澳洲堅果青皮多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

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(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點實驗室,廣東湛江 524091)

澳洲堅果青皮多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性

張明,帥希祥,杜麗清*,涂行浩

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所,農(nóng)業(yè)部熱帶果樹生物學(xué)重點實驗室,廣東湛江 524091)

以新鮮澳洲堅果青皮為原料,研究了澳洲堅果青皮多酚的提取工藝及抗氧化活性。在單因素實驗的基礎(chǔ)上,通過4因素3水平的正交實驗優(yōu)化澳洲堅果青皮多酚提取工藝,并以Trolox為對照,研究其對DPPH自由基和ABTS+自由基的清除能力以及總抗氧化能力。正交實驗結(jié)果表明:提取時間為90 min、料液比為1∶50 (g/mL)、提取溫度為50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%為最佳提取工藝條件,在此條件下澳洲堅果青皮多酚提取量達(dá)到(1027.47±10.76) mg/100 g?？寡趸瘜嶒灲Y(jié)果表明:澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基和ABTS+自由基的半數(shù)清除率IC50分別為4.13、112.94 mg/L,且其總抗氧化能力約為Trolox的1.7倍。由此可知,澳洲堅果青皮多酚具有很強(qiáng)的抗氧化能力,可用于制備天然抗氧化劑。

澳洲堅果青皮,多酚,提取,抗氧化

澳洲堅果(Macadamiaintegrifolia)又稱澳洲核桃、夏威夷果等,山龍眼科澳洲堅果屬[1]。20世紀(jì)60～70年代開始引入我國,在我國南部山區(qū),如云南、廣西、廣東和貴州等地均有種植[2]。目前,澳洲堅果在我國種植面積約為6萬公頃,產(chǎn)量約為9千噸[3]。澳洲堅果果實由青皮、果殼和果仁組成,果仁為可食部分,占鮮果重量1/2的青皮和占?xì)す亓?/3的果殼為澳洲堅果加工的副產(chǎn)物。當(dāng)前國內(nèi)外對果殼組成成分[4-5]和制備活性炭[6]、磁性納米吸附劑[7]和碳(氮)化納米顆粒[8]等吸附材料報道較多,對青皮的研究僅限于青皮組成成分[9]和抑菌[10]、抗氧化[11]等功能性質(zhì)[10-11]方面的研究,但對澳洲堅果青皮多酚的提取工藝優(yōu)化及體外抗氧化活性的系統(tǒng)研究卻鮮見報道。因此,本實驗將研究提取時間、料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及提取溫度四個因素對澳洲堅果青皮多酚提取的影響并進(jìn)行工藝優(yōu)化,同時,以水溶性維生素E(Trolox)為陽性對照,研究澳洲堅果青皮多酚對2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)自由基的清除能力和總抗氧化還原能力,進(jìn)而評價其體外抗氧化活性,以期為澳洲堅果青皮多酚的開發(fā)、應(yīng)用提供參考以及實現(xiàn)澳洲堅果加工副產(chǎn)物的高值化利用。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

澳洲堅果青皮:南亞1號 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所提供;福林酚、沒食子酸(>99%)、水溶性維生素E(Trolox)、Fe3+-三吡啶三吖嗪(TPTZ)、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH) Sigma公司;無水乙醇、鹽酸、醋酸 天津富宇精細(xì)化工有限公司;碳酸鈉 廣州化學(xué)試劑廠;六水氯化鐵 廣東光華科技股份有限公司。

分析天平 奧康斯儀器有限公司;ST40高速冷凍離心機(jī) 賽默飛世爾科技(中國)有限公司;FZ-06六兩裝高速藥材調(diào)料粉碎機(jī) 浙江溫嶺市百樂粉碎設(shè)備廠產(chǎn);UV2007型紫外-可見分光光度計 島津企業(yè)管理(中國)有限公司;BCD-539WT冰箱 青島海爾股份有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州杜甫儀器廠。

1.2實驗方法

1.2.1 澳洲堅果青皮多酚提取 澳洲堅果青皮多酚提取流程為:澳洲堅果青皮→粉碎→過篩→提取→離心→提取液備用。

新鮮澳洲堅果青皮經(jīng)粉碎、過40目篩保存于-20 ℃冰箱;稱取一定量澳洲堅果青皮,按實驗設(shè)計的提取溫度、提取時間、料液比和乙醇體積分?jǐn)?shù)進(jìn)行提取;提取結(jié)束后,在8000 r/min條件下離心15 min,上清液保存于4 ℃冰箱待測。

1.2.2 單因素實驗設(shè)計

1.2.2.1 提取時間對澳洲堅果青皮多酚提取的影響 在料液比為1∶30 (g/mL),提取次數(shù)為1次,磁力攪拌速率為150 r/min,提取溫度為40 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下,考察提取時間(15、30、60、90、120 min)對澳洲堅果青皮多酚提取的影響。

1.2.2.2 料液比對澳洲堅果青皮多酚提取的影響 在提取時間為90 min,提取次數(shù)為1次,磁力攪拌速率為150 r/min,提取溫度為40 ℃,乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%的條件下,考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對澳洲堅果青皮多酚提取的影響。

1.2.2.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對澳洲堅果青皮多酚提取的影響 在料液比為1∶40 (g/mL),提取次數(shù)為1次,磁力攪拌速率為150 r/min,提取溫度為40 ℃,提取時間為90 min的條件下,考察乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)對澳洲堅果青皮多酚提取的影響。

1.2.2.4 提取溫度對澳洲堅果青皮多酚提取的影響 在料液比為1∶40 (g/mL),提取次數(shù)為1次,磁力攪拌速率為150 r/min,提取時間90 min,乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%的條件下,考察提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)對澳洲堅果青皮多酚提取的影響。

1.2.3 澳洲堅果青皮多酚提取正交實驗 在1.2.2澳洲堅果青皮多酚提取單因素實驗基礎(chǔ)上,采用四因素三水平L9(34)正交實驗對澳洲堅果青皮多酚提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,正交實驗因素水平表見表1。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.4 澳洲堅果青皮多酚提取量測定

1.2.4.1 多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 多酚含量測定采用Pantelidis等[12]修改后的方法。準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，用無水乙醇配制100 mg/L的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后分別移取0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.0 mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,加入4 mL去離子水,再加入2 mL 10%福林酚試劑和2 mL 10% Na2CO3溶液,最后用去離子水定容,搖勻后避光反應(yīng)45 min,以不加沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比液,在760 nm處測吸光值。以吸光度為縱坐標(biāo),以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0923x+0.01(R2=0.9969)。

1.2.4.2 澳洲堅果青皮多酚提取量測定 澳洲堅果青皮提取液離心后,取0.2 mL上清液于10 mL容量瓶中,按上述多酚標(biāo)準(zhǔn)曲線制作過程加入各試劑,避光反應(yīng)45 min后于760 nm處測吸光值,平行測3次。澳洲堅果青皮多酚提取量計算公式如下所示。

其中:X:經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的提取液中多酚濃度,mg/L;V:提取液體積,mL;M:澳洲堅果青皮質(zhì)量,g。

1.2.5 澳洲堅果青皮多酚體外抗氧化活性研究

1.2.5.1 澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基清除能力的研究 采用修改后的Muhammad等[13]的方法。用100%無水乙醇配制濃度為2.0×10-4mol/L的DPPH溶液,避光保存?zhèn)溆?。? mL DPPH溶液和2.0 mL 40%乙醇溶液于具塞試管中,充分混合30 min,以40%乙醇溶液作參比液,于517 nm測吸光度A0;分別取多酚濃度為2.01、2.52、3.36、4.04、5.04、6.73、10.09 mg/L的澳洲堅果青皮多酚提取液、Trolox溶液2.0 mL和DPPH溶液2 mL于具塞試管中,在上述條件下測吸光度A1,并以相同濃度的Trolox溶液為陽性對照,平行測定3次。DPPH自由基清除率(P)計算公式為:

1.2.5.2 澳洲堅果青皮多酚對ABTS+自由基清除能力的研究 采用修改后的Roberta Re等[14]的方法。分別用蒸餾水配制7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L K2S2O8溶液,兩種溶液1∶1混合避光反應(yīng)12～16 h即為ABTS+溶液,用40%乙醇溶液稀釋ABTS+溶液至732 nm處吸光值為0.70±0.02,備用;分別取多酚濃度為20.19、40.37、78.49、100.93、150.46、201.86 mg/L的澳洲堅果青皮多酚提取液、Trolox溶液50 μL和4 mL ABTS+溶液于具塞試管中,37 ℃水浴10 min,以40%乙醇溶液為參比液,于732 nm處測吸光值A(chǔ)1,平行測定3次;取50 μL 40%乙醇溶液和4 mL ABTS+溶液于具塞試管中,在上述條件下測吸光值A(chǔ)0,并以相同濃度的Trolox溶液為陽性對照,平行測定3次。ABTS+自由基清除率(P)計算公式如下所示。

1.2.5.3 澳洲堅果青皮多酚總抗氧化能力的研究 采用修改后的Benzie等[15]的方法。分別配制10 mmol/L TPTZ溶液、20 mmol/L六水氯化鐵溶液和pH3.6的0.3 mmol/L醋酸緩沖液,然后將三種溶液按1∶1∶10的比例配置FRAP溶液,取20 μL澳洲堅果青皮多酚提取液、1 mL水和1.8 mL FRAP溶液,37 ℃水浴中反應(yīng)10 min,以40%乙醇溶液為參比液,于593 nm處測定吸光值,平行測定3次。以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總抗氧化能力。

1.3數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1澳洲堅果青皮多酚提取單因素實驗結(jié)果

2.1.1 提取時間對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響 從圖1可知,澳洲堅果青皮多酚提取量隨提取時間的延長呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢:當(dāng)提取時間為15～90 min時,澳洲堅果青皮多酚提取量隨提取時間的延長而增加;提取時間為90 min之后,澳洲堅果青皮多酚提取量隨提取時間延長而減少。提取時間為90 min時澳洲堅果青皮多酚提取量最高,為600.82 mg/100 g。提取時間對澳洲堅果青皮多酚提取具有雙重作用:一是澳洲堅果青皮中多酚隨提取時間延長逐漸向提取溶劑中擴(kuò)散并達(dá)到溶解平衡,因此提取量不斷增加;二是澳洲堅果青皮多酚隨提取時間延長,多酚氧化速率大于其向溶劑擴(kuò)散速率,從而造成提取量下降[16]。同時,由于提取時間的延長,會造成能源的過度消耗,因此,綜合考慮,提取時間宜選為90 min。

圖1 提取時間對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響

2.1.2 料液比對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響 從圖2可知,當(dāng)料液比從1∶10 (g/mL)增加到1∶40 (g/mL)時,澳洲堅果青皮多酚提取量隨料液比的增加而升高;當(dāng)料液比高于1∶40 (g/mL)時,澳洲堅果青皮中多酚含量隨料液比的增加而降低。當(dāng)料液比為1∶40 (g/mL)時,澳洲堅果青皮中多酚含量最高,達(dá)到642.31 mg/100 g。料液比增加有利于澳洲堅果青皮多酚與溶劑充分接觸并向溶劑中擴(kuò)散,但當(dāng)料液比達(dá)到某一臨界值時,再增加料液比反而會抑制多酚向溶劑中擴(kuò)散[17],且會造成溶劑的浪費與環(huán)境污染,因此,料液比宜選為1∶40 (g/mL)。

圖2 料液比對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響 酚類化合物的提取和分離取決于溶劑和酚類物質(zhì)的極性[18]。從圖3可知,乙醇體積分?jǐn)?shù)從30%增加到40%時,澳洲堅果青皮多酚提取量從919.02 mg/100 g增加到989.90 mg/100 g,這可能是澳洲堅果青皮多酚在提取溶劑中的溶解度隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而增加所致;乙醇體積分?jǐn)?shù)高于40%時,澳洲堅果青皮多酚提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)增加而降低。澳洲堅果青皮多酚提取量在乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%時最高,為989.90 mg/100 g。Spigno等[19]的研究也表明乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時葡萄籽中多酚提取量最高,本實驗研究結(jié)果與其趨勢一致。同時,增加乙醇體積分?jǐn)?shù),會增加乙醇使用量,因此,乙醇體積分?jǐn)?shù)宜選為40%。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響

2.1.4 提取溫度對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響 從圖4可知,澳洲堅果青皮多酚提取量隨提取溫度的升高而增加,當(dāng)提取溫度從20 ℃升高到40 ℃時,澳洲堅果青皮多酚提取量隨提取溫度的增加顯著升高,當(dāng)提取溫度從40 ℃升高到60 ℃時,澳洲堅果青皮多酚提取量從972.28 mg/100 g增加到998.90 mg/100 g,增加了26.62 mg/100 g,澳洲堅果青皮多酚提取量增加減緩。這可能是在溫度較高時,澳洲堅果青皮中的多糖、水溶性蛋白和色素等非多酚類物質(zhì)在提取溶劑中的溶解度增加,并與多酚類物質(zhì)競爭與乙醇-水的結(jié)合,從而抑制了多酚向提取溶劑中的擴(kuò)散;而且溫度較高會導(dǎo)致多酚類物質(zhì)的氧化[20];同時溫度越高,能耗越大,綜合考慮,提取溫度宜選為40 ℃。

圖4 提取溫度對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響

表2 正交實驗結(jié)果

2.2澳洲堅果青皮多酚提取正交優(yōu)化實驗結(jié)果

由表2和表3極差和方差分析可知,各因素對澳洲堅果青皮多酚提取量的影響順序依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、料液比(B)、提取時間(A)和提取溫度(D)，A、B、C為極顯著,D為不顯著。最佳工藝條件為:A2B3C2D3,即提取時間為90 min、料液比為1∶50 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%、提取溫度為50 ℃。此最佳工藝組合不在已知的9組正交實驗中,需進(jìn)行驗證實驗。在最佳工藝組合條件下對澳洲堅果青皮中多酚進(jìn)行提取,澳洲堅果青皮多酚提取量為(1027.47±10.76) mg/100 g,高于其他實驗組,但與正交實驗中較優(yōu)組合A1B3C3D3無顯著差異性。綜合考慮溶劑消耗、能量消耗等,澳洲堅果堅果青皮多酚提取最佳工藝條件為A2B3C2D3。

表3 正交實驗方差分析表

2.3澳洲堅果青皮多酚抗氧化能力研究

2.3.1 澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基清除能力的研究 從圖5中可知,在2.0～10.0 mg/L濃度范圍內(nèi),Trolox和澳洲堅果青皮多酚DPPH自由基清除能力與濃度呈正相關(guān)。澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基的IC50為4.13 mg/L,Trolox對DPPH自由基的IC50為18.56 mg/L,由此可知,在等濃度條件下,澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基的清除能力遠(yuǎn)高于Trolox。

圖5 澳洲堅果青皮多酚與Trolox對DPPH自由基的清除作用

2.3.2 澳洲堅果青皮多酚對ABTS+自由基清除能力的研究 從圖6中可知,Trolox和澳洲堅果青皮多酚對ABTS+自由基清除能力與其對DPPH自由基清除能力結(jié)果一致,在20.0～200.0 mg/L濃度范圍內(nèi),隨Trolox和澳洲堅果青皮多酚濃度的增加,其對ABTS+自由基清除能力不斷增加。澳洲堅果青皮多酚對ABTS+自由基的IC50為112.94 mg/L,Trolox對ABTS+自由基的IC50為293.83 mg/L,由此可知,澳洲堅果青皮多酚對ABTS+自由基清除能力遠(yuǎn)高于同濃度下的Trolox。

圖6 澳洲堅果青皮多酚與Trolox對ABTS+自由基的清除作用

2.3.3 澳洲堅果青皮多酚總抗氧化能力的研究 以Trolox為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),根據(jù)濃度與吸光值得關(guān)系,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.00123x+0.07672(其中:y為吸光值;x為Trolox濃度,mg/L;R2=0.9990),見圖7。當(dāng)澳洲堅果青皮多酚濃度為201.86 mg/L時,由Trolox標(biāo)準(zhǔn)曲線查的Trolox濃度為(343.32±10.35) mg/L,即澳洲堅果青皮多酚濃度為201.86 mg/L時,其總抗氧化能力相當(dāng)于343.32 mg/L的Trolox,由此可知,澳洲堅果青皮多酚的總抗氧化能力約為Trolox的1.7倍。

圖7 總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線

3 結(jié)論

通過正交實驗極差分析與方差分析明確了各因素對澳洲堅果青皮多酚提取的影響順序依次為:乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時間和提取溫度,并確定了最佳工藝條件:提取時間為90 min、料液比為1∶50 (g/mL)、提取溫度為50 ℃、乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%;在此條件下,澳洲堅果青皮多酚提取量(1027.47±10.76) mg/100 g。

以Trolox為陽性對照,評價澳洲堅果青皮多酚的體外抗氧化活性。澳洲堅果青皮多酚對DPPH自由基和ABTS+自由基的IC50分別為4.13、112.94 mg/L,與Trolox相比,分別低了14.43 mg/L和180.89 mg/L;澳洲堅果青皮多酚總抗氧化能力約為Trolox的1.7倍。由此可知,澳洲堅果青皮多酚具有較強(qiáng)的抗氧化能力,可用于制備天然抗氧化劑,為澳洲堅果副產(chǎn)物高值化利用及延伸澳洲堅果加工產(chǎn)業(yè)鏈提供基礎(chǔ)。

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Optimizationofextractionandantioxidantactivityofpolyphenolsfrommacadamiagreenpeel

ZHANGMing,SHUAIXi-xiang,DULi-qing*,TUXing-hao

(Key Laboratory of Tropical Fruit Biology of the Ministry of Agriculture,South Subtropical Crops Research Institute ofthe Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Zhanjiang 524091,China)

The study focus on the optimization of extraction and antioxidant activity of polyphenols from fresh macadamia green peel. The four factors and three level orthogonal test was carried out on the basis of single factor experiment. The evaluation of antioxidant activity of the polyphenols that extracted from macadamia green peel was carried out by DPPH,ABTS+radical scavenging and total antioxidant capacity in comparison to Trolox. The optimized conditions were determined as follows:extraction time 90 min,solid-liquid ratio 1∶50 (g/mL),extraction temperature 50 ℃,40% ethanol. And the polyphenols yield was up to(1027.47±10.76) mg/100 g under the optimized conditions. In the DPPH,ABTS+radical scavenging assays,the IC50value of the polyphenols that extracted from macadamia green peel were 4.13,112.94 mg/L,respectively. And the total antioxidant capacity was about 1.7 times of Trolox. Moreover,the antioxidant capacity of the polyphenols that extracted from macadamia green peel was very strong and it can be used to prepare natural antioxidants.

macadamia green peel;polyphenols;extraction;antioxidant

2017-05-18

張明(1989-)，碩士研究生，研究方向：休閑農(nóng)產(chǎn)品加工，E-mail：zhangmingqau@163.com。

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杜麗清(1976-)，碩士，研究員，研究方向：休閑農(nóng)業(yè)，E-mail：duliqing927618@163.com。

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金項目(1630062016007)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(1630062017018)；中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(1630062016012)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201303077)。

TS202.1

B

1002-0306(2017)22-0195-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.038