酶轉(zhuǎn)化人參皂苷中25-OH-Rg2的純化及結(jié)構(gòu)鑒定

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(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

酶轉(zhuǎn)化人參皂苷中25-OH-Rg2的純化及結(jié)構(gòu)鑒定

王宇,劉春瑩,魚(yú)紅閃*

(大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院,遼寧大連 116034)

以分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定人參皂苷Re酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中未知皂苷為目標(biāo),采用酶轉(zhuǎn)化法制備產(chǎn)物,經(jīng)硅膠柱層析、結(jié)晶和重結(jié)晶對(duì)未知皂苷進(jìn)行分離純化,并進(jìn)行核磁共振結(jié)構(gòu)鑒定。酶轉(zhuǎn)化法制備的產(chǎn)物中,主要含有20(S,R)-Rg2、少量的Rg4和Rg6,以及HPLC檢測(cè)為雙峰的手性異構(gòu)體未知皂苷,酶轉(zhuǎn)化得率為65.5%(w/w)。采用硅膠柱層析和結(jié)晶重結(jié)晶方法,純化得到了0.33 g純度達(dá)99.7%的一種未知皂苷,經(jīng)核磁共振技術(shù)檢測(cè)確定該未知皂苷為20(R)-25-OH-Rg2,系統(tǒng)名稱為3β,12β,20(R),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside，以及另一種未知皂苷20(S)-25-OH-Rg2，系統(tǒng)名稱為3β,12β,20(S),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

人參皂苷Re,人參皂苷Rg2,20(R)-25-OH-Rg2,酶轉(zhuǎn)化

人參(Panaxginseng)是五加科人參屬多年生植物,其中含有的人參皂苷被認(rèn)為是最主要的活性成分,在醫(yī)藥和健康方面具促進(jìn)血液循環(huán)、平衡肌膚性質(zhì)、保護(hù)心肌、降血脂、抗動(dòng)脈硬化、抗腫瘤等諸多功效[1],受到人們的關(guān)注。目前已從人參屬植物中分離并鑒定出182種[2]人參皂苷。人參皂苷的種類按照其苷元結(jié)構(gòu)的不同可分為三種類型:達(dá)瑪烷型(Dammarene type)四環(huán)三萜類皂苷的原人參二醇型皂苷(Protopanaxadiol type ginsenoside,PPD)和原人參三醇型皂苷(Protopanaxatriol type ginsenoside,PPT)[3],以及齊墩果烷型(Oleanolic acid type)五環(huán)三萜類皂苷Ro[4]。不同人參屬植物中,總皂苷的含量和比例組成各不相同,一般在4%～10%(w/w)[5-6]。其中,PPT約占總皂苷含量的40%(w/w),PPT中含量較高且常見(jiàn)的皂苷有Re、Rg1、R1等[7]。而諸如Rh1、Rh4、Rg2、Rg4、Rg6、Rk3、F1等,在人參屬植物中含量極低或無(wú)。

利用PPT中含量較高且常見(jiàn)的皂苷,如人參皂苷Re,催化轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷,如Rg2、Rh1、Rg4、Rg6等,通常采用酸堿催化法[8]和酶轉(zhuǎn)化法[9]。酶轉(zhuǎn)化法由于具有反應(yīng)溫和,有很強(qiáng)的底物專一性,副產(chǎn)物少,對(duì)環(huán)境沒(méi)有污染等優(yōu)勢(shì)[10],在人參稀有皂苷的制備中有很好的應(yīng)用,并受到人們?cè)絹?lái)越多的關(guān)注。在前期的研究中,以人參皂苷Re為底物的酶轉(zhuǎn)化中,發(fā)現(xiàn)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中除了主要含有人參皂苷Rg2以外,還有幾種未知的人參皂苷。本論文以分離純化和鑒定該未知人參皂苷為目標(biāo),進(jìn)行人參皂苷Re為底物的酶轉(zhuǎn)化,制備酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,并對(duì)其中未知人參皂苷進(jìn)行分離純化,采用核磁共振法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

犁頭霉(Absidasp.G9g) 由大連工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院菌種保藏所提供;麥麩皮 大連調(diào)味品廠;人參粉 吉林撫松第一參場(chǎng)人參制品廠;人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品Re、Rg2、Rg4、Rg6、Rh1 實(shí)驗(yàn)室自制,HPLC純度在95%以上;Silica Gel 60-F254薄層層析板 德國(guó)Merck公司;硅膠 青島海洋化工廠;甲醇、氯仿 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;C18色譜柱 大連中匯達(dá)科學(xué)儀器有限公司。

Jasco N2000系列高效液相色譜儀 日本分光公司;Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)Alltech公司;AVANCE 400超導(dǎo)核磁共振波普儀 瑞士Bruke公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酶液的制備 稱取人參粉10 g,麥麩皮30 g,裝入500 mL三角瓶中,然后加入40 mL自來(lái)水,攪勻,在滅菌鍋中0.1～0.5 MPa下高壓滅菌20～30 min。上述滅菌后的固體培養(yǎng)基中,用接菌環(huán)接入10環(huán)Absidasp.G9g菌,30 ℃下發(fā)酵培養(yǎng)6～7 d。

固體發(fā)酵結(jié)束后,加入200 mL 0.02 mol/L pH5.0的HAc-NaAc緩沖液,浸泡2～3 h,用濾布過(guò)濾,5000 r/min下離心10 min除雜,將上清液用75%飽和硫酸銨2 h沉淀,12000 r/min下離心20 min取沉淀溶解于0.02 mol/L pH5.0的HAc-NaAc緩沖液中。該溶液轉(zhuǎn)入透析袋中,每隔4 h換一次透析液,充分透析24～48 h后,在4 ℃,13000 r/min下離心20 min,取上清液用0.02 mol/L pH5.0的HAc-NaAc緩沖液定容至20 mL,即為酶液。

1.2.2 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備 參照YU Hongshan等人的酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備方法[11],取20 g人參皂苷Re標(biāo)準(zhǔn)品充分溶解于500 mL、0.02 mol/L pH5.0的HAc-NaAc緩沖液中,加入500 mL上述制備好的酶液,于反應(yīng)釜中40 ℃反應(yīng)12 h。酶反應(yīng)結(jié)束后,用兩倍體積水飽和正丁醇進(jìn)行萃取,取正丁醇層,濃縮蒸干成粉末狀,即為酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品。

1.2.3 薄層層析法(TLC) 將人參皂苷溶于甲醇中,濃度為1 mg/mL,毛細(xì)管針取樣于薄層層析板下沿0.8 cm處點(diǎn)樣,將薄層層析板轉(zhuǎn)入層析缸中,于V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5的展開(kāi)劑中,展開(kāi)至距離層析板頂部2 mm左右,噴灑10%硫酸溶液顯色。

1.2.4 硅膠柱層析法 制備樣品膠[12]:取5 g酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品,用50 mL甲醇溶解,加入12.5 g、80～100目硅膠,在50 ℃水浴鍋上不斷攪拌待其完全蒸干。

在玻璃柱最底部裝入兩層脫脂棉,防止硅膠漏出,取100 g、300～400目硅膠用漏斗緩慢裝入玻璃柱內(nèi),并抽真空壓實(shí),使之均勻細(xì)密地分布在柱子內(nèi),再裝入上述制備好的樣品膠,最后在最上層放置多層脫脂棉,制備好硅膠柱層析裝置。

洗脫[13]:用四倍柱體積(14.5 L)的純氯仿通柱,然后按照V(氯仿):V(甲醇)=9.9∶0.1、9.8∶0.2、9.7∶0.3等梯度依次進(jìn)行洗脫,洗脫劑的用量為:9.9∶0.1,1 L;9.8∶0.2,2 L;9.7∶0.3,2 L;9.5∶0.5,4 L;9.4∶0.6,7 L;9.3∶0.7,9 L;9.2∶0.8,44 L。每200 mL收集一瓶,并用TLC檢測(cè)法跟蹤檢測(cè)。

1.2.5 結(jié)晶與重結(jié)晶 取2 g上述硅膠柱層析分離純化后的人參皂苷,加入50%的甲醇溶液中充分溶解,使其盡量達(dá)到溶液的飽和狀態(tài),放入7 ℃冰箱中冷卻結(jié)晶。2 d后,有無(wú)定形沉淀物析出,過(guò)濾收集沉淀物,用冷30 mL甲醇或冷水快速?zèng)_洗,冷凍干燥沉淀物。上述沉淀物,加入80%的甲醇溶液,加熱攪拌使其充分溶解,冷卻結(jié)晶。重復(fù)上述操作,重結(jié)晶三次。

1.2.6 高效液相色譜法 采用HPLC-ELSD[14]檢測(cè)人參皂苷,通過(guò)對(duì)比保留時(shí)間來(lái)確定人參皂苷的種類。

色譜條件:C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm);進(jìn)樣量:10 μL;柱溫:35 ℃;流動(dòng)相流量:1.0 mL/min;載氣:氮?dú)?氣體流速:3.2 L/min;載氣壓力:0.1 MPa;ELSD的漂移管溫度:110 ℃;撞擊器:關(guān)。

梯度洗脫條件:乙腈(A)-水(B);0～20 min,20% A;20～31 min,20%～32% A;31～40 min,32%～43% A;40～70 min,43%～100% A。

1.2.7 核磁共振法(NMR) 利用超導(dǎo)核磁共振波譜儀對(duì)單體皂苷進(jìn)行核磁共振檢測(cè)。探頭:5 mm BBO;溶劑:Pyridine-D5(氘代吡啶)。進(jìn)行包括1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY,DEPT45,DEPT90,DEPT135,HSQC,HMBC等檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)處理

酶轉(zhuǎn)化得率(%,w/w)=酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品的質(zhì)量/底物的質(zhì)量×100

硅膠柱層析產(chǎn)物得率(%,w/w)=層析后產(chǎn)物質(zhì)量/層析前樣品質(zhì)量×100

化合物純度(%)=經(jīng)HPLC檢測(cè)的化合物的峰面積/總峰面積×100

HPLC數(shù)據(jù)處理采用高效液相色譜分析儀Waters 2695和ELSD檢測(cè)器,Empower色譜工作站給出保留時(shí)間和峰積分面積等數(shù)據(jù)處理結(jié)果,進(jìn)一步采用外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備及分析

采用1.2.1方法,對(duì)Absidasp.G9g菌進(jìn)行固體發(fā)酵并提取酶液,共制備酶液500 mL。共得到13.1 g酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品,酶轉(zhuǎn)化得率為65.5%(w/w)。

酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品經(jīng)HPLC檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品(包括人參皂苷Re、Rg2、Rg4、Rg6、Rh1等)作對(duì)照,發(fā)現(xiàn)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要含有20(S,R)-Rg2和少量的Rg4和Rg6,另外還含有一種具有兩個(gè)吸收峰的未知皂苷,初步判斷為手性異構(gòu)體皂苷,暫命名為化合物1和化合物2。該未知皂苷,還需進(jìn)一步采用硅膠柱層析法、結(jié)晶及重結(jié)晶法進(jìn)行純化精制,并利用核磁共振技術(shù)對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定。

圖1 人參皂苷Re酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的HPLC

2.2硅膠柱層析法分離純化未知皂苷

按照1.2.4中的方法,用硅膠柱分離法分離該未知人參皂苷。對(duì)洗脫液進(jìn)行收集,作TLC檢測(cè),結(jié)果如圖2所示。

圖2 酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物混合品的硅膠柱層析跟蹤監(jiān)測(cè)

利用硅膠柱層析法分離純化未知皂苷,根據(jù)TLC檢測(cè)結(jié)果,分別收集較純的各組分,合并洗脫液濃縮蒸干成粉末狀,洗脫液的收集及各組分情況如表1所示。

表1 硅膠柱層析中洗脫液的合并收集

經(jīng)過(guò)硅膠柱層析法的分離純化,得到三組較純的人參皂苷。經(jīng)過(guò)與實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有皂苷及HPLC測(cè)定結(jié)果對(duì)比(由于手性化合物和順?lè)词交衔镌诒訉游鲋袩o(wú)法達(dá)到良好的分離效果,需經(jīng)HPLC檢測(cè)鑒定,參見(jiàn)圖1),確定這幾種皂苷分別是Rg4和Rg6、20(S,R)-Rg2及未知皂苷。其中未知皂苷為1.58 g,得率是31.5%(w/w)。為了檢測(cè)這三種皂苷是否完全分離,采用TLC法對(duì)表1中的各組分進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖3所示。

圖3 硅膠柱層析分離純化后各組分TLC

由圖3可以看出,幾種組分在TLC板中均為單點(diǎn)。為了進(jìn)一步檢測(cè)未知皂苷的純度,采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖4所示。

圖4 分離純化后未知皂苷的HPLC圖

由圖4可知,雖然未知皂苷在TLC上呈現(xiàn)單點(diǎn),但是在HPLC圖譜中顯示出兩個(gè)吸收峰,說(shuō)明硅膠柱層析法不能將這兩種化合物分離,需要對(duì)化合物1和化合物2進(jìn)行進(jìn)一步的精制。

2.3結(jié)晶法對(duì)化合物2進(jìn)行純化

經(jīng)結(jié)晶和重結(jié)晶后,得到未知皂苷0.33 g,得率是22%(w/w)。HPLC檢測(cè)(圖5)發(fā)現(xiàn),該未知皂苷的保留時(shí)間是44.061 min,與圖4中兩個(gè)峰的保留時(shí)間以及圖1中標(biāo)注的化合物1、2作對(duì)比,可以看出圖5中44.061 min與圖4中44.053 min極其相近,可以確認(rèn)結(jié)晶析出的未知皂苷為化合物2,純度達(dá)99.7%。

表2 化合物2的13C NMR化學(xué)位移

圖5 結(jié)晶與重結(jié)晶后未知皂苷的HPLC

2.4核磁共振法測(cè)定化合物2的結(jié)構(gòu)

為了確定化合物2的化學(xué)結(jié)構(gòu),采用核磁共振技術(shù),分別對(duì)其進(jìn)行1H NMR,13C NMR,1H-1H COSY,DEPT45,DEPT90,DEPT135,HSQC,HMBC等檢測(cè)。其13C NMR數(shù)據(jù)如表2所示:

對(duì)化合物2的13C NMR數(shù)據(jù),采用20(R)-25-OH-Rg3和20(S)-Rg2的13C NMR數(shù)據(jù)比較分析。三種化合物C-20的化學(xué)位移分別是73.3、72.7、73.43 ppm,化合物2的C-20化學(xué)位移與20(R)-25-OH-Rg3的C-20化學(xué)位移相似,說(shuō)明化合物2是R型手性異構(gòu)體。同理,三種化合物C-21、C-22、C-23、C-24、C-25、C-26、C-27的化學(xué)位移比較發(fā)現(xiàn),化合物2與20(R)-25-OH-Rg3的化學(xué)位移相似,而與20(S)-Rg2的化學(xué)位移相差甚遠(yuǎn),說(shuō)明化合物2在C-22、C-23、C-24、C-25、C-26、C-27的β-側(cè)鏈上具有與20(R)-25-OH-Rg3相同的結(jié)構(gòu),即C-24、C-25上的雙鍵消失,C-25上連接有-OH。

綜合核磁共振檢測(cè)中的1H NMR,1H-1H COSY,DEPT45,DEPT90,DEPT135,HSQC,HMBC等數(shù)據(jù),最后確定化合物2的結(jié)構(gòu)式如圖6所示,分子式為C42H74O14,相對(duì)分子質(zhì)量為803.03。該物質(zhì)的簡(jiǎn)稱為20(R)-25-OH-Rg2,學(xué)名(英文):3β,12β,20(R),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

圖6 人參皂苷20(R)-25-OH-Rg2的結(jié)構(gòu)式

雖然對(duì)化合物1未進(jìn)行核磁共振檢測(cè),但根據(jù)圖4的HPLC結(jié)果分析,推測(cè)化合物1是化合物2相對(duì)應(yīng)的手性異構(gòu)體化合物,推測(cè)化合物1是S型的25-OH-Rg2,其系統(tǒng)名稱是3β,12β,20(S),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside,化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖7所示。

圖7 人參皂苷20(S)-25-OH-Rg2的結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)論

本論文以人參中含量豐富的人參皂苷Re為底物,采用Absidasp.G9g菌固體發(fā)酵得到的酶液,進(jìn)行酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的制備,發(fā)現(xiàn)酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中主要含有20(S,R)-Rg2、少量的Rg4和Rg6,以及人參皂苷20(S,R)-25-OH-Rg2,酶轉(zhuǎn)化得率為65.5%(w/w)。酶轉(zhuǎn)化產(chǎn)物經(jīng)硅膠柱層析和結(jié)晶重結(jié)晶,純化得到了0.33 g純度達(dá)99.7%的20(R)-25-OH-Rg2,并對(duì)該化合物進(jìn)行了核磁共振檢測(cè)和分析,最終確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),系統(tǒng)命名為3β,12β,20(R),25-trihydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside。

在以人參皂苷Re為底物的酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)中,除了產(chǎn)生主要產(chǎn)物20(S,R)-Rg2外,還產(chǎn)生了一定量的Rg4、Rg6、20(S,R)-25-OH-Rg2。從這些化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)分析推測(cè),Rg4和Rg6是在催化反應(yīng)中脫水反應(yīng)產(chǎn)生的順?lè)串悩?gòu)體,而20(S,R)-25-OH-Rg2是在催化中水合反應(yīng)產(chǎn)生的手性異構(gòu)體,其催化反應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。本論文提供了酶轉(zhuǎn)化制備20(S,R)-25-OH-Rg2的方法,并鑒定出20(R)-25-OH-Rg2的化學(xué)結(jié)構(gòu),不僅豐富了人參皂苷的種類,還為其生物活性的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Purificationandidentificationof25-OH-Rg2fromginsenosidesbyenzymatictransformation

WANGYu,LIUChun-ying,YUHong-shan*

(College of Bioengineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

In order to isolation,purification and structural identifying unknown saponins of ginsenoside Re conversion products,the products were prepared by enzymatic conversion method,then separated and purified by silica gel column chromatography,crystallization and recrystallization,and identified by nuclear magnetic resonance(NMR)structure. The product of the enzyme preparation consisted of 20(S,R)-Rg2,a small amount of Rg4 and Rg6. And unknow chiral isomer saponin with a bimodal peaks of HPLC,which conversion rate was 65.5%(w/w). Using the silica gel column chromatography and the crystallization recrystallization method,obtained 0.33 g of unknown saponins with purity of 99.7%. The unknown saponins were identified as 20(R)-25-OH-Rg2 by nuclear magnetic resonanc NMR,and its systematic name was 3β,12β,20(R),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside,and another unknown saponins were indentified as 20(S)-25-OH-Rg2,the systematic name was 3β,12β,20(S),25-tetrahydroxydammar-6-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside.

ginsenoside Re;ginsenoside Rg2;20(R)-25-OH-Rg2;enzymatic conversion

2017-04-28

王宇(1992-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化，E-mail：13624985605@163.com。

*

魚(yú)紅閃(1968-)，男，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化，E-mail：hongshan@dlpu.edu.cn。

國(guó)家高端外國(guó)專家項(xiàng)目(GDT20152100019)。

TS255.1

A

1002-0306(2017)22-0026-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.006