 pH對JJU-2菌株的生長活性影響Fig.4 The effect of pH on the growth activity of the strain JJU-2

2.5 溫度對JJU-2菌株的生長活性影響

如圖5所示，當(dāng)溫度≥35 ℃時(shí)，JJU-2菌株生長緩慢，最高耐受溫度為40 ℃，45 ℃時(shí)JJU-2菌株基本停止生長。20～30 ℃時(shí)，JJU-2菌株均生長良好，25 ℃時(shí)OD600達(dá)到最大。所以，JJU-2菌株的最適生長溫度為25 ℃，說明JJU-2菌株為中溫型微生物。

圖5 溫度對JJU-2菌株的生長活性影響Fig.5 The effect of temperature on the growth activity of the strain JJU-2

樊潔[26]研究了不同溫度對酵母菌株A05生長活性的影響，結(jié)果表明，菌株A05在20～25 ℃時(shí)生長緩慢，在30～35 ℃時(shí)生長良好。杭姣等[27]從新疆羅布泊地區(qū)取得一株淺白隱球酵母菌，研究發(fā)現(xiàn)，該菌在39 ℃的高溫中也能正常生長，表明淺白隱球酵母菌是耐高溫型菌。該菌與JJU-2菌株有很大差異。劉瀅等[28]研究了溫度對增香酵母菌株C6生長活性的影響，發(fā)現(xiàn)菌株C6的最適生長溫度為28 ℃，在24～32 ℃內(nèi)均良好生長。該菌株最適溫度與JJU-2菌株最適溫度基本接近。

2.6 JJU-2菌株對重金屬離子的耐受性研究

不同金屬離子抑制菌株生長的最低濃度叫做最低抑菌濃度(MIC，以摩爾濃度計(jì))。通常MIC與菌體的重金屬耐受性成正比。從圖6可以看出，Cr3+、Ni2+、Pb2+對JJU-2菌株的MIC分別為20、2.0、40 mmol/L。因此，JJU-2菌株對3種重金屬離子的耐受能力由強(qiáng)到弱依次為Pb2+(40 mmol/L)>Cr3+(20 mmol/L)>Ni2+(2.0 mmol/L)。

麗麗[29]研究了Pb2+對酵母菌株WT6-5生長的影響，結(jié)果表明，較低濃度Pb2+可刺激酵母菌株WT6-5的生長，高濃度Pb2+則會抑制菌株WT6-5的生長。這與本研究分離到的菌株對Pb2+的抗性一致。王世梅等[30]從固體廢物中分離得到酵母菌株R30，研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度Cr3+對酵母菌株R30的生長有影響，當(dāng)Cr3+>10 mmol/L時(shí)明顯抑制酵母菌株R30的生長。這與JJU-2菌株對Cr3+的耐受能力接近。

圖6 JJU-2菌株對不同摩爾濃度重金屬離子的耐受性Fig.6 The tolerance of JJU-2 strain to different heavy metals of different molar concentrations

3 結(jié) 論

(1) 從污水處理廠的活性污泥中分離得到JJU-2菌株。通過對JJU-2菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定、生理生化特征測試及26S rDNA的D1/D2區(qū)序列分析，確定該菌株為假絲酵母菌。

(2) JJU-2菌株最適生長pH為3～6，當(dāng)pH=2時(shí)生長良好，當(dāng)pH=1時(shí)仍能生存，說明JJU-2菌株能適應(yīng)極端的酸性環(huán)境；最適生長溫度為25 ℃，最高耐受溫度為40 ℃；JJU-2菌株培養(yǎng)至3 h進(jìn)入對數(shù)生長期，培養(yǎng)至18 h進(jìn)入穩(wěn)定期。

(3) JJU-2菌株對Cr3+、Ni2+、Pb2+均有不同程度的耐受性，MIC分別為20、2.0、40 mmol/L。

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Isolationandidentificationofanacidophilusyeastfromsewagesludgeanditstolerancetoheavymetal

QIUXiuwen1，2，ZHOUGuixiang1，2，3，WANGTianfeng4，SHANYaoyao4，YANGQiyong1，2.

(1.PoyangLakeEco-economyResearchCenter，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；2.JiujiangKeyLaboratoryofBasinManagementandEcologicalProtection，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005；3.StateKeyLaboratoryofSoilandSustainableAgriculture，InstituteofSoilScience，ChineseAcademyofSciences，NanjingJiangsu210008；4.CollegeofChemistryandEnvironmentalEngineering，JiujiangUniversity，JiujiangJiangxi332005)

A heterotrophic acidophilic strain，named JJU-2，was isolated from sewage sludge of a sewage treatment plant. JJU-2 was identified asCandidapalmioleophilaby morphology，chemical and physical characteristics and 26S rDNA D1/D2 gene sequence analysis. The experiment of grow characteristics and tolerance to heavy metal was carried out. The results showed that：the optimum pH was 3-6 and it tolerated extreme acid environment (pH<3). The optimum temperature and the highest temperature were 25 ℃ and 40 ℃，respectively. The strain JJU-2 grew to logarithmic phase after 3 hours of inoculation and grew to stable phase after 18 hours. The maximum tolerance concentrations of Cr3+，Ni2+and Pb2+were 20，2.0 and 40 mmol/L，respectively.

acidophily; sequence analysis; tolerance to heavy metal;Candidapalmioleophila

邱秀文，男，1984年生，博士，講師，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物。#

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*國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21367014)；江西省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.20151BAB203026)；江西省科技廳對外科技合作計(jì)劃項(xiàng)目(No.20132BDH80008)；江西省教育廳科技項(xiàng)目(No.GJJ14732)；長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(No.YRWEF201502)。

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.11.001

2016-10-04)