硅膠柱分離純化亞麻木脂素工藝的研究

楊宏志 周亞男

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

硅膠柱分離純化亞麻木脂素工藝的研究

楊宏志 周亞男

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319)

依據(jù)薄層層析法確定了硅膠柱層析純化亞麻木脂素的最佳洗脫液為以氯仿、甲醇、醋酸和水的比例為8:4:0.5:0.5組成的體系；硅膠柱上樣濃度最佳值為15 mg/mL，洗脫流速為1.0 mL/min分離效果最好；在上述條件下，得到亞麻木脂素純度可以達(dá)到80.13%；檢測結(jié)果顯示：亞麻木脂素粗品經(jīng)硅膠柱純化后，通過薄層層析檢測顯示出現(xiàn)亞麻木脂素單一點(diǎn)，HPLC檢測表明經(jīng)硅膠柱純化后出現(xiàn)單一峰且其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同，說明純化后純度較高。

硅膠柱，分離純化，亞麻木脂素，工藝

亞麻分為油用亞麻和纖用亞麻。我國油用亞麻主要分布在華北等地，主產(chǎn)區(qū)是內(nèi)蒙古、甘肅、寧夏、河北、山西、陜西、和新疆。我國年種植亞麻50萬hm2左右，產(chǎn)量約48萬t，在世界排名第二[1-3]。

木脂素主要為開環(huán)異落葉松樹脂酚二葡萄糖苷(SDG)，Bakke等[4]首次從亞麻籽中將亞麻木脂素分離出來。木脂素是一類由雙分子苯丙素合成的天然酚類化合物，絕大多數(shù)通過側(cè)鏈β-碳原子聚合而形成。木脂素廣泛分布于植物界及多種食物之中，尤其是在整粒的谷物和豆類之中，一般以植物的木質(zhì)部與樹脂中存在的較多，故稱為木脂素。盡管許多植物和食物中都含有木脂素，但在亞麻籽中的含量最高，達(dá)到6.35 mg/g濕基[5]。

木脂素已經(jīng)顯示出具有抗癌的特性，對(duì)早期結(jié)腸癌和乳腺癌具有預(yù)防作用，并且對(duì)腎功能障礙具有潛在的療效。對(duì)絕經(jīng)婦女而言，木脂素還可降低其血清低密度脂蛋白(LDL)膽固醇的密度，并可減緩更年期綜合癥[6-7]。

柱層析分離的對(duì)象主要是中等分子質(zhì)量的物質(zhì)，尤其是復(fù)雜的天然物質(zhì)，這類物質(zhì)的極性范圍很大，對(duì)于性質(zhì)相近的物質(zhì)，柱層析能夠提供很好的分離效果[8]。

柱層析對(duì)于制備分離有較大的靈活性和方便性，并且具有分離高、制備量大、成本低等優(yōu)點(diǎn)，便于放大和實(shí)現(xiàn)自動(dòng)控制。此外，柱層析常用的洗脫劑通常易于揮發(fā)，因此也易于從含有欲分離組分的餾分中將其去除[9-10]。

本研究將經(jīng)過超聲波輔助提取得到的木脂素粗提取液分離出來，選擇硅膠做柱材，進(jìn)行柱層析分離純化其中的SDG，通過對(duì)洗脫速度、上樣濃度等洗脫條件的考察，最終得出最佳洗脫工藝。

1 材料與設(shè)備

1.1 試劑和材料

原料：亞麻木脂素提取物(其中SDG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為34.37%)

SDG(純度95%)標(biāo)準(zhǔn)品：成都邦成生物工程公司；氯仿、甲醇、冰醋酸、磷鉬酸、乙醇、NaOH、鹽酸：分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠

1.2 試驗(yàn)設(shè)備

T6型紫外-可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器公司；PC-2250高效液相色譜：天津蘭博科技有限公司；DK-450B型電熱恒溫水浴鍋：上海森信試驗(yàn)儀器有限公司；SG2型pH計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司；R-200真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、V-500真空泵：BüCHI；L104型電子天平：Mettler Toledo；層析柱(Ф1.6 cm×20 cm)、層析柱Ф2.0 cm×30 cm：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；硅膠G層析板:青島海洋有限公司；薄層色譜展開缸XY:上海信誼儀器廠；MLS-3202真空冷凍干燥機(jī):SANYO Electric CO.Ltd；YY1-3系列大孔柱層層析硅膠:青島裕民源硅膠試劑廠。

2 試驗(yàn)方法

2.1 硅膠的預(yù)處理試驗(yàn)

2.1.1 柱材選擇

因?yàn)楣枘z分離具有重復(fù)性較好，可再生的特點(diǎn)，作為分離純化的介質(zhì)非常合適。硅膠是一種極性不可溶物，利用硅膠吸附層析可以分離非極性、極性等組分。當(dāng)混合物質(zhì)通過硅膠時(shí)，由于極性物質(zhì)和荷電物質(zhì)與硅膠結(jié)合緊密，留在柱子上，非極性物質(zhì)則直接通過柱子，因此非極性物質(zhì)所需洗脫時(shí)間短，極性物質(zhì)的所需洗脫時(shí)間長。非極性物質(zhì)選用氯仿洗脫液，極性較大的物質(zhì)可用甲醇洗脫，要進(jìn)行有效的分離可采用混合溶劑作為洗脫液[11]。

2.1.2 硅膠的活化

本試驗(yàn)采用YY1-3系列大孔柱層層析硅膠，平均孔徑12～18 nm，孔容1.05～1.25 mL/g，比表面240～300 m2/g。含水量關(guān)系硅膠的活性，由于水的極性大，易于與硅膠活性中心結(jié)合以降低活性，因此含水量越高，活性越低?；钚蕴叩奈镔|(zhì)難以掙脫硅膠吸附，活性太低會(huì)造成分離能力的下降，對(duì)于不同的體系，需要使用不同活性的硅膠，通過改變含水量來改變硅膠的活性，達(dá)到體系的目的。

本試驗(yàn)采用在105 ℃下脫水活化12 h，活化后的硅膠裝入干燥器中，封存72 h后備用的硅膠的活化方法。

2.2 柱層析系統(tǒng)的組裝試驗(yàn)

2.2.1 裝柱

已活化好的硅膠，加入適量氯仿浸泡過夜。用玻璃棒攪拌硅膠，使之懸浮于氯仿中，成為糊狀，漿狀。然后將漿狀料沿著層析柱壁慢慢地傾倒入層析柱中，邊攪拌邊加，一次加完，利于硅膠沉降。此時(shí)注意不要產(chǎn)生氣泡，傾倒至離柱頂5 cm處，停止加料，關(guān)上活塞，夾住硅膠管，防止柱內(nèi)液體流出，靜止一夜，讓硅膠完全沉降。操作時(shí)，保證液面不低于硅膠的床層頂面，使用前要對(duì)層析柱進(jìn)行檢查，有紋路，有氣泡都必須重新裝柱[12]。

2.2.2 柱平衡

用洗脫液以一定的流速淋洗硅膠柱，流速應(yīng)低于層析時(shí)所需的流速，在平衡過程中逐漸加大流速。將流出洗脫液，經(jīng)紫外檢測儀檢測，檢測信號(hào)采集基線穩(wěn)定，說明硅膠柱達(dá)到平衡，方可使用。

2.2.3 上樣

硅膠柱達(dá)平衡后，吸取適量亞麻木脂素粗提濃縮溶液，緩慢加載硅膠床層頂面，一定要盡量減少對(duì)床層擾動(dòng)。

2.2.4 洗脫和收集

上樣后打開流出口，讓樣品滲入硅膠床內(nèi)，當(dāng)樣品液面與硅膠床表面相平時(shí)，加入洗脫液沖洗管壁，使之全部進(jìn)入硅膠床內(nèi)，以一定速度洗脫，在流出口選用小試管進(jìn)行收集，每管10 mL，將收集的洗脫液逐一進(jìn)行紫外檢測器檢驗(yàn)。

2.2.5 溶劑回收

將洗脫液濃縮后得到溶劑收集到一起，向其中加入一定量的水充分振蕩，利用分液漏斗進(jìn)行靜止分層，下層為氯仿相，上層為甲醇和水的混合相。氯仿沸點(diǎn)61～62 ℃，甲醇沸點(diǎn)為64.7 ℃，將靜止分層的兩相分別進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，收集流出液，可以重復(fù)使用[13]。

2.3 柱層析洗脫試驗(yàn)的確定

2.3.1 洗脫溶劑的選擇

依據(jù)薄層層析(TLC)展開劑的展開原則，分別選擇，氯仿、甲醇(8:4)體系，氯仿、甲醇、醋酸(8:4:0.5)體系，氯仿、甲醇、醋酸、水(8:4:0.5:0.5)體系，乙酸乙酯、甲醇、水(4:1:5)體系和正丁醇、醋酸、水(6:4:1)5種體系對(duì)亞麻木脂素標(biāo)品和亞麻木脂素提取液進(jìn)行展開。通過比較樣品中的化合物在薄層層析板上的位置用比移值Rf確定最佳展開劑，從而確定硅膠柱層析的最佳洗脫液。

2.3.2 上樣濃度的選擇

按照確定的最佳洗脫劑，流速控制在2.0 mL/min，進(jìn)樣體積為5 mL，考察了不同濃度的亞麻木脂素上樣的柱層析效果。

2.3.3 洗脫流速的選擇

按照確定的最佳洗脫劑，亞麻木脂素以一定的濃度進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5 mL，在25 ℃下考察了洗脫劑流速分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL/min時(shí)的層析效果。

2.4 柱層析洗脫液的檢測

2.4.1 硅膠薄層層析法

按照確定的最佳洗脫劑進(jìn)行展開，展開方法：用毛細(xì)管吸取樣品液在距層析板底約1.5 cm處點(diǎn)樣，使樣點(diǎn)直徑不大于0.5 cm，晾干樣點(diǎn)后放入裝有層析溶劑的層析缸中，蓋上層析缸蓋，展開約1 h，待溶劑前緣行進(jìn)至層析板前緣約1 cm處層析結(jié)束，取出薄板，用電吹風(fēng)去除板上剩余溶劑；顯色方法：干燥的層析板上，噴5%磷鉬酸醇溶液后，吹干，在105 ℃烘烤2 min，亞麻木脂素斑點(diǎn)成藍(lán)紫色，通過和亞麻木脂素標(biāo)品的比移值相比對(duì)，確定樣品中的亞麻木脂素。

2.4.2 亞麻木脂素的HPLC分析

2.4.2.1 色譜條件

色譜柱，Hypers(R)ODS2反相柱(柱規(guī)格，φ 4.6 mm×250 mm填料：C18)

檢測波長：280 nm

柱溫：25 ℃

流速：1 mL/min

進(jìn)樣量：20 μL

采用乙腈水(含0.1%的醋酸)體系，洗脫梯度為：

t=0～5 min， B：95%～85%，

t=5～25 min， B：85%～70%，

t=25～40 min， B：70%～30%

A乙腈，B為含有0.1%的醋酸的水。

2.4.2.2 進(jìn)樣

精密吸取樣品溶液20 μL，按上述色譜條件進(jìn)樣。測定保留時(shí)間和峰面積。

2.4.2.3 計(jì)算

對(duì)所得樣品圖譜和亞麻木脂素的標(biāo)品圖譜對(duì)比保留時(shí)間。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=422 739x+9 634，R2=0.992 9，求出樣品溶液中亞麻木脂素的含量。

將紫外檢測器UV 280 nm檢測分離的亞麻木脂素組分，繪制淋洗曲線中的峰值的進(jìn)行薄層層析定性檢測，將收集到亞麻木脂素含量較高的小試管中的洗脫液合并，減壓濃縮，冷凍干燥。凍干后再用甲醇溶解進(jìn)行HPLC檢測，并計(jì)算含量，換算純度和產(chǎn)率。

SDG的產(chǎn)率=C1/C2×100%

(1)

式中:C1為柱層析后得到亞麻木脂素的量;C2為上樣液中亞麻木脂素的含量。

SDG的純度=S1/S2×100%

(2)

式中:S1為柱層析后測定亞麻木脂素的質(zhì)量;S2為柱層析后經(jīng)冷凍干燥得亞麻木脂素的質(zhì)量。

3 試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1 柱層析洗脫試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1 最佳洗脫劑的確定

氯仿、甲醇(8:4)體系，氯仿、甲醇、醋酸(8:4:0.5)體系，氯仿、甲醇、醋酸、水(8:4:0.5:0.5)體系，乙酸乙酯、甲醇、水(4:1:5)體系和正丁醇、醋酸、水(6:4:1)5種體系的展開結(jié)果表明，分別對(duì)亞麻木脂素標(biāo)品和亞麻木脂素提取液進(jìn)行展開。通過比較樣品中的化合物在薄層層析板上的位置用比移值Rf確定最佳展開劑，從而確定硅膠柱層析的最佳洗脫液。結(jié)果表明，各種展開劑的比移值Rf在0.24～0.45之間，其中以氯仿、甲醇、醋酸和水的比例為8:4:0.5:0.5的洗脫劑對(duì)應(yīng)的比移值Rf最大，為0.45，因而是薄層層析的最佳展開劑，因此，選定該體系為本試驗(yàn)的洗脫劑。

3.1.2 上樣濃度的選擇

以氯仿、甲醇、醋酸和水的比例為8:4:0.5:0.5作為洗脫劑，流速控制在2.0 mL/min，上樣濃度分別為10、15、20 mg/mL分別進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為5 mL。淋洗曲線如圖1所示。

圖1 不同上樣濃度的淋洗曲線

由圖1可看出上樣濃度過高都不利于不同組分物質(zhì)的分離，上樣濃度超過15 mg/mL時(shí)不能將組分很好的分離，上樣濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)不能將目標(biāo)組分亞麻木脂素與其他組分分開，上樣濃度過低洗脫洗脫液中含量過低不利于檢測和回收，所以選用上樣濃度為15 mg/mL。

淋洗曲線的第二峰位置的洗脫液回收，通過薄層層析的定性檢測可以確定是亞麻木脂素，HPLC定性檢測結(jié)果與薄層層析定性檢測結(jié)果一致。通過式(1)、式(2)計(jì)算出產(chǎn)率和純度(見表1)。

表1 上樣濃度對(duì)亞麻木脂素柱層析分離的影響

由表1可以看出隨著上樣質(zhì)量濃度的提高，純度下降。是由于質(zhì)量濃度升高，樣品中與亞麻木脂素極性相近的各組分的層析柱峰形部分重疊，當(dāng)上樣質(zhì)量濃度大于15 mg/mL，硅膠柱吸附飽和，洗脫曲線拖尾嚴(yán)重，純度和產(chǎn)率都下降到較低值，這樣達(dá)不到純化的要求?？紤]到在實(shí)際生產(chǎn)中希望在保證產(chǎn)品分離純度和產(chǎn)率的條件下處理盡量多的樣品，選擇亞麻木脂素的上樣濃度為15 mg/mL。

3.1.3 洗脫流速的選擇

以氯仿、甲醇、醋酸和水的比例為8:4:0.5:0.5作為洗脫劑，上樣濃度為15 mg/mL，進(jìn)樣體積為5 mL，流速分別控制在1.0、2.0、3.0 mL/min。淋洗曲線如圖2所示。

由圖2可知在洗脫流速在1.0、2.0 mL/min均能很好的將亞麻木脂素分離，流速為1.0 mL/min分離效果最好，當(dāng)洗脫流速增加到3.0 mL/min出現(xiàn)拖尾，致使亞麻木脂素與其他組分不能得以分離，選擇洗脫流速1.0 mL/min分離效果最好。

同樣將淋洗曲線的第二峰位置的洗脫液回收，通過薄層層析的定性檢測可以確定是亞麻木脂素，HPLC定性檢測結(jié)果與薄層層析定性檢測結(jié)果一致。通過式(1)、式(2)計(jì)算出產(chǎn)率和純度(見表2)。

表2 洗脫速率對(duì)亞麻木脂素柱層析分離的影響

由表2可以看出當(dāng)洗脫液流速為1 mL/min時(shí)，純度和產(chǎn)率都較高，分離所需的時(shí)間相對(duì)較長，當(dāng)流速增大至3.0 mL/min時(shí)，兩相間的濃度難以分配平衡也導(dǎo)致分離效果不佳，拖尾明顯，且洗脫劑耗量較大。從要求較高純度和產(chǎn)率的角度選擇洗脫流速為1 mL/min最為合適。

圖2 不同流速的淋洗曲線

3.2 硅膠柱層析分離亞麻木脂素的檢測結(jié)果分析

3.2.1 硅膠薄層層析法

圖3為純化前和純化后亞麻木脂素的鑒定結(jié)果，圖3中1、2為純化前樣品的薄層展開點(diǎn)，3為亞麻木脂素標(biāo)品的薄層展開點(diǎn)，4為經(jīng)硅膠柱層析后得到的亞麻木脂素的展開點(diǎn)。從圖3中可以看出，亞麻木脂素粗品經(jīng)硅膠柱層析后，通過薄層層析檢測時(shí)，為亞麻木脂素單一點(diǎn)，說明得到是純度較高的亞麻木脂素。

圖3 薄層層析鑒定的結(jié)果

3.2.2 HLPC的檢測結(jié)果

高效液相色譜的圖譜如圖4～圖6所示。

圖4 亞麻木脂素SDG標(biāo)準(zhǔn)品的圖譜

圖5 亞麻木脂素粗提液的HPLC圖譜

圖6 硅膠純化的亞麻木脂素的HPLC圖譜

從圖4～圖6中可以看出，亞麻木脂素粗提液經(jīng)硅膠柱純化后出現(xiàn)單一峰，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同，說明純化后純度較高，這與薄層層析的鑒定結(jié)果一致。

在最佳上樣質(zhì)量濃度為15 mg/mL，洗脫速度為1.0 mL/min條件下，將亞麻木脂素粗提液分離，得到亞麻木脂素洗脫液，減壓蒸發(fā)，冷凍干燥，純度可以達(dá)到80.13%。

4 結(jié)論

4.1 依據(jù)薄層層析法，通過比較樣品中的化合物在薄層層析板上的位置用比移值Rf確定最佳展開劑，從而確定硅膠柱層析的最佳洗脫液。結(jié)果表明，以氯仿、甲醇、醋酸和水的比例為8:4:0.5:0.5的洗脫劑對(duì)應(yīng)的比移值Rf最大，為0.45，因而是薄層層析的最佳展開劑，因此，選定該體系為本試驗(yàn)的洗脫劑。

4.2 硅膠柱上樣濃度過高不利于不同組分物質(zhì)的分離，上樣濃度超過15 mg/mL時(shí)不能將組分很好的分離，上樣濃度達(dá)到20 mg/mL時(shí)不能將目標(biāo)組分亞麻木脂素與其他組分分開，上樣濃度過低洗脫洗脫液中含量過低不利于檢測和回收，所以選用上樣濃度為15 mg/mL。

4.3 硅膠柱洗脫流速在1.0、2.0 mL/min均能很好的將亞麻木脂素分離，流速為1.0 mL/min分離效果最好，當(dāng)洗脫流速增加到3.0 mL/min出現(xiàn)拖尾，致使亞麻木脂素與其他組分不能得以分離。

4.4 亞麻木脂素粗品經(jīng)硅膠柱層析后，通過薄層層析檢測時(shí)，為亞麻木脂素單一點(diǎn)，說明得到是純度較高的亞麻木脂素；HPLC檢測結(jié)果表明，亞麻木脂素粗提掖經(jīng)硅膠柱純化后出現(xiàn)單一峰，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間相同，說明純化后純度較高，這與薄層層析的鑒定結(jié)果一致。

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The Technology of Separation and Purification of Flaxseed Lignans by Silica Gel Column

Yang Hongzhi Zhou Yanan

(Heilongjiang Bayi Agricultural University,Daqing 163319)

On the basis of thin layer chromatography to determine the optimum purification eluate of flax lignan was using chloroform methanol,acetic acid and water system with a ratio of 8:4: 0.5: 0.5 for the silica gel column chromatography;with the sample concentration of 15 mg/mL,flow rate of 1 mL/min as the best separation parameters,flax lignan purity can reach 80.13% in the above conditions;test results showed that:the crude flax lignan purified by silica gel column,display a single point tested by thin-layer chromatography,HPLC assay showed that purified lignan by silica gel column appeared a single peak and had the same retention time with the standard product.It showed that the purity was higher after purification.

silica gel column，separation and purification，flaxseed lignans，technology

TS222

A

1003-0174(2017)11-0117-06

時(shí)間：2017-10-24 16:40:48

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.2864.TS.20171024.1640.002.html

黑龍江省普通高等學(xué)校骨干教師創(chuàng)新能力資助計(jì)劃項(xiàng)目(1151G032)

2017-05-16

楊宏志，男，1963年出生，教授，農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程