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    虎掌南星多糖含量及單糖組成研究

    2017-12-07 01:42:13莫雪林劉玉杰李濤黎江華吳純潔
    中藥與臨床 2017年6期
    關(guān)鍵詞:南星醛酸單糖

    莫雪林,劉玉杰,李濤,黎江華,吳純潔

    ·品種品質(zhì)·

    虎掌南星多糖含量及單糖組成研究

    莫雪林,劉玉杰,李濤,黎江華,吳純潔

    目的:研究虎掌南星多糖的含量及其單糖種類及摩爾比。方法:首先采用水提醇沉的方法提取虎掌南星多糖并用苯酚-硫酸法來測定其粗多糖含量;再用柱前衍生化-高效液相色譜法來測定單糖組成并通過標準回歸方程計算單糖摩爾比。結(jié)果:虎掌南星多糖提取率為4.65%,含有量為56.3%,由甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖組成,其單糖摩爾比為3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69。結(jié)論:苯酚-硫酸法具有顯色穩(wěn)定,操作簡便,重復性良好等優(yōu)點,可用于虎掌南星多糖含有量的測定;柱前衍生化高效液相色譜法具有簡單、準確、快速、重現(xiàn)性好等優(yōu)點,可用于虎掌南星多糖中單糖組成分析。

    虎掌南星;多糖;單糖組成;苯酚-硫酸比色法;高效液相色譜法

    虎掌南星為天南星科植物掌葉半夏(Pinellia pedatisectaSchott.)的干燥塊莖,具有化痰散結(jié)的功效[1]?;⒄颇闲堑幕瘜W成分組成較多,主要含有生物堿類、環(huán)二肽類、甙類、β-谷甾醇,氨基酸類、多糖、凝集素A和大量無機微量元素等[2]。大量研究表明,虎掌南星具有多種生物活性,如抗氧化、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗驚厥等[3]。查閱文獻可知,目前研究較多的活性成分包括生物堿類[4]、核苷類[5]、總有機酸[6]、凝集素A[7,8]和氨基酸[9],缺乏對虎掌南星多糖研究。近年來,隨著各種提取、分離、純化方法的進步和發(fā)展,同時伴隨著核磁共振及質(zhì)譜等技術(shù)的日益成熟,使多糖的研究逐漸深入和擴大,不斷的有新的多糖被發(fā)現(xiàn)[10],多糖的相關(guān)研究成為熱門,目前已有大量實驗證明中藥多糖具有促進免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、抗炎、抗應(yīng)激、抗輻射及抗衰老等多種生物活性,且作為藥物其毒副作用極小[11]。

    目前在多糖的研究中,單糖組成的分析對多糖性質(zhì)、結(jié)構(gòu)及其構(gòu)-效關(guān)系研究具有非常重要的意義,同時將有助于更加全面的掌握其結(jié)構(gòu)及其藥理作用。但由于多糖的光學特性較差,在紫外下吸收較弱,若采用高效液相色譜法測定單糖組成時需應(yīng)用熒光試劑對樣品進行衍生化處理后方可檢測到相關(guān)化學信號。因此,本實驗運用柱前衍生化高效液相色譜(HPLC)法測定虎掌南星多糖的單糖種類組成及摩爾比,對虎掌南星多糖的基本性質(zhì)進行初探,以期為進一步尋找虎掌南星多糖中的活性成分及其構(gòu)-效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    Agilent 1260 型高效液相色譜儀(美國Agilent公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);BP 211D萬分之一天平(SARTORIUS公司);UPT-11-10T 優(yōu)普系列超純水器(成都超純科技有限公司);QL-901渦旋混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)。

    1.2 材料

    甘露糖(批號∶151112)、葡萄糖(批號∶150929)、半乳糖(批號∶151110)和阿拉伯糖(批號∶150918)均購于四川省維克奇生物科技有限公司,半乳糖醛酸(批號:111646)購于中國藥品生物制品檢定所;1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP)(AR,天津市科密歐化學試劑有限公司);三氟乙酸、磷酸二氫鉀、氯仿、氫氧化鈉(AR,均購自成都市科龍化工試劑廠);甲醇、乙腈(色譜純,F(xiàn)isher公司);水為超純水;其他試劑為分析純?;⒄颇闲菢悠焚徲谒拇ㄊ〕啥际泻苫ǔ刂兴幉氖袌?,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學李敏教授鑒定為天南星科植物掌葉半夏(Pinellia pedatisectaSchott.)的干燥塊莖。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 虎掌南星多糖提取

    將干燥的虎掌南星樣品磨碎,過60目篩,稱取150 g的虎掌南星樣品置于圓底燒杯中,并用3倍量95%的乙醇回流2 h去除有色物質(zhì),單糖,低聚糖和小分子物質(zhì)。過濾,藥渣揮盡乙醇后,加入10倍量的蒸餾水,加熱回流提取2次,每次2 h,提取液冷卻至室溫后,過濾,合并兩次濾液,通過真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將濾液濃縮至300 mL,加入一定量淀粉酶除去淀粉后,加熱除去多余淀粉酶,冷卻后,離心(5000 r?min-1,10 min),過濾,上清液緩慢加95%乙醇使醇含量達到80%,充分攪拌,于4 ℃冰箱中靜置過夜,抽濾,濾渣依次用3 ~ 5倍體積的無水乙醇、丙酮、乙醚充分洗滌3次,然后50 ℃減壓干燥,即得虎掌南星多糖,計算其多糖提取率為4.65%。

    2.2 虎掌南星多糖含量測定

    [12]以葡萄糖作為標準物質(zhì),采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量。

    2.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取“2.1”項下提取的虎掌南星多糖10 mg,定容到100 mL的容量瓶中,即得質(zhì)量濃度為0.1 mg?mL-1的樣品溶液。

    2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取105 ℃下干燥至恒重的葡萄糖對照品10 mg,定容到100 mL的容量瓶中,搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.1 mg?mL-1的葡萄糖標準溶液。

    2.2.3 線性關(guān)系考察 精密移取對照品溶液0.2 mL,0.4 mL,0.6 mL,0.8 mL,1.0 mL,1.2 mL,分別加水至2.0 mL,迅速加入5.0%苯酚溶液1 mL,搖勻,再加入5 mL的濃硫酸,搖勻,室溫反應(yīng)10 min,然后置于沸水中水浴加熱15 min,取出置于冷水中冷卻至室溫,于490 nm處測定對照品溶液的吸光度A。以A為縱坐標,對照品質(zhì)量濃度為橫坐標,得回歸方程Y = 4.6629X - 0.0539(R= 0.9999),表明葡萄糖質(zhì)量濃度在0.0025~0.015mg?mL-1內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。

    2.2.4 多糖含量測定 精密吸取對照品及樣品溶液各1 mL,加水至2.0 mL,并迅速加入5.0%苯酚溶液1 mL,搖勻,再連續(xù)加入5 mL的濃硫酸,搖勻,室溫下反應(yīng)10 min,然后置于沸水中水浴加熱15 min,取出置于冷水中冷卻至室溫,以水作為空白對照組,于490 nm處測定樣品溶液及空白對照組溶液的吸光度A。由“2.2.3”中的回歸方程計算樣品溶液中葡萄糖濃度,并計算虎掌南星多糖中多糖含量為56.3%。

    2.3 虎掌南星多糖的單糖組成

    單糖組成分析參考文獻[13],采用PMP柱前衍生化高效液相色譜法進行。

    2.3.1 虎掌南星多糖的水解液的制備 精密稱取虎掌南星多糖樣品20 mg,放入10 mL的具塞試管中,加入2 moL?L-1三氟乙酸(TFA)溶液8 mL,渦旋,使其完全溶解,然后放置于110 ℃烘箱內(nèi)5 h使虎掌南星多糖充分水解,冷卻至室溫,離心(5000 r?min-1,10 min)得到的上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將上清液旋干,并用甲醇溶液反復旋蒸3次除去殘留的TFA溶液,加入2 mL的超純水溶解定容,即得到虎掌南星多糖水解液。

    2.3.2 單糖對照品溶液的制備 分別精密稱取一定量的甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖5種單糖對照品于2mL容量瓶中,加超純水定容至刻度,得到一定質(zhì)量濃度的單糖對照品溶液。取等體積的5種單糖對照品溶液混合,即得混合單糖對照品溶液。

    2.3.3 單糖對照品和樣品溶液的衍生化溶液的制備 分別精密量取混合單糖對照品溶液和虎掌南星多糖水解溶液各0.2 mL于2 mL的EP管中,依次加入0.2 mL 0.5 moL?L-1的PMP甲醇溶液和0.2 mL 0.3 moL?L-1NaOH溶液,混勻后于70℃水浴加熱1 h,并不時振搖,取出室溫冷卻10 min,用0.2 mL 0.3 moL?L-1HCl中和,混勻后用1 mL三氯甲烷萃取,渦旋3 min,離心(5000 r?min-1,10 min),小心棄去有機層(下層),連續(xù)萃取3次,上層水相,加水定容至5 mL,混勻,過0.45 μm微孔濾膜,得到溶液,用于HPLC分析。

    2.3.4 色譜條件 色譜柱:PHENOMENEX C18(250×4.6 mm,5 μm),流動相:0.05 M磷酸緩沖液(pH=6.8)和乙腈的混合物(82∶18,v/v),柱溫:30 ℃,流速:1.0 mL?min-1,檢測波長:245 nm,進樣體積:10 μL。

    2.3.5 線性關(guān)系考察 取混合單糖對照品衍生化溶液,按照“2.3.4”項色譜條件下分別進樣2、4、6、8、10 μL,測定峰面積。以單糖的進樣量(ug)為橫坐標(X),峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸,其回歸方程見表1。

    表1 單糖的標準曲線方程

    2.3.6 精密度試驗 取虎掌南星衍生化樣品溶液,按照“2.3.4”項色譜條件下連續(xù)進樣6次,記錄各吸收峰面積,分別以峰面積計算其RSD值,結(jié)果甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為2.93%,2.41%,0.22%,1.77%,2.77%,表明方法精密度良好。

    2.3.7 重復性試驗 精密稱取6份虎掌南星多糖樣品,每份約20 mg,經(jīng)水解及衍生化處理后按照“2.3.4”項色譜條件下進樣6次,測定峰面積,通過計算得到甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖RSD值分別為1.18%,1.81%,0.080%,1.25%,2.21%。

    2.3.8 穩(wěn)定性試驗 取虎掌南星多糖衍生化溶液,分別在0、2、4、8、12、16 h,按照“2.3.4”項色譜條件下進樣,記錄峰面積,通過計算得到甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面積的RSD值分別為2.57%,2.27%,0.17%,1.73%,1.94%,結(jié)果表明虎掌南星樣品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.3.9 加樣回收率試驗 精密稱取6份虎掌南星多糖樣品,每份約20 mg,分別加入混合單糖對照品溶液適量,經(jīng)水解衍生化處理后,按照“2.3.4”項色譜條件下進樣,記錄峰面積,計算加樣回收率,甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率和RSD值。結(jié)果表明:甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的平均回收率分別為:99.8%,99.2%,98.9%,100.1%,99.6%,RSD值分別為1.57%,1.69%,2.31%,1.03%,1.89%。

    2.3.10 樣品分析 將單糖混合對照品的圖譜與虎掌南星多糖的色譜圖譜進行對比(見圖 1),并根據(jù)單糖峰面積計算虎掌南星多糖中各個單糖的含量及其摩爾比。由圖可知,虎掌南星多糖由4種中性單糖(甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖)和1種酸性單糖(半乳糖醛酸)組成。通過對樣品峰面積的計算可知,虎掌南星多糖中甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖的摩爾比為3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69,其中葡萄糖含量最大,推測其原因可能是由于提取的虎掌南星多糖不夠純,含有一定量的淀粉,其在淀粉酶酶解的條件下轉(zhuǎn)化為二糖—麥芽糖,麥芽糖在酸性條件下徹底水解成為單糖葡萄糖。

    圖1 混合單糖對照品(a)和虎掌南星多糖水解后樣品(b)的HPLC圖

    3 結(jié)論

    本實驗采用傳統(tǒng)的水提醇沉法,對虎掌南星多糖進行提取,以苯酚-硫酸比色法測定其多糖含有量。目前,苯酚-硫酸法作為一種常用經(jīng)典的方法,具有靈敏度高,重現(xiàn)性好等優(yōu)點,被廣泛運用于多糖含量的測定,包括單糖、寡糖以及均一多糖的含量測定[14]。因此,可作為虎掌南星多糖含量測定的方法。由于多糖類化合物不具備發(fā)色基團,缺乏特征的紫外吸收,不能直接用紫外進行檢測。因此,本實驗采用PMP柱前衍生化操作使虎掌南星多糖樣品水解后的單糖帶上發(fā)色基團,增強紫外檢測信號,從而提高了其檢測靈敏度。該單糖測定方法具有準確可靠,靈敏度較高,取樣量少等優(yōu)點,并可有效分離各單糖,可以實現(xiàn)在普通實驗室中運用常見的紫外檢測器和C18柱來分離分析虎掌南星多糖的單糖組成,這種測定方法也可運用于其他多糖的單糖組成測定[15]。本研究主要對虎掌南星的基本性質(zhì)(多糖含量和單糖組成)進行了研究,以期為進一步尋找虎掌南星多糖中的活性成分及其構(gòu)-效關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

    參考文獻

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    Studies on the polysaccharide content and monosaccharide composition of Pinellia pedatisecta

    /MO Xue-lin, LIU Yu-jie,LI Tao, LI Jiang-hua, WU Chun-jie//(School of pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137,Sichuan)

    Objective:To study the polysaccharides content of Pinellia pedatisecta, and the monosaccharide composition and mole ratio.Method:Water extraction and alcohol precipitation method was used to extract polysaccharides from Pinellia pedatisecta,and the content of polysaccharides was detected by phenol sulfuric acid method. Then Pre column Derivatization - High performance liquid chromatography was used to investigate the monosaccharide composition and the linear regression equation was conducted to calculate the molar ratio.Result:The extraction rate of Pinellia pedatisecta polysaccharides was 4.65%, and the content of polysaccharides was 56.3%. The monosaccharides of the polysaccharides were composed of mannose, galacturonic acid, glucose,galactose and arabia sugar, and the monosaccharide ratio were 3.54∶3.36∶313.39∶9.01∶1.69.Conclusion:Phenol sulfuric acid method is stabile, simple and repeatable, and it can be used for the determination of polysaccharides content of Pinellia pedatisecta. Pre column Derivatization High Performance Liquid Chromatography is simple, accurate, rapid and reproducible, and it can be used for the analysis of the monosaccharide composition of Pinellia pedatisecta polysaccharides.

    Pinellia pedatisecta; polysaccharides; monosaccharide composition; phenol-sulfuric acid method; High performance liquid chromatography

    R282.6

    A

    1674-926X(2017)06-004-04

    成都中醫(yī)藥大學藥學院,四川 成都 611137

    莫雪林,女,碩士研究生在讀,從事中藥炮制與制劑方向。Tel∶13730876479 Email∶moxuelinde@126.com

    吳純潔,男,研究員,從事中藥炮制與制劑方向。Tel∶028-61801001 Email∶wcj-one@163.com

    2017-03-21

    (責任編輯:李蕓霞)

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