伊犁地區(qū)肉牛源產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清型和ERIC-PCR基因型研究

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(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

伊犁地區(qū)肉牛源產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清型和ERIC-PCR基因型研究

劉英玉,張妍,夏利寧,姚剛,張曉紅

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,新疆烏魯木齊 830052)

目的:了解產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌在伊犁地區(qū)肉牛養(yǎng)殖環(huán)境和加工環(huán)節(jié)中的污染狀況及其遺傳多樣性,為產(chǎn)業(yè)鏈中食源性致病性大腸桿菌的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和控制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。方法:采用傳統(tǒng)方法和PCR方法對養(yǎng)殖環(huán)節(jié)的飼草料和糞便及屠宰環(huán)節(jié)的553份樣品進(jìn)行產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的污染調(diào)查,對分離鑒定的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌進(jìn)行7種常見血清型(O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121)的PCR檢測和ERIC-PCR的基因分型。結(jié)果:檢測553份樣品中有39株編碼志賀毒素基因,產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(STEC)的檢測率是7.1%。常見血清型PCR檢測中血清型O111有2株菌,檢出率是5.1%;O145有5株菌,檢出率是12.8%。ERIC-PCR基因分型產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌有10種基因亞型,分成3簇,A簇有23株菌,相似性在59%～100%,表明這些菌株之間的親緣關(guān)系較近。結(jié)論:伊犁地區(qū)肉牛糞便是產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的污染源,這些菌株的親緣關(guān)系較近。

伊犁地區(qū)肉牛,產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌,PCR檢測,ERIC-PCR基因分型

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producingEscherichiacoli,STEC)是一類攜帶了前噬菌體編碼一種或兩種志賀毒素基因的新發(fā)高致病性食源性病原菌,可引起人類水樣腹瀉、出血性腸炎及溶血性尿毒癥(hemolytic uremic syndrome,HUS)等疾病[1-2]。前期研究以血清型O157∶H7大腸桿菌為主,但目前報(bào)道許多國家非O157的流行已超過O157[3]。目前國際上報(bào)道的非O157型STEC菌株的主要血清型為O26、O103、O111、O91、O113、O118、O128和O145等[4]。前期中國學(xué)者對大腸桿菌中優(yōu)勢血清進(jìn)行了分析,薛濤等[5]對江蘇某奶牛場糞便中菌株的血清學(xué)分型結(jié)果顯示,其優(yōu)勢血清型為O4、O26和O93。郝彥龍等報(bào)道新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉大腸桿菌的優(yōu)勢血清型為O101、O6、O114、O78[6]。

Wilson等[7]調(diào)查大腸桿菌的ERIC(Enterobacterial repetitive intergenic consensus,ERIC)序列發(fā)現(xiàn)親本和復(fù)本是高度保守的,而且在大腸桿菌基因組里有一定的拷貝數(shù),可以作為指紋圖譜方法的檢測。Prabhu等[8]采用ERIC-PCR方法檢測奶牛場的40株大腸桿菌,其中有37株擴(kuò)增出多態(tài)性目的條帶,其中有22株菌可分為四個(gè)基因組,15株具有獨(dú)特的基因型。不同地域和不同時(shí)間段中大腸桿菌的血清型存在差異,不同基因型可能是同一血清型或是未檢出血清型。ERIC-PCR是目前常用的一種簡便、快速的基因分型技術(shù),其分辨率較強(qiáng),結(jié)果可與細(xì)菌分子生物學(xué)分型技術(shù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”PFGE分型有一定相關(guān)性[9-10]。ERIC-PCR方法花費(fèi)的時(shí)間和成本在脈沖場凝膠電泳(Pulsed Field Gel Electrophoresis,PFGE)、限制性內(nèi)切酶(Sau3AI)酶切和PCR擴(kuò)增相結(jié)合的分子分型技術(shù)(Sau-PCR)、ERIC-PCR方法中最低,是基層單位進(jìn)行初期溯源分型的首選方法[11]。本實(shí)驗(yàn)對伊犁地區(qū)肉牛養(yǎng)殖場的飼草料和糞便及屠宰加工環(huán)節(jié)進(jìn)行產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的污染調(diào)查,對分離鑒定的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌進(jìn)行PCR(O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121)的監(jiān)測和ERIC-PCR的基因分型,比較分析同一地區(qū)中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清型和基因分型變化情況。

1 材料和方法

1.1材料與儀器

大腸桿菌CICC21530標(biāo)準(zhǔn)株 由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院況玲教授提供;樣品 2013年秋季在伊犁地區(qū)某規(guī)?；馀Ｓ蕡龊头庇龍霾杉暡萘虾图S便各86和60份,其定點(diǎn)屠宰場采集屠宰加工環(huán)節(jié)樣品34份,2014年夏季伊犁地區(qū)的高山牧場和育肥場采集飼草料和糞便各58和150份,2014年秋季其定點(diǎn)屠宰場采集屠宰加工環(huán)節(jié)樣品40份,2014年冬季在伊犁地區(qū)某規(guī)?；馀Ｓ蕡龊头庇龍霾杉S便125份,飼草料包括精飼料、青貯、青干草和秸稈,合計(jì)共553份樣品;LB肉湯、月桂基硫酸鹽胰蛋白胨、煌綠乳糖膽鹽、乳糖膽鹽發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基、伊紅美蘭瓊脂、麥康凱培養(yǎng)基 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;TaqMasterMix、DNA 100Marker、瓊脂糖 新疆偉博鑫生物有限公司;溴化乙錠(EB) 北京欣經(jīng)科生物技術(shù)公司。

電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;YJ-875醫(yī)用凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備公司;THZ-02型臺式恒溫振蕩器 中國科學(xué)院新疆分院科學(xué)儀器廠;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;XSP-4C生物雙目顯微鏡 上海光密儀器有限公司;粉碎機(jī) 浙江省溫嶺市大鵬機(jī)械有限公司;Bio-rad T100梯度PCR儀、移液器、高速離心機(jī) 德國Eppendorf公司;三洋制冰機(jī) 日本三洋有限公司;電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司;凝膠成像儀 美國伯樂公司;水平電泳槽 北京六一儀器廠;DYY-6C型電泳儀 六一儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離純化 依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18869-2002飼料中大腸菌群的測定和GB4789.3-2010食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中大腸菌群計(jì)數(shù)方法,對采集的飼草料和屠宰加工環(huán)節(jié)樣品進(jìn)行大腸桿菌分離,在麥康凱瓊脂中進(jìn)行鑒定和純化,同時(shí)挑取具有典型大腸桿菌特征的單菌落革蘭染色鏡檢,糞樣經(jīng)肉湯增菌后,在伊紅美蘭培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂中進(jìn)行鑒定和純化[12]。

1.2.2 PCR擴(kuò)增引物設(shè)計(jì) 參考Jianfa Bai[13]的志賀毒素引物設(shè)計(jì)方法,Atsushi[14]的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清PCR引物設(shè)計(jì)方法,參照曹蕓[15]的ERIC-PCR引物設(shè)計(jì)方法,由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成(見表1),用1×TE(10 mmol/L Tri-HCl,1 mmol/L EDTA,pH8.0)稀釋引物為使用濃度10 μmol/L。

1.2.3 PCR檢測 采用煮沸法制備細(xì)菌DNA模板,離心后收集上清[16]。

毒力基因的PCR檢測:反應(yīng)體系共25 μL,TaqMasterMix 10 μL,stx1和stx2的引物各0.4 μL,細(xì)菌DNA模板2 μL,ddH2O 11.4 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,4 ℃保存產(chǎn)物。

血清PCR檢測:反應(yīng)體系共25 μL,TaqMasterMix 12.5 μL,血清(O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121)的一對引物各1 μL,細(xì)菌DNA模板2 μL,ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物保存于4 ℃。

ERIC-PCR檢測:反應(yīng)體系25 μL,TaqMasterMix 12.5 μL,20 μmol/L ERIC1R和20 μmol/L ERIC2的引物各21.5 μL,細(xì)菌DNA模板2 μL,ddH2O 7.5 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s,50 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。

1.2.4 瓊脂糖凝膠電泳 取10 μL毒力基因和血清的PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳,電壓180 V。ERIC-PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳,電壓70 V。凝膠用EB染色,通過凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并掃描保存。

表1 PCR引物序列和擴(kuò)增長度

表2 飼草料、糞樣、屠宰環(huán)節(jié)中牛源大腸桿菌分離鑒定和志賀毒素基因檢測

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用BioNumerics軟件的非加權(quán)配對平均法(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean,UPGMA)對ERIC-PCR指紋圖譜進(jìn)行分析,條件位置差異容許度選擇1.5%,優(yōu)化值1.5%,相似系數(shù)使用Dice系數(shù)(F值)表示。公式為:F=2nxy/(nx+ny)。其中,nx表示菌株X的條帶數(shù),ny表示菌株Y的條帶數(shù),nxy表示菌株X和Y相同的電泳條帶數(shù),F值得數(shù)在0～1之間,值越大則表示相似程度越高。相似度≥80%者為同一亞型,<80%者為不同的基因亞型[17-18]。

2 結(jié)果與分析

2.1菌株的分離純化和志賀毒素基因的PCR檢測

如表2所示,糞樣中大腸桿菌分離率為70%以上,其中夏季糞樣中大腸桿菌菌株是編碼產(chǎn)志賀毒素基因最多的樣品,飼草料和屠宰環(huán)節(jié)中大腸桿菌分離率為30%以上,但是飼草料和屠宰環(huán)節(jié)中只分別檢測出1株菌攜帶有志賀毒素基因。大部分菌株編碼的志賀毒素基因是以stx1或stx2的單個(gè)毒力基因形式存在,共檢出39株編碼志賀毒素基因的菌株,檢出率為7.1%(39/553)。菌株編號是根據(jù)樣品采樣編號加字母n(糞便)、s(飼草料)、t(屠宰加工)來表示。

2.2產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清PCR檢測

用O145、O157、O45、O103、O111、O26、O121引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌,其中有2株菌(210n、315n)是O111血清型,檢出率是5.1%,有5株菌(58n、71n、370n、354n、356n)是O145血清型(如圖1),檢出率是12.8%,O45、O103、O26引物沒有擴(kuò)增出陽性條帶。O121或O157引物擴(kuò)增出非目的條帶大小片段,測序結(jié)果為無信號,即為假陽性。

圖1 O111(a)和O145(b)引物擴(kuò)增的目的條帶

文獻(xiàn)報(bào)道感染人類最常見的EHEC非O157血清型有:O26、O103、O111、O145、O121、O157等[19]。在日本散發(fā)流行的EHEC相關(guān)血清型有O26、O103及O111[20]。本研究通過引物擴(kuò)增編碼產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌檢測出存在O111和O145,還有許多菌株未鑒定出血清型,鑒定產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的血清型對于防控EHEC菌株的爆發(fā),保護(hù)動(dòng)物和人類健康具有重要的意義。大腸桿菌在不同地區(qū)或不同場區(qū)有著不同優(yōu)勢血清型,因?yàn)榇竽c桿菌血清型比較復(fù)雜,所以在預(yù)防方面產(chǎn)生了較大的困難。本研究中肉牛糞便中存在較多的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌,存在的血清型有O145和O111,還需要進(jìn)一步優(yōu)化產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的PCR檢測方法,為爆發(fā)產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌提供有效的鑒定方法。細(xì)菌的表型易受環(huán)境變化而發(fā)生變異,從而給菌株分型鑒定帶來困難,可利用基因分型方法獲得指紋圖譜,從而確定菌株之間的親緣關(guān)系,追蹤傳染源從而達(dá)到溯源目的,以區(qū)分是散發(fā)還是暴發(fā)或者流行等情況。

圖3 30株產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的ERIC-PCR基因分型結(jié)果

2.3產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的ERIC-PCR基因分型

產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的ERIC-PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,其中有9株菌株編碼志賀毒素stx1+stx2和stx1/stx2的沒有擴(kuò)增出條帶,其他菌株擴(kuò)增出條帶數(shù)量為2～7條,大小在100～2000 bp之間,產(chǎn)生了30種DNA指紋圖譜并呈現(xiàn)出多態(tài)性,如圖2。

圖2 產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的ERIC-PCR指紋圖譜電泳圖片

將擴(kuò)增出條帶的菌株通過Bio Numerics軟件繪制成UPGMA聚類樹,并進(jìn)行遺傳進(jìn)化關(guān)系分析,如圖3所示。根據(jù)相似度<80%的為不同基因亞型,≥60%為同簇的條件,聚類分析結(jié)果顯示30株STEC中有27株菌共有10種基因型,分為3簇,其中A簇有23株菌,相似性在59%～100%。其中菌株384n和385n、209n和315n及377n、210n和381n及71n、214n和316n、356n和357n及369n具有相同的指紋圖譜。按照相似度在80%以上的菌株認(rèn)為是相同的菌株或同一來源菌株,A簇里A1亞型、A2亞型、A4亞型、A5亞型的菌株可能為同一株菌或同一來源菌株。而A簇、B簇和C簇的菌株之間相似性小于59%,表明其與這些菌株之間的親緣關(guān)系遠(yuǎn)。

ERIC-PCR方法對于確定暴發(fā)流行,追蹤傳染源及可能的傳播途徑,確定同一病人反復(fù)感染是源于復(fù)發(fā)或再感染,明確某一菌株與某些臨床表現(xiàn)的相關(guān)性,增強(qiáng)對感染性疾病的流行病學(xué)認(rèn)識等方面有重要意義。Warriner等成功地應(yīng)用ERIC-PCR方法追蹤豬肉屠宰加工線上大腸桿菌[21]。根據(jù)ERIC-PCR指紋圖譜利用Bio Numerics軟件成功分析產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的遺傳進(jìn)化關(guān)系呈現(xiàn)較高的相似性。通過分析可以發(fā)現(xiàn)ERIC-PCR基于基因組上的特定重復(fù)序列能夠很好地把不同來源的大腸桿菌菌株進(jìn)行區(qū)分和歸類,進(jìn)而達(dá)到溯源的目的。張輝等[22]利用ERIC-PCR方法可將62株菌分為20型,其中以A型為優(yōu)勢菌群。遺傳相似性結(jié)果表明,各菌株之間遺傳相似性有較大的變化,但部分菌株高度同源。鐘召兵等[23]采用ERIC-PCR方法對牛奶中分離鑒定的25株大腸桿菌進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)分離菌的遺傳相似性在56%～100%之間。分析發(fā)現(xiàn)同一個(gè)生鮮乳收購站大腸桿菌的基因型存在不同,但是不同生鮮乳收購站之間也存在相同基因型大腸桿菌污染。本研究采用ERIC-PCR方法對糞便中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌stx1/stx2的基因分型結(jié)果表示,同一時(shí)間存在相同的基因型,且不同時(shí)間點(diǎn)也存在相同的基因型,其中A簇為優(yōu)勢菌群,占檢測結(jié)果的85%。說明該地區(qū)肉牛產(chǎn)業(yè)鏈中產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌的親緣關(guān)系較近。

3 結(jié)論

檢測伊犁地區(qū)肉牛養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中飼草料和糞樣及屠宰加工環(huán)節(jié)樣品共553份,糞樣中大腸桿菌分離率為70%以上,飼草料和屠宰環(huán)節(jié)中大腸桿菌分離率為30%以上;這些大腸桿菌中有39株編碼志賀毒素基因,其中夏季糞樣中大腸桿菌菌株是編碼產(chǎn)志賀毒素基因最多的樣品。常見產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌血清型以O(shè)111和O145為主。ERIC-PCR檢測30株菌中有23株是同一簇的,常見血清型該地區(qū)的產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌親緣關(guān)系較近。

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StudyonserotypeandERIC-PCRtypingofShigatoxin-producingEscherichiacoliinYiliarea

LIUYing-yu,ZHANGYan,XIALi-ning,YAOGang,ZHANGXiao-hong

(College of Animal Medicine,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,China)

Objective:To investigate the food contamination and genetic diversity of the Shiga toxin producingEscherichiacoliin cattle breeding and processing environment in Yili area. To provide the basic data for risk monitoring and control in the industrial chain of pathogenicityE.coliassociated foodborne disease. Methods:According to the national standard and the polymerase chain reaction(PCR)method detected the contamination of Shiga toxin-producingE.coliin the 553 samples including the breeding link forage and faeces,slaughter link. The isolation and identification STEC strains were used to detect the 7 common serotypes(O145,O157,O45,O103,O111,O26,O121)with PCR methods and ERIC-PCR genotyping. Results:There were 39 strains encoding Shiga toxin gene in 553 samples. The detection rate of STEC was about 7.1%. The detection of common serotype PCR have 2 strains and 5 strains in the serotype O111 and O145,the detection rate was about 5.1% and 12.8%,respectively. ERIC-PCR genotyping of STEC had 10 genetic subtypes and divided into 3 clusters. There were 23 strains in A cluster,the similarity was from 59% to 100%,which indicated that the relationship among these strains was relatively close. Conclusion:The beef cattle feces would be the source of Shiga toxin-producingE.coliand the genetic relationship of these strains was close in Yili area.

beef cattle in Yili area;Shiga toxin-producingEscherichiacoli;PCR method;ERIC-PCR genetyping

2017-04-21

劉英玉(1984-)，女，博士研究生，研究方向：畜產(chǎn)品質(zhì)量安全，E-mail:xjlyy1028@163.com。

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2014211B020)；自治區(qū)博士后普通資助。

TS251

A

1002-0306(2017)22-0140-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.028