桑葉提取物的抑菌活性及其揮發(fā)性組分的氣相色譜 -質(zhì)譜分析

劉志明 王海英 張 爽

(1東北林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040;2東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

桑葉提取物的抑菌活性及其揮發(fā)性組分的氣相色譜 -質(zhì)譜分析

劉志明1王海英2張 爽2

(1東北林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院,生物質(zhì)材料科學(xué)與技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江哈爾濱 150040;2東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院,黑龍江哈爾濱 150040)

通過(guò)對(duì)桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn)和對(duì)桑葉正己烷提取物中揮發(fā)性組分進(jìn)行氣相色譜 -質(zhì)譜分析結(jié)果表明:桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用,桑葉正己烷提取物的抑菌圈直徑為7.11mm,桑葉二氯甲烷提取物的抑菌圈直徑為7.09mm,而桑葉正己烷提取物與桑葉二氯甲烷提取物對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑制作用。氣相色譜 -質(zhì)譜檢測(cè)分析桑葉正己烷提取物的主要揮發(fā)性組分及其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為十八烷(39.48%)、環(huán)二十八烷(8.79%)、棕櫚酸 (7.19%)、二十九烷 (6.61%)、鄰苯二甲酸二丁酯 (6.22%)、亞麻醇 (6.01%)、丁香酚(0.40%),其中的亞麻醇和丁香酚是具有抑菌潛力的化合物。

桑葉提取物;正己烷;二氯甲烷;抑菌活性;揮發(fā)性組分;氣相色譜-質(zhì)譜法

桑葉是?？?Moraceae)植物桑(Morus alba L.)的葉片,又名“鐵扇子”或“蠶葉”,是傳統(tǒng)中草藥之一［1-3］。桑葉中含有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、多糖類(lèi)、植物甾醇類(lèi)、揮發(fā)油類(lèi)、氨基酸、維生素等化合物,具有降血糖、降血脂、抗菌等功效［4-6］。李有貴等［7］研究了 59份野生桑桑葉中的 1-脫氧野尻霉素含量及粗提物對(duì) α-糖苷酶的抑制活性,多羥基生物堿 1-脫氧野尻霉素是桑葉提取物中具有降血糖作用的主要活性成分之一。仝義超［8］進(jìn)行了桑葉降血糖、降血脂研究及其產(chǎn)品開(kāi)發(fā)。郭小補(bǔ)等［9］進(jìn)行了不同桑品種的桑葉總黃酮含量與體外抗氧化活性的相關(guān)性研究。桑葉除了作為中草藥應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域,還可應(yīng)用于食品等領(lǐng)域［3,10-12］。楊清等［13］進(jìn)行了桑紅茶發(fā)酵工藝條件優(yōu)化及活性成分含量的動(dòng)力學(xué)研究,楊普香等［14］研究了桑葉含片的加工。桑葉高附加值產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)利用已成為桑葉產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)之一。研究表明鮮桑葉水浸出液［15］、干桑葉乙醇提浸膏［16］、新鮮桑葉汁［17］以及質(zhì)量濃度為 0.1 g/m L的干桑葉水提取物［18］對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有抑制作用。

桑葉提取物的抑菌活性因桑葉的生長(zhǎng)環(huán)境、桑葉活性物質(zhì)的提取方式不同而有差異。植物在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)次生代謝產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)具有防御害蟲(chóng)、抑菌等作用,從而保護(hù)自身不受病蟲(chóng)害侵害［19-23］,將植物中的揮發(fā)性有效成分提取出來(lái)進(jìn)行產(chǎn)品開(kāi)發(fā)是當(dāng)今回歸自然、環(huán)境友好產(chǎn)品開(kāi)發(fā)的研究重點(diǎn)之一。本研究對(duì)利用正己烷和二氯甲烷浸提桑葉獲得的提取物進(jìn)行抑菌活性比較,并采用氣相色譜 -質(zhì)譜(GC-MS)法分析提取物的揮發(fā)性組分,探討桑葉提取物的有效活性組分,為桑葉的高附加值產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桑葉:龍桑一號(hào)的 3年嫁接苗的新鮮葉片,2009年 8月下旬采摘于黑龍江省齊齊哈爾市甘南林場(chǎng)桑產(chǎn)業(yè)科技示范園。

供試菌株:金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大腸桿菌(Escherichia coli),均購(gòu)自黑龍江省科學(xué)院應(yīng)用微生物研究所。在無(wú)菌條件下用劃線(xiàn)法將供試菌株移接入斜面培養(yǎng)基上,在 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h。取出活化好的菌株,用適量無(wú)菌 9 g/L氯化鈉溶液,將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別配置成濃度為 9×106、5×106cfu/mL的菌懸液備用。

主要藥品與儀器:正己烷、二氯甲烷均為分析純,均購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心;超凈工作臺(tái),上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn);SPX-80B生化培養(yǎng)箱,DSX-180A手提式高壓蒸汽滅菌鍋,均為上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠生產(chǎn);GC-MS 6890N-5973 insert氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó) Agilent公司生產(chǎn)。培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g,氯化鈉 10 g,酵母提取物 5 g,瓊脂 20 g,去離子水 1 000 mL,用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié) pH 7.0～7.5。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的制備 各取 15 g鮮桑葉(整片)放入 2個(gè) 500mL索氏提取器中,分別加入 300mL正己烷、二氯甲烷,在恒溫水浴85℃下連續(xù)回流提取 24 h,提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器蒸去溶劑,得到桑葉正己烷或二氯甲烷提取物浸膏;分別將提取物浸膏用二氯甲烷溶解,配制成質(zhì)量濃度為 0.1 g/m L的溶液備用。

1.2.2 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的抑菌活性試驗(yàn) 采用濾紙片法［16］和平板菌落計(jì)數(shù)法［18］進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。將移液器、鑷子、培養(yǎng)基、9 g/L NaCl溶液、試管及三角瓶等用牛皮紙包好,濾紙用打孔器打成 6mm的紙片,裝于潔凈三角瓶中,置于高壓滅菌鍋內(nèi),121℃下濕熱滅菌 20min,備用。用移液器吸取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌懸液 0.05 m L于無(wú)菌平皿中,然后倒入已冷卻至 45℃的培養(yǎng)基15m L,充分混勻后水平放置,制成含菌平板。用鑷子將濾紙片放入桑葉正己烷提取物、桑葉二氯甲烷提取物溶液中,浸泡 10min后取出,待溶劑揮發(fā)后,將紙片貼在含菌平板上,每個(gè)平板貼 3片濾紙,每個(gè)紙片相隔一定間距,并用浸有二氯甲烷的濾紙片作對(duì)照,貼上標(biāo)簽。每個(gè)處理 3個(gè)重復(fù)。放入培養(yǎng)箱37℃下培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈直徑,取其平均值。以上操作均在超凈工作臺(tái)上完成。

1.2.3 桑葉正己烷提取物的氣相色譜 -質(zhì)譜分析(GC-MS) 用甲醇(色譜純)將桑葉正己烷提取物(經(jīng)旋轉(zhuǎn)薄膜蒸發(fā)器蒸去正己烷獲得的提取物)配制成質(zhì)量濃度為 0.04 g/m L的溶液,利用 GC-MS 6890N-5973insert氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用儀,對(duì)0.04 g/mL提取物甲醇溶液進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)用分析。氣相色譜分析條件:DB-17MS毛細(xì)管柱(30 m×0.25mm×0.25μm),FID檢測(cè)器;初始溫度 40℃,保持 4min后以20℃/m in升溫至150℃,接著再以5℃/m in升溫至 240℃,保持 5 min;進(jìn)樣口溫度260℃,進(jìn)樣量 1.0μL,不分流,載氣氦氣,流速1m L/min。質(zhì)譜條件:連接口溫度 280℃,離子源溫度 230℃,轟擊電壓 70 eV,掃描檢測(cè)范圍 15～260 u。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物的抑菌活性比較

從桑葉正己烷與二氯甲烷提取物對(duì)供試菌種的抑制效果看(表 1),桑葉正己烷與桑葉二氯甲烷提取物均對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制作用,抑菌圈直徑分別為 7.11、7.09mm;從表 1中還可看出桑葉正己烷提取物與桑葉二氯甲烷提取物對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑制作用。

表 1 桑葉正己烷與二氯甲烷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制效果

2.2 桑葉正己烷提取物的氣相色譜 -質(zhì)譜分析

由于抑菌試驗(yàn)中常需要檢測(cè)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌效果,且正己烷是常用的提取植物天然產(chǎn)物較好的溶劑之一,加上桑葉正己烷提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑較大;因此,下面只對(duì)桑葉正己烷提取物進(jìn)行氣相色譜 -質(zhì)譜分析。

經(jīng)計(jì)算機(jī) NIST質(zhì)譜庫(kù)自動(dòng)檢索、解析和部分化合物的人工解析,鑒定出桑葉正己烷提取物中有 13種揮發(fā)性成分,通過(guò)面積歸一化法計(jì)算各組分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(表 2)。從表 2可以看出,桑葉正己烷提取物中主要揮發(fā)性組分為十八烷(39.48%)、環(huán)二十八烷 (8.79%)、棕櫚 酸 (7.19%)、二十九 烷(6.61%)、鄰苯二甲酸二丁酯(6.22%)、亞麻醇(6.01%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(4.38%);此外,桑葉正己烷提取物中還含有丁香酚、植醇、亞麻酸甲酯等揮發(fā)性組分。

表 2 桑葉正己烷提取物揮發(fā)性組分的氣相色譜-質(zhì)譜分析

3 小結(jié)與討論

桑葉的傳統(tǒng)應(yīng)用主要是作為藥用(中草藥)和飼用(養(yǎng)蠶飼料),將桑葉中的有效成分提取出來(lái),應(yīng)用于食品等產(chǎn)品開(kāi)發(fā),是提高桑葉經(jīng)濟(jì)附加值的手段之一。用植物天然產(chǎn)物的常用提取劑正己烷和二氯甲烷分別浸提桑葉,獲得的桑葉提取物進(jìn)行抑菌活性試驗(yàn),結(jié)果表明:桑葉正己烷的提取物與桑葉二氯甲烷的提取物,對(duì)金黃色葡萄球菌均有抑制作用,但對(duì)大腸桿菌均無(wú)抑制作用。對(duì)桑葉正己烷提取物進(jìn)行氣相色譜 -質(zhì)譜分析的結(jié)果表明,其提取物中含有亞麻醇、丁香酚等具有抑菌作用的揮發(fā)性組分。有研究表明,亞麻醇可以作為抗菌劑預(yù)防齲齒和牙周病［24］,丁香酚也具有抑菌作用［25］。關(guān)于桑葉正己烷提取物的抑菌活性物質(zhì)的分離、鑒定及其抑菌機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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S888.2

A

1007-0982(2011)02-0026-03

2010-12-20;

2011-01-19

黑龍江省林業(yè)廳科技推廣項(xiàng)目(編號(hào) 01043208003)。

劉志明(1971—),男,黑龍江,博士,副教授。

Tel:0451-82191740,E-mail:zhimingliuwhy@126.com