響應(yīng)面法優(yōu)化白玉菇多糖的提取工藝

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(臨沂大學(xué)藥學(xué)院,山東臨沂 276000)

響應(yīng)面法優(yōu)化白玉菇多糖的提取工藝

霍宗慶,徐婉晴,劉言娟*

(臨沂大學(xué)藥學(xué)院,山東臨沂 276000)

為優(yōu)化白玉菇多糖的提取工藝,選取提取溫度、提取時(shí)間以及水料比(mL/g)為因素,進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。并在此基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型,進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,對(duì)白玉菇多糖提取工藝的各因素進(jìn)行優(yōu)化及驗(yàn)證。最終確定最佳工藝條件為:提取溫度80 ℃、提取時(shí)間4.2 h、水料比(mL/g)35∶1，白玉菇多糖的平均得率為6.41%。

白玉菇,多糖,響應(yīng)面法,工藝優(yōu)化

白玉菇(white hypsizygus marmoreus)又名白玉蕈,為真姬菇的一個(gè)變種,隸屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomvcotina)、層菌綱(Hvmenomvcetes)、傘菌目(Agaicales)、白蘑科(Tricholomataceae)、玉蕈屬(Hypsizigus)[1-2],富含氨基酸和豐富的維生素以及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分[3]。已有研究結(jié)果表明,白玉菇的菌絲體和熱水浸提物均具有明顯的抗氧化活性[4],并且其實(shí)體和菌絲體中總糖和多元醇的含量明顯高于普通真姬菇中的含量[5]。王耀松等[6]的研究發(fā)現(xiàn),白玉菇子實(shí)體中營(yíng)養(yǎng)成分齊全,其中粗蛋白、粗脂肪和粗纖維含量較真姬菇稍低,礦物元素、維生素以及氨基酸含量和種類與真姬菇相當(dāng)且均較豐富,但是多糖的含量明顯高于真姬菇,而真菌多糖是食用菌最重要的組分之一,具有多種生物活性,包括抗氧化[7]、抗腫瘤[8]、抗輻射[9]、抗炎[10-11]、降血糖血脂[12-15]和免疫調(diào)節(jié)功能[16]等。因此,白玉菇作為食品、藥品原料,具有潛在的開發(fā)利用前景。

有研究發(fā)現(xiàn)白玉菇多糖對(duì)白色念珠菌和產(chǎn)氣桿菌有較強(qiáng)的抑制作用[17],另外,白玉菇多糖還具有增強(qiáng)免疫功能、止咳化痰、通便排毒、抗腫瘤、抗動(dòng)脈粥樣硬化等多種生物活性,經(jīng)常食用會(huì)改善人體的新陳代謝,降低膽固醇含量。本研究擬采用操作簡(jiǎn)單并且經(jīng)濟(jì)的熱水浸提法對(duì)白玉菇多糖進(jìn)行提取,采用Design-Expert 8.0.6軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,以確定白玉菇多糖水提醇沉的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

白玉菇 山東省臨沂市某市場(chǎng);硫酸 分析純,南京化學(xué)試劑有限公司;苯酚 分析純,廣東汕頭市西隴化工廠;無水乙醇 分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司;葡糖糖標(biāo)準(zhǔn)品 大連美侖生物技術(shù)有限公司;本實(shí)驗(yàn)用水 均為蒸餾水。

DF-1型集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHG-9035A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科技有限公司;RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LD5-2B低速離心機(jī) 北京雷勃爾離心機(jī)有限公司;TU-1810紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;ME104E電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;DZF-6050真空干燥箱 上海風(fēng)棱實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白玉菇多糖的提取工藝 將新鮮白玉菇放在45 ℃真空干燥箱中烘干至恒定質(zhì)量→粉碎機(jī)粉碎后過60目篩→白玉菇干粉→熱水浸提→低速離心(4000 r/min)20 min→取上清液→濃縮至原體積1/5→4倍量乙醇沉淀→過夜→濾液離心→沉淀物→真空干燥→白玉菇多糖粗品粉末。

1.2.2 多糖含量的測(cè)定

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 本研究采用苯酚-硫酸法[18]對(duì)白玉菇多糖含量進(jìn)行測(cè)定。精密稱取干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,蒸餾水定容至100 mL,備用。分別取上述儲(chǔ)備液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL到對(duì)應(yīng)編號(hào)的試管中,分別加蒸餾水補(bǔ)至2.0 mL,得到濃度分別為0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別向上述各試管中加入1.0 mL 6%苯酚、5.0 mL濃硫酸,搖勻,沸水浴30 min,之后冷卻至室溫,待測(cè)?？瞻讓?duì)照采用2.0 mL蒸餾水、1.0 mL 6%苯酚、5.0 mL濃硫酸進(jìn)行配制,于490 nm處測(cè)定吸光度。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(X)為橫坐標(biāo),吸光度(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:Y=15.57X-0.0263(R2=0.9991)。

1.2.2.2 白玉菇多糖含量的測(cè)定 精密稱取1.2.1中的多糖粉末10.0 mg,加水定容至100 mL,取2.0 mL加入試管中。按1.2.2.1中的方法進(jìn)行操作,在490 nm處測(cè)定樣品溶液的吸光度。將所測(cè)吸光度值帶入1.2.2.1的回歸方程中計(jì)算得樣品溶液中多糖的濃度。

1.2.3 白玉菇多糖得率的計(jì)算

多糖得率(%)=(多糖的濃度×溶液的體積×稀釋倍數(shù))÷白玉菇干重×100

1.2.4 單因素實(shí)驗(yàn) 以白玉菇多糖的得率為考察指標(biāo),分別考察提取溫度、提取時(shí)間和水料比對(duì)白玉菇多糖得率的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)平行做3次,取平均值。

1.2.4.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 在提取時(shí)間3 h,水料比(mL/g)20∶1的條件下,分別選取50、60、70、80和90 ℃為提取溫度進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以考察提取溫度對(duì)多糖得率的影響。

1.2.4.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 以1.2.4.1中篩選出的最佳提取溫度(80 ℃)和水料比20∶1 (mL/g)為實(shí)驗(yàn)條件,分別選取1、2、3、4、5 h為提取時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以考察提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響。

1.2.4.3 水料比對(duì)多糖得率的影響 以1.2.4.1和1.2.4.2中篩選出的最佳提取溫度(80 ℃)和最佳提取時(shí)間(4 h)為實(shí)驗(yàn)條件,分別選取10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1為提取時(shí)的水料比(mL/g)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以考察水料比對(duì)多糖得率的影響。

1.2.5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì) 在篩選出的最佳單因素條件的基礎(chǔ)上,以多糖得率為響應(yīng)值,使用Design-Expert 8.0.6軟件,進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)各因子編碼水平如表1所示。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平

1.3數(shù)據(jù)的處理

使用Design-Expert 8.0.6軟件的數(shù)據(jù)處理系統(tǒng),完成數(shù)學(xué)回歸模型的建立、顯著性分析、響應(yīng)曲面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響 如圖1所示,在50～80 ℃的區(qū)間內(nèi),白玉菇多糖得率隨提取溫度的升高而增大,在80 ℃時(shí),多糖得率達(dá)到最大值,再繼續(xù)升高溫度時(shí)多糖得率開始下降?？赡苁怯捎跍囟冗^高會(huì)導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)破壞,發(fā)生降解,使得多糖得率降低[19-20],因此選擇提取溫度為80 ℃。

圖1 提取溫度對(duì)多糖得率的影響

2.1.2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響 如圖2所示,提取時(shí)間為1～4 h時(shí),多糖得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)增加較為明顯,超過4 h以后多糖得率變化趨于平緩甚至有降低趨勢(shì)。4 h時(shí)多糖得率最大,故選4 h為最佳提取時(shí)間。多糖從白玉菇粉末擴(kuò)散到溶劑中需要一定時(shí)間,提取開始時(shí),多糖在水中的濃度很低,在一定的時(shí)間內(nèi)白玉菇中的多糖可以快速地釋放到提取溶劑中,時(shí)間越長(zhǎng)釋放到溶劑中的多糖量越多[19]。但隨著時(shí)間的延長(zhǎng),一方面,溶劑中的多糖含量不斷升高,溶液趨于飽和狀態(tài),使得多糖的釋放量減少,多糖得率增幅減小;另外,白玉菇中的糖蛋白可能因提取時(shí)間過長(zhǎng)而變性,沉淀析出,使得多糖的得率下降。

圖2 提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響

2.1.3 提取水料比(mL/g)對(duì)多糖得率的影響 如圖3所示,在水料比(mL/g)小于30∶1時(shí),多糖得率隨水料比的增大而呈上升趨勢(shì),之后開始下降,30∶1是白玉菇多糖得率最高的水料比(mL/g)。在提取過程中,水料比(mL/g)對(duì)得率的影響可以解釋為:溶劑量的增加使物料與溶劑接觸面積、溶液傳質(zhì)推動(dòng)力均增大,濃度梯度變大,有利于多糖的溶出,從而使其溶出速度和得率變大,當(dāng)水料比(mL/g)一定時(shí),得率最高;隨著水料比(mL/g)的繼續(xù)增加,溶劑體積增加使得物料吸附溶劑的量也逐漸變大,從而導(dǎo)致多糖被物料吸附而不易溶出[21]。因此,本研究選擇30∶1為最佳提取水料比(mL/g)。

表3 模型方差分析結(jié)果

圖3 提取水料比對(duì)多糖得率的影響

2.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值

2.2.2 回歸模型的建立及方差分析 使用Box-Behnken設(shè)計(jì)模型數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中的ANOVA進(jìn)行回歸分析,并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn),建立回歸模型。模型方差分析結(jié)果如表3所示。

通過BBD模型分析,建立的模型回歸方程:

Y=-129.74375+3.01287A+6.77750B-0.001375C-0.040250AB+0.0026AC-0.014250BC-0.018150A2-0.35250B2-0.002050C2。

2.2.3 響應(yīng)面分析 響應(yīng)曲面的陡峭程度反映交互作用的顯著程度,曲面越陡峭,顯著程度越高,陡峭程度越小,則表示交互作用顯著程度越低[22]。等高線的形狀也反應(yīng)交互作用的強(qiáng)弱,等高線越接近于圓形,顯著程度越弱,形狀越接近于橢圓形,則表示交互作用越顯著[23]。各因素之間的交互影響直觀效果如圖4～圖6所示。

如圖4所示,曲面陡峭,說明提取時(shí)間和提取溫度的交互作用顯著,多糖得率隨溫度和時(shí)間的遞增先增加后減少。由圖4中的等高線可知,等高線的橢圓程度較高,也顯示提取時(shí)間和提取溫度交互作用顯著,等高線集中在提取時(shí)間一側(cè),表明提取時(shí)間對(duì)于多糖得率的影響大于提取溫度。

圖4 提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖得率的交互作用響應(yīng)面圖

由響應(yīng)面圖5所示,曲面平緩,說明水料比和提取溫度的交互作用不顯著,多糖得率隨溫度和水料比的遞增先增加后減少。由圖中的等高線可知,等高線的橢圓程度不高且等高線稀疏,也顯示兩者交互作用不顯著,等高線集中在水料比一側(cè),表明水料比對(duì)于多糖得率的影響大于提取溫度的影響。

圖5 水料比和提取溫度對(duì)多糖得率的交互作用響應(yīng)曲面圖

由響應(yīng)面圖6所示,曲面平緩,說明水料比和提取時(shí)間的交互作用不顯著,多糖得率隨時(shí)間和水料比的變化不明顯。從其中的等高線可知,等高線形狀的橢圓程度不大,也顯示兩者交互作用不明顯。

圖6 提取時(shí)間和水料比對(duì)多糖得率的交互作用響應(yīng)面圖

2.2.4 最佳工藝條件的確定 通過Design-Expert 8.0.6軟件,依照數(shù)學(xué)回歸模型對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化,得出最佳工藝參數(shù)為提取溫度80.85 ℃、提取時(shí)間4.27 h、水料比(mL/g)36.10∶1,多糖得率理論值為6.49%。

為驗(yàn)證分析結(jié)果的可行性與可靠性,選取工藝條件為提取溫度80 ℃、提取時(shí)間4.2 h、水料比35∶1 (mL/g)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),白玉菇多糖的平均得率為6.41%,接近6.49%的理論值,其相對(duì)誤差為0.08%,表明該模型準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論與討論

本文首先篩選了采用水提醇沉法提取白玉菇多糖的最佳單因素條件:提取溫度、提取時(shí)間和水料比。以響應(yīng)面優(yōu)化的參數(shù)為指導(dǎo)最終確定水提醇沉法提取白玉菇多糖的最佳工藝條件為:提取溫度80 ℃、提取時(shí)間4.2 h、水料比35∶1 (mL/g),在該實(shí)驗(yàn)條件下白玉菇多糖的平均得率為6.41%。已有研究將熱水浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法和堿提法對(duì)白玉菇多糖的提取效果進(jìn)行比較,結(jié)果顯示4種方法提取多糖的得率分別為2.90%、5.48%、4.86%、4.71%[24],均低于本研究中多糖的得率。王孟楚等優(yōu)化超聲波輔助提取白玉菇多糖的各項(xiàng)參數(shù),最終經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證利用最優(yōu)工藝路線所得多糖得率為7.79%[25]。雖然該工藝路線對(duì)多糖的得率比本研究中的高,但是本研究的能耗和成本相對(duì)較低,更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。本文將為白玉菇多糖的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

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Optimizationoftheextractiontechnologyofpolysaccharideinwhitehypsizygusmarmoreusbyresponsesurfacemethodology

HUOZong-qing,XUWan-qing,LIUYan-juan*

(School of Pharmacy,Linyi University,Linyi 276000,China)

In order to optimize the extraction process of white hypsizygus marmoreus polysaccharide,the single-factor experiments were carried out with extraction temperature,extraction time and ratios of water to material as single factors. On the basis of single-factor experiments,response surface methodology was employed to establish mathematic model,analyze experimental data,optimize and verify the extraction process parameters of white mushroom polysaccharide. The results of optimum extraction conditions were as follows:extraction temperature 80 ℃,extraction time 4.2 h and ratio of water to raw material 35∶1 (mL/g). Under these conditions,the average extraction yield was 6.41%.

white hypsizygus marmoreus;polysaccharide;response surface methodology;process optimization

2017-04-25

霍宗慶(1994-)，男，大學(xué)本科，研究方向：天然產(chǎn)物的分離與純化，E-mail:1043119507@qq.com。

*

劉言娟(1985-)，女，博士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物的色譜分離與分析，E-mail:liuyanjuan09@163.com。

臨沂大學(xué)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)(LYDX2016BS050)。

TS201.1

B

1002-0306(2017)22-0145-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.029