蝦青素對秀麗隱桿線蟲衰老的改善作用及機(jī)制研究

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(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

蝦青素對秀麗隱桿線蟲衰老的改善作用及機(jī)制研究

羅婧,沈紫龍,任建武*

(北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,北京 100083)

通過壽命實驗、氧化應(yīng)激、熱應(yīng)激實驗研究蝦青素(Astaxanthin)對秀麗隱桿線蟲衰老和急性應(yīng)激效應(yīng)的改善作用并探究其作用機(jī)制。秀麗隱桿線蟲分為對照組和蝦青素處理組(0.8、1.2和1.6 mmol/L),首先研究不同濃度蝦青素對野生型線蟲壽命的影響,通過平均與最大壽命確定作用的最佳劑量;選用最佳劑量的蝦青素作用于野生型和突變株線蟲,采用熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激實驗研究其可能機(jī)制。結(jié)果表明:與對照組相比,采用1.2 mmol/L蝦青素飼喂秀麗隱桿線蟲,野生型線蟲平均壽命延長了41.79%(p<0.01),最大壽命延長了32.72%(p<0.01)。熱應(yīng)激及氧化應(yīng)激實驗中,采用1.2 mmol/L蝦青素飼喂秀麗隱桿線蟲,野生型線蟲平均生存時間分別延長了22.54%和24.23%(p<0.01)。1.2 mmol/L蝦青素可顯著提高sir-2.1突變株線蟲的存活時間,但對daf-2、daf-16和eat-2突變株線蟲均無顯著影響。綜上所述,濃度為1.2 mmol/L的蝦青素可顯著延長野生型線蟲的平均壽命和最大壽命,并顯著延長其在氧化應(yīng)激及熱應(yīng)激條件下的平均生存時間和最大生存時間。蝦青素延長線蟲壽命的功效可能是通過提高線蟲的在熱及氧化惡劣環(huán)境下的耐受能力而實現(xiàn)的,其作用機(jī)制可能與胰島素信號通路及能量限制通路有關(guān)。

蝦青素,秀麗隱桿線蟲,衰老

衰老是一種普遍存在的、復(fù)雜多變的生物學(xué)過程。伴隨衰老進(jìn)程,細(xì)胞和組織發(fā)生多種病理變化,極易引發(fā)阿爾茲海默病、帕金森病、心腦血管病等衰老相關(guān)疾病[1-2],給家庭和社會造成了巨大的負(fù)擔(dān)。我國人口老齡化趨勢逐漸加劇,各種老年性疾病問題逐漸凸顯,目前亟需開展衰老相關(guān)的研究工作,尋求抗衰老的策略。

蝦青素(Astaxanthin)是一種類胡蘿卜素,廣泛存在于蝦蟹外殼及雨生紅球藻中[3-4]。研究證實,蝦青素具有抗氧化、增強人體免疫力、抗腫瘤、防治糖尿病、抗炎、保護(hù)心腦血管、維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等多種活性功能[5-8]。目前,有關(guān)蝦青素延緩衰老的研究備受關(guān)注,蝦青素抗衰老的作用機(jī)制需進(jìn)一步明確。

因具有繁殖快、易培養(yǎng)、生命周期短、基因調(diào)控簡單、進(jìn)化高度保守等特點[9],秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)被用作一種模式生物,廣泛用于衰老、神經(jīng)發(fā)育毒性和免疫等方面的研究[10-11]。線蟲具有與哺乳動物同源的抗脅迫機(jī)制和相關(guān)基因,被廣泛應(yīng)用于抗衰老物質(zhì)的篩選和抗衰老分子機(jī)制的研究。近年來,通過遺傳篩選和自然突變等方法,人們發(fā)現(xiàn)了多種影響衰老的基因和信號傳導(dǎo)通路。胰島素信號通路(insulin/IGF-1signaling pathway)是已知的調(diào)控生物體發(fā)育和衰老最重要的信號通路,具有高度保守性[12];熱量限制(Caloric Restriction,CR)通路可通過熱量限制,穩(wěn)定地延長許多生物體壽命;飲食限制(Diet Restriction,DR)通路可導(dǎo)致線蟲長壽,研究發(fā)現(xiàn)對線蟲進(jìn)行間歇性禁食,能使線蟲壽命延長50%以上[13]?，F(xiàn)有研究大多集中于單一信號通路探索,但藥物作用于線蟲可能通過多種通路聯(lián)合作用,共同調(diào)節(jié)線蟲的生理功能。

本研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物,評價蝦青素延緩線蟲衰老的作用并進(jìn)一步采用突變株線蟲初步探討其功效的可能機(jī)制,以期為功能性食品及保健品的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

蝦青素 上海源葉生物科技有限公司;野生型(wild-type)線蟲品系N2、突變株DR1572daf-2(el368)、GR1307daf-16(mgDf50)、VC199sir-2.1(ok434)、DA1116eat-2(ad1116)、線蟲的食物大腸桿菌(EscherichiacoliOP50) 均由北京市疾病預(yù)防控制中心提供;二甲基亞砜、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、硫酸鎂、氯化鈣、膽固醇、無水乙醇、次氯酸鈉(4%)、氫氧化鈉、75%醫(yī)用消毒酒精 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;瓊脂粉、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物 BD公司;百草枯(甲基紫精)、2′-Deoxy-5-fluorouridine,Flourridine(5-氟脫氧尿苷,FuDR) 美國SIGMA公司。

H/T16MM型臺式高速離心機(jī) 湖南赫西儀器裝備有限公司;5930型高速離心機(jī) 日本三洋公司;HP250S型生化培養(yǎng)箱 武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司,Vartev Gemie2型漩渦振蕩儀 美國Vortek公司;ZWY-211B型溫培養(yǎng)振蕩儀 上海智城分析儀器制造有限公司;SZ51型體式顯微鏡 日本OLYMPUS公司;HPG-280H型人工氣候箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1 線蟲的培養(yǎng) 將雌雄同體線蟲飼養(yǎng)于涂布大腸桿菌OP50(E.coliOP50)的線蟲標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基(Nematode growth medium,NGM)上,培養(yǎng)溫度20 ℃,觀察線蟲生長情況,定期將線蟲轉(zhuǎn)至新的涂有E.coliOP50的NGM培養(yǎng)基中。

1.2.2 秀麗隱桿線蟲的同步化 Bleach液漂白法:取出處于產(chǎn)卵高峰期的線蟲NGM板,切除一小塊用于傳代(或挑取傳代),將剩余的腹內(nèi)含卵線蟲用1～2 mL的S-basal緩沖液沖洗下來,至15 mL離心管中,靜置2 min,待線蟲沉入底部,吸取上層清液,加入5～7 mL線蟲裂解液Bleach液,漩渦振蕩儀振蕩裂解5～8 min,20 ℃離心3 min(3000 r/min),用S-basal緩沖液清洗3次,最后加入3～5 mL S-basal液,放置于20 ℃恒溫?fù)u床(100 r/min)培養(yǎng)12 h,取出后可放置于15 ℃恒溫箱中保存一周的時間,便于實驗的處理以及消除個體不同差異帶來的實驗誤差。

1.2.3 線蟲壽命實驗 將蝦青素用0.2%二甲基亞砜溶液溶解,配制成8 mmol/L的貯存液,細(xì)菌過濾器過濾除菌,備用。實驗設(shè)定無蝦青素對照組和蝦青素低、中、高劑量組。將蝦青素貯存液加入到含F(xiàn)uDR(終濃度為50 mg/mL)的NGM培養(yǎng)基中(抑制線蟲后代生長,保證同步化),使其終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L,觀察在添加蝦青素的NGM培養(yǎng)基中野生型線蟲的生長發(fā)育情況,每組挑取60只young adult時期線蟲,每組3個平行,每個平行20只線蟲。每天在顯微鏡下觀察線蟲,記錄線蟲生存、死亡以及爬出培養(yǎng)皿壁自然丟失的線蟲的數(shù)目。死亡判斷標(biāo)準(zhǔn):對機(jī)械刺激無任何反應(yīng)即視為死亡。

1.2.4 急性熱應(yīng)激實驗 將線蟲進(jìn)行同步化處理后置于20 ℃培養(yǎng),每2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的含有1.2 mmol/L蝦青素的NGM板中,在成蟲期的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至35 ℃空白NGM板中進(jìn)行培養(yǎng),每2 h計數(shù)一次至全部死亡,計數(shù)線蟲死亡、存活的數(shù)目,計算線蟲在35 ℃時的熱應(yīng)激存活率(在高溫條件下,爬培養(yǎng)皿壁上和鉆入培養(yǎng)基中的線蟲不計入統(tǒng)計的總數(shù))。每組3個平行,每個平行20只線蟲。

1.2.5 急性氧化應(yīng)激實驗 將線蟲進(jìn)行同步化處理后置于20 ℃培養(yǎng),每2 d將線蟲轉(zhuǎn)移到新的含有蝦青素(終濃度1.2 mmol/L)的NGM板中。在成蟲期的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至20 ℃ 24孔板中進(jìn)行培養(yǎng),每2 h計數(shù)一次至全部死亡。24孔板中每孔加入200 μL百草枯溶液(300 mmol/L,溶解于S-media溶液),每四個孔為一組,每孔15只線蟲。統(tǒng)計線蟲在氧化應(yīng)激條件下的存活率。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

實驗均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 20.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用ANOVA分析,“*”表示p<0.05,“**”表示p<0.01，兩者均為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。平均值為具有統(tǒng)計意義的線蟲整體存活時間的平均值,最大值為抵抗脅迫能力最強的整體的10%存活時間的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1不同濃度蝦青素對野生型線蟲壽命的影響

如圖1所示,與對照組相比,采用終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L的蝦青素飼喂后,線蟲生存曲線右移,其中當(dāng)濃度為1.2 mmol/L時,蝦青素延長線蟲壽命效果最顯著。

表1 不同濃度蝦青素對線蟲壽命的影響

圖1 不同濃度蝦青素對線蟲存活率的影響

注:與對照組相比,*：p<0.05,**：p<0.01;表2、表3同。

如表1所示,對照組線蟲的平均壽命為15.7 d,最大壽命為22.0 d。采用終濃度分別為0.8、1.2和1.6 mmol/L的蝦青素飼喂后,線蟲的平均壽命和最大壽命均顯著延長(p<0.01),且當(dāng)處理濃度為1.2 mmol/L時效果最為顯著,平均壽命和最大壽命比對照組分別提高41.79%和32.72%(p<0.01)。

2.2蝦青素對野生型及突變株線蟲熱應(yīng)激耐受能力的影響

在成蟲的第5 d,將線蟲轉(zhuǎn)至35 ℃空白NGM板中培養(yǎng),飼喂蝦青素組野生型線蟲N2,sir-2.1的生存曲線明顯右移,突變株daf-2、daf-16和eat-2的生存曲線無明顯變化(圖2)。

表2 蝦青素對線蟲熱應(yīng)激生存時間的影響

圖2 蝦青素對線蟲熱應(yīng)激存活率的影響

如表2所示,對照組野生型線蟲N2的平均生存時間和最大生存時間分別為20.0 h和25.3 h。與對照組相比,飼喂1.2 mmol/L蝦青素均能顯著延長線蟲的平均生存時間和最大生存時間,平均生存時間和最大生存時間分別提高了22.54%和23.68%(p<0.01)。蝦青素能夠提高sir-2.1的平均生存時間(p<0.05),但并不能提高突變株daf-2、daf-16和eat-2的生存時間,表明蝦青素提高線蟲的耐熱能力與daf-2、daf-16和eat-2基因有關(guān)。

2.3蝦青素對野生型及突變株線蟲氧化應(yīng)激耐受能力的影響

在成蟲的第5 d,將線蟲置于百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下,飼喂蝦青素組野生型線蟲N2、sir-2.1的生存曲線明顯右移,突變株daf-2、daf-16和eat-2生存曲線無明顯變化(圖3)。

圖3 蝦青素對線蟲氧化應(yīng)激存活率的影響

如表3所示,在百草枯誘導(dǎo)的氧化脅迫條件下,飼喂1.2 mmol/L蝦青素能顯著延長野生型線蟲N2的平均生存時間和最大生存時間,平均生存時間比對照組提高24.23%(p<0.01),最大生存時間比對照組提高31.25%(p<0.01),且提高sir-2.1的生存時間(p<0.01),但并不能提高突變株daf-2、daf-16、eat-2的生存時間,這說明蝦青素的抗氧化能力與daf-2、daf-16、eat-2基因有關(guān)。由此可見,在氧化應(yīng)激脅迫條件下蝦青素能夠很好地保護(hù)秀麗隱桿線蟲,緩解極端氧化應(yīng)激對線蟲的損傷。

表3 蝦青素對突變株線蟲氧化應(yīng)激生存時間的影響

3 討論與結(jié)論

生命周期與機(jī)體對外界的抵抗脅迫能力有關(guān)[14]。已有研究表明,線蟲壽命與其抗脅迫能力水平有關(guān)[15],有文獻(xiàn)報道,淫羊藿總黃酮、原花青素B2、蜜環(huán)菌菌索多糖等能夠延長秀麗線蟲壽命,其作用機(jī)制可能與其增強線蟲應(yīng)激能力有關(guān)[16-18]。本實驗發(fā)現(xiàn)蝦青素能顯著提高野生型線蟲的熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激能力,其壽命的延長可能通過提高抗脅迫能力來實現(xiàn)。

胰島素信號通路是機(jī)體重要的調(diào)控通路之一,對發(fā)育、代謝、衰老的調(diào)節(jié)均起到關(guān)鍵作用。研究表明:Daf-2與胞外類似胰島素配體結(jié)合后導(dǎo)致PI3K催化亞基同源物AGE-1活化,后者產(chǎn)生第二信使進(jìn)一步激活下游AKT/PKB同源物絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT-1/AKT-2,磷酸化轉(zhuǎn)錄因子Daf-16,從而抑制其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能[19]。Daf-16可以影響代謝調(diào)節(jié)、抗脅迫基因的表達(dá),進(jìn)而延長壽命[20]。蝦青素對daf-2、daf-16突變體應(yīng)激能力的改變無顯著差異,表明其可能通過調(diào)節(jié)由daf-2、daf-16等基因參與的胰島素信號通路來發(fā)揮作用。保持營養(yǎng)充足的情況下,減少能量攝入能延長生物體壽命,這是目前能夠確定的延長生物體壽命的理論,這一理論在線蟲模型中得到充分體現(xiàn)。因神經(jīng)活肌肉受損而進(jìn)食缺陷的突變體(eat-2)可以充分驗證蝦青素通過eat-2基因,能量限制通路起作用,而與熱量限制無關(guān)(sir-2.1)。

本實驗結(jié)果表明,一定濃度范圍內(nèi)蝦青素可以延緩線蟲衰老,添加濃度為1.2 mmol/L時效果最為顯著,平均壽命提高41.79%,并能提高線蟲的熱應(yīng)激能力22.54%及氧化應(yīng)激能力24.23%。蝦青素可能通過提高線蟲在熱及氧化應(yīng)激條件下的耐受性來延長線蟲壽命,其作用機(jī)制可能與胰島素信號通路和能量限制通路有關(guān)。

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TheagingimprovementeffectsandmechanismofastaxanthinonCaenorhabditiselegans

LUOJing,SHENZi-long,RENJian-wu*

(College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

In this study,the mechanism of the aging improvement of astaxanthin onCaenorhabditiseleganswas studied by lifespan extension analysis,oxidative stress,and heat stress analyses. Astaxanthin-treated groups(0.8,1.2,and 1.6 mmol/L)were compared to the control group to explore the anti-aging effect of different concentrations in wild-type nematode and identify the optimal dose according to mean and maximum lifespan extension. The optimal dose of astaxanthin was 1.2 mmol/L,at which dose astaxanthin prolonged mean lifespan of wild type nematode by 41.79%(p<0.01)and increased maximum lifespan by 32.72%(p<0.01).The possible mechanisms of astaxanthin’s aging effects were further studied using the 1.2 mmol/L treatment to test its impact on resistance to heat and oxidative stress. The mean survival times of astaxanthin-treated wild type nematode after oxidative and heat stress were increased by 22.54% and 24.23%(p<0.01),respectively. In oxidative stress and heat stress experiments,1.2 mmol/L astaxanthin could significantly increase the survival time of thesir-2.1 mutant nematodes,but had no significant effect ondaf-2,daf-16,oreat-2 mutants. The above results suggested that astaxanthin can prolong the lifespan of nematodes by increasing stress tolerance and its mechanism may be related to the insulin signaling and diet-restriction pathways.

astaxanthin;Caenorhabditiselegans;aging

2017-04-25

羅婧(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：18813072633@163.com。

*

任建武(1967-)，男，博士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，E-mail：jianwur@sina.com。

TS201.1

A

1002-0306(2017)22-0022-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.005