水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的工藝優(yōu)化

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(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的工藝優(yōu)化

張越,付莉*

(錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,遼寧錦州 121000)

以黑龍江密山蜂王漿作為原料,水溶性蛋白提取率作為評價指標(biāo),在單因素實驗和PB實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面法對水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化。實驗結(jié)果顯示,最佳工藝參數(shù)為離心轉(zhuǎn)速10000 r/min、離心時間25 min、料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時間41 min、沉淀時間43 min,此條件下蜂王漿水溶性蛋白提取率達(dá)到69.97%,是蜂王漿水溶性蛋白提取的較好方法。

水提酸沉法,蜂王漿,水溶性蛋白,提取工藝,優(yōu)化

蜂王漿(Royal jelly,RJ)是可供人類直接服用并能被人體很好吸收的含高活性成分的超級營養(yǎng)食品,具有多種生物活性且大多跟蜂王漿中所含的豐富的蛋白質(zhì)密切相關(guān)[1-2]。蜂王漿中水溶性蛋白質(zhì)約占蜂王漿總蛋白的46%～89%,是蜂王漿中最主要的活性成分。但是由于國內(nèi)外市場上銷售的僅有新鮮蜂王漿或其凍干粉產(chǎn)品,因此研發(fā)蜂王漿水溶性蛋白相關(guān)的新產(chǎn)品十分必要[3-5]。

目前對蜂王漿水溶性蛋白的提取多采用堿溶酸沉、鹽提酸沉法等方法,與這些方法相比,水提酸沉法具有成本低、操作簡單、可保存被分離物生物活性等優(yōu)點[6-7]。因此,本實驗采用水提酸沉法對蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行研究,以水溶性蛋白提取率為評價指標(biāo),通過單因素實驗、PB和響應(yīng)面優(yōu)化分析,對蜂王漿水溶性蛋白的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蜂王漿 黑龍江密山蜂場,-20 ℃凍藏;牛血清蛋白 北京索萊寶科技有限公司;鹽酸、硫酸鉀、95%乙醇、考馬斯亮藍(lán)G-250、85%磷酸等 均為分析純,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

UV-6300型紫外可見分光光度計 上海美普達(dá)儀器有限公司;KND-04型微量凱氏定氮裝置 上海新嘉電子有限公司;KQ3200B型超聲清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;立式高速冷凍離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝 10 g蜂王漿(按一定比例加入蒸餾水)→超聲波提取(150 W)一定時間→4 ℃離心(一定離心轉(zhuǎn)速、一定時間)→去沉淀→收集上清液→用0.1 mol/L HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至等電點→沉淀→4 ℃、12000 r/min離心20 min→去上清液→收集沉淀得到含鹽蛋白質(zhì)→透析除鹽→蛋白提取物。

1.2.2 蜂王漿水溶性蛋白質(zhì)等電點的測定 預(yù)實驗：將10 g蜂王漿與蒸餾水以1∶5的比例進(jìn)行混合，攪拌使其充分混勻，4 ℃浸提1 h，12000 r/min離心20 min，收集上清液。分別取5 mL上清液加入到5支干凈的具塞刻度比色管中，編號為1、2、3、4、5，并用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，并用蒸餾水定容至25 mL，4 ℃靜置5 h后，觀察5支比色管中溶液的渾濁程度(即蛋白質(zhì)的沉淀量)[8]。

分別取上述5 mL上清液加入到11支干凈的具塞刻度比色管中，編號為1～11，并用0.1 mol/L鹽酸和0.1 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH分別為4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0，并用蒸餾水定容至25 mL，4 ℃靜置5 h后，觀察11支比色管中溶液的渾濁程度(即蛋白質(zhì)的沉淀量)[8]。

1.2.3 蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化

1.2.3.1 單因素實驗 采用1.2.1的工藝提取蜂王漿水溶性蛋白,重新溶于蒸餾水并于波長595 nm處測定吸光度,提取條件為:超聲波提取30 min,10000 r/min離心20 min,沉淀40 min,考察不同料水質(zhì)量比(1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25)對水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,10000 r/min離心25 min,沉淀40 min,考察不同超聲波提取時間(10、20、30、40、50 min)對水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取30 min,離心20 min,沉淀40 min,考察不同離心轉(zhuǎn)速(4000、6000、8000、10000、12000 r/min)對水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取30 min,離心轉(zhuǎn)速10000 r/min,沉淀40 min,考察不同離心時間(15、20、25、30、35 min)對水溶性蛋白提取率的影響;料水質(zhì)量比1∶20,超聲波提取40 min,10000 r/min離心25 min,考察不同沉淀時間(20、30、40、50、60 min)對水溶性蛋白提取率的影響。

1.2.3.2 PB實驗選取顯著性因素 以上述單因素實驗結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實驗,對上述5個因素加以考察,每個因素選擇-1和1兩個水平,將蜂王漿水溶性蛋白提取率作為響應(yīng)值[9]。PB實驗設(shè)計因素水平和編碼如表1所示。

表1 PB實驗設(shè)計因素水平和編碼

1.2.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計 PB實驗選定因素進(jìn)行響應(yīng)面實驗,確定最佳提取條件。離心轉(zhuǎn)速10000 r/min,離心時間25 min。實驗設(shè)計因素水平如表2所示。

表2 響應(yīng)面實驗因素水平及編碼

1.2.3.4 蜂王漿水溶性蛋白提取率測定 參考GB 5009.5-2016中方法測定蜂王漿總蛋白含量。參考《進(jìn)出口危險化學(xué)品安全實驗方法》中第20部分Bradford法測定提取所得蜂王漿水溶性蛋白含量,得到線性回歸方程:y=0.0062x+0.0621,R2=0.9999,表明Bradford法中吸光度(y)與牛血清蛋白含量(x)之間有非常明顯的線性關(guān)系,將樣品吸光度代入該方程,即可得樣品蜂王漿中所含水溶性蛋白含量,再根據(jù)式(1)計算出蜂王漿水溶性蛋白的提取率。

蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=蜂王漿水溶性蛋白含量/蜂王漿總蛋白含量×100

式(1)

1.3數(shù)據(jù)處理

PB實驗與響應(yīng)面的設(shè)計、數(shù)據(jù)分析利用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1蜂王漿水溶性蛋白質(zhì)等電點的測定

預(yù)實驗結(jié)果顯示,在pH4和pH5時,水溶性蛋白沉淀量最大,為了更精確地測定水溶性蛋白的等電點,在pH4和pH5之間每隔0.1個單位調(diào)節(jié)一個pH,結(jié)果如表1所示,pH4.4時沉淀量最大,因此蜂王漿水溶性蛋白等電點為pH4.4。

表3 水溶性蛋白等電點的測定

注:“+”表示沉淀量的多少,“+”越多表示沉淀量越多。

2.2單因素實驗

2.2.1 料水質(zhì)量比對水溶性蛋白提取率的影響 如圖1所示,水溶性蛋白提取率隨著料水質(zhì)量比的增大出現(xiàn)先增高后降低的趨勢,并且料水質(zhì)量比在1∶20時最高。這可能是因為料水質(zhì)量比太低，水溶性蛋白不能完全溶于水中,隨著料水質(zhì)量比的增大,水溶性蛋白逐漸溶于水中,而過高的料水質(zhì)量比會使得體系中的蛋白質(zhì)太過分散,有效組分含量減少,難以全部回收,導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[10],因此,料水質(zhì)量比選取1∶20。

圖1 料水質(zhì)量比對水溶性蛋白提取率的影響

2.2.2 超聲波提取時間對水溶性蛋白提取率的影響 如圖2所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著超聲波提取時間的增加,出現(xiàn)先升高后降低的趨勢,并且在超聲波提取40 min時最高。超聲波通過波源的振蕩作用,使提取物的外表受到機(jī)械損傷和破碎,使溶脹的時間大大地減少。超聲空化作用使得蛋白質(zhì)在較短時間內(nèi)最大限度的溶出,而超聲空化作用時間過長會使得蛋白質(zhì)變性,從而導(dǎo)致水溶性蛋白提取率降低[11-12]。因此,超聲波提取時間選擇40 min。

圖2 超聲波提取時間對水溶性蛋白提取率的影響

2.2.3 離心轉(zhuǎn)速對水溶性蛋白提取率的影響 如圖3所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著離心轉(zhuǎn)速的增大,呈現(xiàn)先降低后增高再降低的趨勢,并且離心轉(zhuǎn)速4000 r/min時最高。但是離心轉(zhuǎn)速4000 r/min和6000 r/min時,溶液呈渾濁狀,不溶性蛋白質(zhì)的混入導(dǎo)致了結(jié)果偏高;而離心轉(zhuǎn)速在8000～12000 r/min時,10000r/min的水溶性蛋白提取率最高。因此離心轉(zhuǎn)速選取10000 r/min。

圖3 離心轉(zhuǎn)速對水溶性蛋白提取率的影響

2.2.4 離心時間對水溶性蛋白提取率的影響 如圖4所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著離心時間的增加,呈現(xiàn)降低并趨于恒定的趨勢,并且在離心時間15 min時最高。但是離心時間15 min和20 min時,溶液呈渾濁狀,不溶性蛋白質(zhì)的混入導(dǎo)致了結(jié)果偏高[13],而25～35 min范圍內(nèi),水溶性蛋白提取率趨于恒定,所以綜合考慮,離心時間選擇25 min。

圖4 離心時間對水溶性蛋白提取率的影響

2.2.5 沉淀時間對水溶性蛋白提取率的影響 如圖5所示,蜂王漿水溶性蛋白提取率隨著沉淀時間的增加,呈現(xiàn)先增高后趨于穩(wěn)定的變化趨勢,并且在沉淀時間60 min時最高。但40～60 min逐漸趨于最大沉降限度,水溶性蛋白提取率趨于恒定。所以考慮節(jié)約資源問題,沉淀時間選擇40 min。

圖5 沉淀時間對水溶性蛋白提取率的影響

2.3PB實驗結(jié)果與分析

2.3.1 PB實驗結(jié)果 以單因素實驗結(jié)果為依據(jù)進(jìn)行N=12的PB實驗,對上述5個因素加以考察,結(jié)果如表4所示。

表5 PB實驗方差分析

表4 PB實驗設(shè)計與結(jié)果

2.3.2 PB實驗方差分析 利用Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行回歸擬合,得到回歸方程為:蜂王漿水溶性蛋白提取率(%)=63.92-0.062A-0.53B+3.21C+2.14D+2.46E。方差分析如表5所示,R2=0.9618,且回歸模型(p<0.05)顯著,具有統(tǒng)計學(xué)意義。五個因素中只有料水質(zhì)量比、超聲波提取時間、沉淀時間對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著,因此選定該三個因素進(jìn)行接下來的響應(yīng)面優(yōu)化分析。

2.4響應(yīng)面優(yōu)化實驗

2.4.1 實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析 以單因素及PB實驗結(jié)果為基礎(chǔ),選擇料水質(zhì)量比(A)、沉淀時間(B)、超聲波提取時間(C)三個因素,水溶性蛋白提取率(Y)為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面軟件設(shè)計水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白實驗方案。結(jié)果如表6所示。

表6 響應(yīng)面實驗設(shè)計與結(jié)果

2.4.2 回歸模型的方差分析 運用響應(yīng)面軟件將實驗數(shù)據(jù)回歸擬合,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率與料水質(zhì)量比、沉淀時間、超聲波提取時間三因素間的回歸方程:Y：水溶性蛋白提取率(%)=69.76+1.11A+0.47B+1.80C-0.72AB-1.87AC-0.21BC-3.41A2-3.10B2-3.03C2。該方程的二次項系數(shù)均為負(fù)值,初步推斷響應(yīng)面開口向下,在各因素所選水平范圍內(nèi)具有極大值點,能夠進(jìn)行蜂王漿水溶性蛋白提取率工藝的優(yōu)化分析[14-15]。

表7 回歸模型的方差分析結(jié)果

圖6 AB、AC、BC交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響的響應(yīng)面圖

注:***:p<0.001為極顯著；**:p<0.01為非常顯著；*:p<0.05顯著。

回歸模型的方差分析結(jié)果如表7所示，該模型p<0.001(極顯著)，失擬項=0.9549>0.05(不顯著)，表明該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)很吻合，實驗誤差較小?；貧w模型R2=0.9987，即擬合優(yōu)度為99.87%，表示該回歸模型與實驗數(shù)據(jù)擬合程度較高，自變量和響應(yīng)值間有明顯的線性關(guān)系，所以該模型可對蜂王漿水溶性蛋白提取工藝優(yōu)化實驗進(jìn)行理論推測。料水質(zhì)量比、超聲波提取時間和沉淀時間的p值均小于0.001,說明三因素對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響均極顯著。F值大小能夠反映出各因素對響應(yīng)值的影響程度,并呈正相關(guān)[16],因此,可得出三者對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響程度依次是超聲波提取時間>料水質(zhì)量比>沉淀時間。交互項AB、AC影響極顯著(p<0.001),交互項BC影響不顯著(p>0.05)。

2.4.3 響應(yīng)面分析圖 從圖6中可以得出,各因素及其交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響。從圖6(A)中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和超聲波提取時間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,響應(yīng)面圖形曲面弧度較大,表明二者交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率影響顯著。從圖6(B)中可以看出,隨著料水質(zhì)量比和沉淀時間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,響應(yīng)面圖形曲面陡峭[16],表明二者間交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響顯著。從圖6(C)中可以看出,隨著超聲波提取時間和沉淀時間的增加,蜂王漿水溶性蛋白提取率均呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢,響應(yīng)面圖形曲面弧度小,表明二者間交互作用對蜂王漿水溶性蛋白提取率的影響不顯著。

2.5驗證實驗

根據(jù)上述回歸模型,通過響應(yīng)面優(yōu)化實驗所得水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件是:料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時間40.57 min、沉淀時間42.69 min,并得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的預(yù)測值是70.05%。為檢驗該結(jié)果的可靠性,擬采用上述響應(yīng)面優(yōu)化實驗所得水提酸沉法提取的條件,并結(jié)合實際情況,在料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時間41 min、沉淀時間43 min的條件下,經(jīng)過3次重復(fù)實驗,得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為69.97%,與響應(yīng)面優(yōu)化實驗所得預(yù)測值接近,表明回歸模型預(yù)測結(jié)果與實際結(jié)果很好擬合,響應(yīng)面優(yōu)化分析回歸模型可信度較高,所得最佳條件具有可行性。

3 結(jié)論

采用水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白,并在單因素實驗和PB實驗的基礎(chǔ)上,利用響應(yīng)面優(yōu)化分析并結(jié)合實際情況,確定水提酸沉法提取蜂王漿水溶性蛋白的最佳條件:料水質(zhì)量比1∶20、超聲波提取時間41 min、沉淀時間43 min。通過該最佳提取條件得到蜂王漿水溶性蛋白提取率的平均值為69.97%,與理論預(yù)測值的誤差小于0.1%,表明所建蜂王漿水溶性蛋白提取回歸模型成功。

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Optimizationofwater-solubleproteinextractionprocessofroyaljellybywaterextractionandacidprecipitation

ZHANGYue,FULi*

(College of Food Science and Engineering,Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000,China)

This experiment chose the royal jelly from Heilongjiang Mishan as raw material and took water-soluble protein extraction rate as evaluation indicator.Based on single factor experiment and Plackett-Burman design,the response surface optimization method was used to optimize the extraction of water-soluble protein from royal jelly by water extraction acid precipitation.The experiment showed that the optimum technological parameters were centrifugal speed 10000 r/min,centrifugation time 25 minutes,material water mass ratio 1∶20,ultrasonic extraction time 41 minutes,precipitation time 43 minutes.Under the condition,the water-soluble protein extraction rate of royal jelly was up to 69.97%,this method was the better way to extract royal jellywater-soluble protein .

water extraction and acid precipitation method;royal jelly;water-soluble protein;extraction process;optimization

2017-06-09

張越(1992-)，女，碩士，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：zy505188099@163.com。

*

付莉(1979-)，女，博士，副教授，研究方向：食品科學(xué)，E-mail：fuli1979119@126.com。

遼寧醫(yī)學(xué)院校內(nèi)課題(LYHX20120810)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)22-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.036