茶多酚-肉桂精油復合保鮮劑抗氧化活性及抑菌作用

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(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

茶多酚-肉桂精油復合保鮮劑抗氧化活性及抑菌作用

余小亮,陳舜勝*,贠三月,劉富康,宋玲玲

(上海海洋大學食品學院,上海 201306)

為了研究茶多酚-肉桂精油復合保鮮劑抗氧化活性和對金黃色葡萄球菌的抑菌作用。采用體外抗氧化法測定了復合保鮮劑抗氧化能力。通過抑菌圈大小確定抑菌效果和最小抑菌濃度(MIC),結(jié)合抑菌活力、細菌生長曲線、細胞壁完整性和細胞膜通透性,綜合評價復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的影響。結(jié)果表明,復合保鮮劑清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基的IC50分別為4.02 μg/mL、9.15 μg/mL、0.61 mg/mL。復合保鮮劑能夠有效抑制金黃色葡萄球菌的生長,MIC為0.5 mg/mL,且能夠破壞細胞壁和細胞膜。綜上所述復合保鮮劑具有很強的抗氧化活性,對金黃色葡萄球菌有很好的抑菌效果,其可能的抑菌機理是破壞細胞壁,影響細胞膜的通透性。

茶多酚,肉桂精油,復合保鮮劑,金黃色葡萄球菌,抗氧化,抑菌

茶多酚是一種抗氧化活性很強的物質(zhì),其羥基上的活潑氫離子可以結(jié)合自由基,與金屬離子螯合,抑制脂質(zhì)過氧化,增強抗氧化酶活性[1]。目前茶多酚的抑菌機理并未十分明確,其可能的抑菌機理有以下幾點:破壞細菌的細胞壁和細胞膜;作用于DNA或RNA;作用于細胞內(nèi)酶類或功能性蛋白質(zhì)[2-4]。肉桂精油由于其抗氧化組分能夠釋放出自身的氫,與外界自由基形成穩(wěn)定化合物而具有很強的抗氧化活性[5-6]。肉桂精油對李斯特菌、沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌等有明顯的抑菌活性,但是其抑菌機理并沒有被明確闡述[7-8]。

金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是導致細菌性食物中毒的主要病原菌之一[9],隸屬于葡萄球菌屬(Staphylococcus),是典型的革蘭氏陽性菌。其廣泛存在于自然界中,因此,食品受到金黃色葡萄球菌的污染幾率特別大,金黃色葡萄球菌為侵襲性細菌,能產(chǎn)生毒素,對腸道破壞性極大。同時金黃色葡萄球菌也是很多水產(chǎn)品優(yōu)勢腐敗菌的一種[10],影響水產(chǎn)品的貨架期,因此如何抑制其生長繁殖產(chǎn)生毒素是一個重要的課題。

茶多酚具有很強的抗氧化活性,而其抑菌性稍差,肉桂精油抑菌性強,但抗氧化性較差,目前單一保鮮劑在使用過程中不能達到理想的效果,因此將兩者保鮮劑進行復配。在預實驗基礎上,本研究測定了不同濃度茶多酚-肉桂精油復合保鮮劑(1∶1配比)的抗氧化活性和抑菌效果并且綜合闡釋了復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌作用機理。本研究為接下來更進一步開發(fā)水產(chǎn)品新型保鮮劑，為提高水產(chǎn)品質(zhì)量安全提供理論基礎和科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

金黃色葡萄球菌 由本課題組成員前期篩選等到;茶多酚、肉桂精油、乙醇、DPPH、結(jié)晶紫、鄰苯三酚、維生素C、過氧化氫、氯化鈉等 均為分析純,高信化玻儀器有限公司;胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)、平板計數(shù)瓊脂 生工生物工程有限公司;堿性磷酸酶(AKP)試劑盒 南京建成科技有限公司。

SG3電導率儀 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;UV-3000 PC型紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;stat fax-3200酶標儀 美國Awareness公司;Z36HK大容量高速冷凍離心機 德國哈默公司。

1.2復合保鮮劑的配制

結(jié)合預實驗結(jié)果,從抗氧化結(jié)果上來看,茶多酚較肉桂精油效果好,但是二者相差并不是特別大,而肉桂精油抑菌能力比茶多酚強(預實驗做過抑菌圈實驗證實),綜合考慮選用茶多酚與肉桂精油按1∶1配比得到茶多酚-肉桂精油復合保鮮劑。

1.3抗氧化能力測定

1.3.1 復合保鮮劑對DPPH自由基清除能力測定 DPPH自由基清除能力測定參照朱培蕾[11]的方法。用無水乙醇配制濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的復合保鮮劑五份,精確吸取不同濃度復合保鮮劑4 mL于試管中,再加4 mL、0.1 mmol/L的DPPH溶液,搖勻后在暗處反應30 min,分別測定517 nm處的吸光值Ai;以4 mL無水乙醇代替DPPH溶液再加入上述溶液4 mL,測吸光值Aj。以4 mL無水乙醇替代復合保鮮劑,再加入4 mL DPPH溶液作為空白組,測吸光值A0，清除率公式如下所示。單獨使用1、2、3、4、5 μg/mL的茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做對照,每組均重復測三次。

1.3.2 復合保鮮劑對羥基自由基清除能力測定 采用結(jié)晶紫法[12]測定保鮮劑對羥基自由基清除效果。具體操作:取若干試管,各加入1.5 mL 0.4 mmol/L結(jié)晶紫溶液,再加入2.0 mL 1.0 mmol/L FeSO4、1.0 mL不同濃度復合保鮮劑(2、4、6、8、10 μg/mL)、2.0 mmol/L H2O2溶液,調(diào)節(jié)pH為4.0,定容至50 mL后搖勻,30 min后測580 nm處的吸光值Ai,以等量蒸餾水替代H2O2溶液和復合保鮮劑,測得吸光度值為A,以等量蒸餾水替代復合保鮮劑作對照,測得吸光值為A0,清除率公式如下所示，單獨使用1、2、3、4、5 μg/mL的茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做對照。

1.3.3 復合保鮮劑對超氧陰離子自由基清除能力測定 用鄰苯三酚自氧化法[13]測定超氧陰離子自由基清除效果。每支試管中加入3 mL pH為8.2的Tris-HCl緩沖液,0.1 mL復合保鮮劑(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL),在(25±0.5) ℃下水浴平衡20 min,再加入7 mmol/L的鄰苯三酚溶液,反應4 min后加入1 mL 10 mol/L的HCl使反應停止,在420 nm處測吸光值，清除率公式如下所示。用茶多酚、肉桂精油二者清除率相加做對照。

式中,A0-空白組即不加樣品的吸光值;AX-加入樣品后的吸光值。

1.4復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌抑菌作用研究

1.4.1 菌種活化及菌懸液的制備 將低溫保藏的金黃色葡萄球菌接種在TSA固體培養(yǎng)基上,在37 ℃下培養(yǎng)36 h后挑取5個單菌落接種在TSB液體培養(yǎng)基中,37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)17 h,以5000 r/min離心6 min,菌體沉淀用已滅菌的TSB稀釋,對照麥氏比濁管,使菌液濃度稀釋至106CFU/mL作為菌懸液待用。

1.4.2 抑菌效果及最小抑菌濃度(MIC)研究 按照二倍稀釋法將復合保鮮劑配成濃度為10、8、6、4、2、1、0.5、0.25 mg/mL。使用瓊脂平板打孔法[14],對不同濃度的復合保鮮劑進行抑菌圈測定,從而確定MIC。

1.4.3 抑菌活力的測定 將復合保鮮劑分別加入到10 mL的試管中,加入菌懸液,使保鮮劑濃度為MIC與1/2 MIC,37 ℃、150 r/min搖床進行培養(yǎng),用不含菌的液體培養(yǎng)基作為空白對照組。培養(yǎng)不同時間(1、2、3、4、5、6、7 h),用自動酶標儀測定620 nm處的吸光值(A),按照Haanen Haanen M[15]等的方法計算抑菌活力(U)，公式如下所示。將培養(yǎng)時間作為橫坐標,抑菌活力作為縱坐標作出曲線,得到抑菌活性峰出現(xiàn)的時間和數(shù)量。

式中,A0-空白對照組吸光值;A-樣品組不同處理時間吸光值。

1.4.4 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響 取10 mg/mL的復合保鮮劑0.5 mL和0.25 mL分別加到9.5 mL和9.75 mL已制備菌懸液中,使保鮮劑濃度為MIC與1/2 MIC,37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng),用不含有保鮮劑的無菌水作為對照組,每隔2 h分別取樣,利用紫外分光光度計測定菌液在620 nm處的吸光值[16]。將培養(yǎng)時間作為橫坐標,OD620作為縱坐標,繪制出金黃色葡萄球菌的生長曲線。

1.4.5 復合保鮮劑對菌體細胞壁的影響 取10 mg/mL的復合保鮮劑0.5 mL和0.25 mL分別加到9.5 mL和9.75 mL已制備菌懸液中,使保鮮劑濃度為MIC與1/2 MIC,37 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng),用不含有保鮮劑的無菌水作為對照組,每隔2 h分別取樣,3000 r/min離心10 min,取上清液,使用試劑盒分別測定不同時間培養(yǎng)液中堿性磷酸酶(AKP)酶含量[17]。

1.4.6 復合保鮮劑對菌體細胞膜通透性的影響 取10 mg/mL的復合保鮮劑0.5 mL和0.25 mL分別加到9.5 mL和9.75 mL已制備菌懸液中,使保鮮劑濃度為MIC與1/2 MIC,37 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng),用不含有保鮮劑的無菌水作為對照組,每隔2 h分別取樣,參照Lee[18]等的方法測定不同時間培養(yǎng)液的電導率值。

1.5數(shù)據(jù)處理

實驗重復兩次,每組數(shù)據(jù)平行測三次。數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0進行方差分析。采用Origin 8.5進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1抗氧化效果

2.1.1 復合保鮮劑對DPPH自由基清除效果 結(jié)果如圖1所示,可以看出,復合保鮮劑對DPPH自由基有很好的清除作用,且清除能力大于單獨使用茶多酚溶液、肉桂精油溶液二者清除率之和。當復合保鮮劑濃度為2 μg/mL時,清除率僅有17.16%,隨著濃度升高到6 μg/mL,清除率迅速升高到66.23%,IC50為4.02 μg/mL,但超過6 μg/mL時,清除率升高相對緩慢,趨于平緩。李榮等[19]發(fā)現(xiàn)肉桂精油在2 mg/mL時對DPPH自由基清除率為31%,說明肉桂精油對DPPH自由基清楚能力較茶多酚相差很多,可見將肉桂精油與茶多酚復配清除能力較好。馬君義[20]在螺旋藻中添加10%茶多酚,研究發(fā)現(xiàn)比單獨使用時表現(xiàn)出較強的協(xié)同清除DPPH自由基能力。這種協(xié)同作用的機理是通過基于氧化還原電位差的偶聯(lián)氧化,偶聯(lián)作用[21]。復配液降低了兩種物質(zhì)之前的電位落差。

圖1 復合保鮮劑對DPPH自由基的清除效果

2.1.2 復合保鮮劑對羥基自由基清除效果 結(jié)果如圖2所示,可以看出不同濃度的復合保鮮劑對羥基自由基均有一定的清除能力,且隨著濃度的增加清除率逐漸提高,保鮮劑復合能夠提高清除羥基自由基的能力。當復合保鮮劑濃度為2 μg/mL時,清除率為9.12%;隨著濃度升高到4 μg/mL,清除率快速增加到30.15%;當濃度達到10 μg/mL時清除率達到53.42%,IC50為9.15 μg/mL。林美容等[22]將茶多酚與竹蓀提取物復配,發(fā)現(xiàn)對羥基自由基的清除能力高于單獨使用茶多酚或竹蓀時的效果。復配液表現(xiàn)出來的這種協(xié)同效應可能是由于單一抗氧化劑在發(fā)揮作用之后產(chǎn)生的游離基直接相互作用產(chǎn)生新的酚類物質(zhì)繼續(xù)發(fā)揮作用,從而增強了對羥基自由基的清除效果[23]。

圖2 復合保鮮劑對羥基自由基的清除效果

2.1.3 復合保鮮劑對超氧陰離子自由基清除效果 結(jié)果如圖3所示,可以看出復合保鮮劑對超氧陰離子自由基清除率隨濃度增大逐漸增大。其對超氧陰離子自由基IC50為0.61 mg/mL。孫世利等[24]研究表明茶多酚復合維生素C和維生素E對超氧陰離子自由基清除率清除效果,比使用單一抗氧化劑清除率好,這與本實驗的結(jié)果類似,本實驗中復合保鮮劑對超氧陰離子自由基的清除效果強于單獨使用茶多酚、肉桂精油,可見復合保鮮劑對超氧陰離子自由基的清除具有協(xié)同效應,但是機理尚不明確。

圖3 復合保鮮劑對超氧陰離子自由基的清除效果

2.2復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.2.1 抑菌效果及最小抑菌濃度(MIC) 可以通過抑菌圈直徑的大小劃分相對敏感度從而判斷抑菌效果,評價標準見表1[25]。復合保鮮劑的抑菌效果見表2。從表2可以看出,濃度越高抑菌效果越好,當濃度大于0.5 mg/mL時,復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌都具有較好的抑菌效果,結(jié)合表1,當抑菌圈直徑為7.8～10.0 mm之間時,復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌具有低敏效果,由此可確定復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為0.5 mg/mL。

表1 抑菌效果評價標準

表2 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌效果

2.2.2 抑菌活力 抑菌活力主要通過抑菌動力學方法表征復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑制效果。實驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌的抑菌活力

由圖4可知,隨著作用時間的延長,抑菌活性初始階段在不斷增強,MIC和1/2 MIC濃度處理組的金黃色葡萄球菌均在4 h時出現(xiàn)一個活性峰,隨后由于金黃色葡萄球菌繁殖加速,抑菌活性開始出現(xiàn)不斷下降趨勢。MIC濃度抑菌活性始終遠遠大于1/2 MIC處理組,可見復合保鮮劑濃度越大抑菌作用越強。藍蔚青等[25]研究了殼寡糖、溶菌酶與茶多酚復配對松鼠葡萄球菌的抑菌活力,本文的研究結(jié)果與其基本一致。

2.2.3 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響 細菌培養(yǎng)液的吸光值可用來指示細菌的生長情況,一般情況下在液體培養(yǎng)基中,細菌生長呈現(xiàn)S型曲線規(guī)律。經(jīng)MIC與1/2 MIC濃度的復合保鮮劑處理后,金黃色葡萄球菌的生長曲線如圖5。

圖5 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌生長曲線的影響

由圖5可知,實驗組和對照組均呈S型生長,對照組在培養(yǎng)8 h后進入對數(shù)期,經(jīng)MIC和1/2MIC濃度復合保鮮劑處理后,相比于對照組,處理后細菌生長明顯遲滯,經(jīng)MIC濃度保鮮劑處理的細菌生長最慢。復合保鮮劑處理后的金黃色葡萄球菌生長始終處于較低水平狀態(tài),可見其抑菌效果明顯。此外,復合保鮮劑處理后,曲線最大斜率變小,因此細菌的最大生長速率減小,這與石超等[26]研究的結(jié)果一致,復合保鮮劑抑制金黃色葡萄球菌的生長方式是延緩其進入對數(shù)期的時間以及抑制其最大生長速率。

2.2.4 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞壁的影響 堿性磷酸酶(AKP)是一種存在于細胞膜與細胞壁之間的對生物體起重要作用的酶。當細胞處于正常生理狀況下時,AKP由于被細胞壁隔離而不能在細胞外檢測出,但當細胞壁受到破壞以后,AKP會大量滲透到細胞外。因此,經(jīng)復合保鮮劑處理金黃色葡萄球菌后通過測定細胞外AKP含量的變化情況能夠間接反映保鮮劑對細胞壁的影響。復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞壁的影響如圖6所示。

圖6 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞壁的影響

由圖6可知,對照組AKP含量較穩(wěn)定并且始終在一個較低的水平,在細胞外的含量很低。但經(jīng)過MIC和1/2 MIC濃度復合保鮮劑處理后,在初始2 h內(nèi),AKP含量迅速升高,3 h后基本趨于穩(wěn)定,并且復合保鮮劑濃度越高,AKP含量越高。這表明復合保鮮劑能夠在短時間內(nèi)破壞金黃色葡萄球菌細胞壁的完整性,且隨著濃度的升高,破壞程度增大。

2.2.5 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響 細菌的細胞膜是保護細菌的屏障,同時也具有很多獨特的生理功能,當細胞膜被破壞后,其原有的功能也將喪失,導致細胞膜的流動性和通透性增大,從而失去對菌體的保護作用,細胞內(nèi)的細胞液將大量外流,細胞液中包含大量的電解質(zhì)離子,將導致培養(yǎng)液中電導率上升,因此,測定培養(yǎng)液電導率的變化可以間接反映細菌細胞膜通透性的變化。復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響如圖7所示。

圖7 復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌細胞膜通透性的影響

由圖7可知,對照組菌液電導率呈穩(wěn)定緩慢上升趨勢,可能是因為隨著細菌不斷繁殖,培養(yǎng)液中菌體濃度不斷增大。經(jīng)過MIC和1/2 MIC濃度復合保鮮劑處理后,培養(yǎng)液電導率值在60 min內(nèi)快速上升,且電導率值明顯高于對照組,并且MIC濃度處理電導率值遠高于1/2 MIC濃度處理。說明復合保鮮劑能夠破壞金黃色葡萄球菌細胞膜,致使菌體內(nèi)電解質(zhì)外滲嚴重,從而起到抑菌作用,且濃度越大抑菌作用越強。

3 結(jié)論

通過測定復合保鮮劑對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基清除率,發(fā)現(xiàn)復合保鮮劑抗氧化活性隨濃度增大而增強,且有效活性濃度較低,具有很強的抗氧化性。復合保鮮劑對金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用,抑菌效果隨濃度增大不斷增強,最小抑菌濃度為0.5 mg/mL,且均在4 h時發(fā)揮最大抑菌活力。MIC和1/2 MIC濃度處理能夠延緩金黃色葡萄球菌生長對數(shù)期,減小最大生長速率,破壞金黃色葡萄球菌細胞壁,并且對細胞膜通透性產(chǎn)生影響。

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Antioxidantactivityandantimicrobialeffectofteapolyphenols-cinnamonessentialoilcompoundpreservatives

YUXiao-liang,CHENShun-sheng*,YUNSan-yue,LIUFu-kang,SONGLing-ling

(College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,China)

To determine the antioxidant activity and antimicrobial effect againstStaphylococcusaureusof tea polyphenols-cinnamon essential oil compound preservatives. The antioxidant capacity of compound preservatives was determined byinvitrooxidation resistance method. The bacteriostatic effect and the minimum inhibitory concentration(MIC)were determined by the size of the inhibition zone. The effect of compound preservatives onStaphylococcusaureuswas evaluated comprehensively by antibacterial activity,bacterial growth curve,cell wall integrity and cell membrane permeability. Results showed that IC50of compound preservatives scavenged DPPH radical,hydroxyl radical and superoxide anion radical were 4.02 μg/mL,9.15 μg/mL and 0.61 mg/mL respectively. Compound preservatives could effectively inhibit the growth ofStaphylococcusaureuswith the MIC of 0.5 mg/mL,and could damage the cell wall and cell membrane. In summary,compound preservatives had a strong antioxidant activity,and had a very good antibacterial effect withStaphylococcusaureus. The possible mechanism of inhibition was to destroy the cell wall and affect the permeability of the cell membrane.

tea polyphenols;cinnamon essential oil;compound preservatives;Staphylococcusaureus;antioxidant;antimicrobial

2017-04-25

余小亮(1992-),男,碩士研究生,研究方向:水產(chǎn)品加工與保藏,E-mail:1280218199@qq.com。

*

陳舜勝(1956-),男,碩士,教授,主要從事水產(chǎn)品加工與貯藏方面的研究,E-mail:sschen@shou.edu.cn。

國家自然科學基金面上項目(31471685);“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD28B05);上海市2015高校內(nèi)涵建設項目(A2018150009)。

TS202.3

A

1002-0306(2017)22-0226-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.044