水貂冠狀病毒中國(guó)分離株全基因序列測(cè)定及分析

王楷宬,莊青葉,邱 源,侯廣宇

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

水貂冠狀病毒中國(guó)分離株全基因序列測(cè)定及分析

王楷宬,莊青葉,邱 源,侯廣宇

(中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心,山東青島 266032)

為分析水貂冠狀病毒中國(guó)分離株的遺傳特征,采用高通量測(cè)序方法測(cè)定從山東省青島市某養(yǎng)殖場(chǎng)分離的水貂冠狀病毒基因組,首次報(bào)道了水貂冠狀病毒中國(guó)分離株的全基因序列,并對(duì)其進(jìn)行特性分析與比較基因組研究.結(jié)果顯示:該病毒全基因組大小為 28 924 bp,具有與其他冠狀病毒相似的基因組結(jié)構(gòu)和基因順序;5′端具有帽子結(jié)構(gòu),3′端具有poly(A)尾.該分離株與19株代表性毒株的全基因組和N基因進(jìn)化和同源性分析都證實(shí),該分離株與美國(guó)分離株的同源性較高,與其余2株水貂冠狀病毒和2株雪貂冠狀病毒同屬于冠狀病毒的一個(gè)新種.

水貂冠狀病毒;中國(guó)分離株;基因組分析;高通量測(cè)序

由冠狀病毒感染引起的水貂腹瀉是除水貂細(xì)小病毒性腸炎外導(dǎo)致水貂腹瀉的又一重要病毒性傳染病,又稱水貂流行性卡他性胃腸炎[1].病貂表現(xiàn)為:食欲不振、嘔吐、精神萎靡、口渴、腹瀉,排灰白色、綠色乃至粉黃色黏液狀稀便,有的排黑紅色、沒有明顯套管樣稀便;鼻鏡干燥,被毛欠光澤,消瘦,皮膚缺乏彈性;體溫一般不高.腹瀉嚴(yán)重的病貂,往往因脫水而發(fā)生自體中毒而死.該病最早流行于美國(guó)猶他州[1].1987年我國(guó)從北美進(jìn)口種貂時(shí)帶入本病[2].

冠狀病毒是1968年由一位叫泰瑞的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)的,因其形態(tài)在電子顯微鏡下,外膜呈日冕狀或皇冠狀而得名[3].冠狀病毒粒子較大,形態(tài)多樣,有囊膜;基因組為線狀、單股、正鏈RNA分子;囊膜上鑲嵌著許多一端較粗的膜粒(Peplomer),形成王冠狀結(jié)構(gòu).每個(gè)膜粒由一個(gè)大的三聚體糖蛋白組成.該蛋白稱為纖突蛋白(Spike)或S蛋白.S蛋白能夠與宿主細(xì)胞受體結(jié)合,并介導(dǎo)病毒和宿主細(xì)胞的融合,也是自然感染過程中誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體的主要抗原成分.S蛋白中有些表位變異較快,可促使病毒逃避宿主的獲得性免疫反應(yīng)[3].

水貂冠狀病毒的體外分離培養(yǎng)較為困難.有研究者曾試用10多種細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng),最后用貂肺細(xì)胞(ML)才獲得成功[4].我國(guó)雖有水貂冠狀病毒分離或鑒定的報(bào)道,但迄今尚未發(fā)表該病毒中國(guó)分離株的完整基因序列.為揭示水貂冠狀病毒中國(guó)分離株的全基因序列特性,采用高通量測(cè)序方法,測(cè)定自山東省青島市某養(yǎng)殖場(chǎng)分離的水貂冠狀病毒基因組序列,并對(duì)其進(jìn)行特性分析與比較基因組研究.

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

Ion PGM Template OT2 400 Kit、Ion PGM Sequencing 400 Kit V2、E-Gel SizeSelect 2%Agarose、Ion 316 Chip Kit V2、Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Beads、Qubit核酸濃度測(cè)定儀及配套試劑(Life technologies公司);超凈工作臺(tái)(美國(guó)Forma Scientific);移液器(Eppendorf);孵化器(德州誠(chéng)信孵化設(shè)備有限公司);高速臺(tái)式離心機(jī)(德國(guó)Heraeus Biofuge primoR);PCR擴(kuò)增儀(Perkin Elmeter Gen Amp PCR System 9600).高性能計(jì)算平臺(tái):Dell T630塔式服務(wù)器,具有2顆Intel(R)Xeon(R)CPU E5-2620 v3 @2.40GHz,內(nèi)存264 G,存儲(chǔ)23 T,操作系統(tǒng)版本CentOS Linux release 7.1.1503(Core).

1.2 核酸提取

自山東省青島市某養(yǎng)貂場(chǎng)2016年春季采集的糞便樣品中,檢測(cè)到水貂冠狀病毒(Mink/China/1/2016)[5].將該份樣品充分混勻后,經(jīng)高速離心和過濾,去除大分子物質(zhì)和細(xì)菌,使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen,德國(guó))提取病毒核酸.

1.3 高通量測(cè)序(NGS)文庫(kù)構(gòu)建

對(duì)提取的病毒核酸,采用本中心已建立的方法[5]進(jìn)行NGS文庫(kù)構(gòu)建.具體方法為:在8 μL病毒RNA中,加入1 μL 100 μmol/L引物A15N6和2 μL無核酸酶的水進(jìn)行混合,72 ℃ 5 min后,將RNA引物混合物放在冰上孵育至少3 min;在混合物中加入 4 μL 5Xfirst-strand buffer、1 μL dNTP(100 μmol/L)、2 μL DTT(0.1 mol/L)、1 μL RNaseOUT? Recombinant Ribonuclease Inhibitor(40 U/μL) 和 1 μL SuperScript? III Reverse Transcriptase (200 U/μL) (Invitrogen,USA),25 ℃反應(yīng) 15 min,42 ℃反應(yīng) 30 min,70 ℃ 15 min,終止反應(yīng);在反應(yīng)產(chǎn)物中再加入1 μL RNase H(TaKaRa,Japan),37 ℃反應(yīng)20 min;采用DynaMag ? -2 Magnet 和 Agencourt? AMPure? XP Reagent(Beckman Coulter,USA)純化合成第一鏈cDNA;在純化的第一鏈cDNA中,加入引物B15N6,70 ℃ 5 min,再加入1 μL Klenow fragment (5 U) (NEB,USA),5 μL 10XNEBuffer 2、2 μL dNTP(100 μmol/L) 和 1 μL DTT(0.1 mol/L),37 ℃ 反應(yīng)30 min;最后采用1XPhusion High-Fidelity Buffer,10 μmol/L 引 物 A30和 B30( 表1),0.5 U Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(NEB,USA),進(jìn)行PCR擴(kuò)增.將PCR產(chǎn)物,采用E-Gel? SizeSelect? Agarose Gel進(jìn)行電泳,篩選和回收約450 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物,將其作為NGS文庫(kù).

表1 引物與引物序列

1.4 NGS測(cè)序

將NGS文庫(kù)稀釋為2.6X1011mol/L,應(yīng)用Ion PGM Template OT2 400 Kit,對(duì)DNA文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序前的樣品處理.將處理后的樣品加樣至Ion 316芯片,置于PGM測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序.

1.5 測(cè)序數(shù)據(jù)分析

對(duì)NGS測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后,采用CLC genomics workbench 8.5.1(Qiagen,Germany),將測(cè)序得到的reads,參考GenBank中已發(fā)表的水貂冠狀病毒W(wǎng)D1133全基因序列[6](GenBank登錄號(hào)為HM245926)進(jìn)行mapping 拼接,并分析拼接完成的基因組中的ORF;將注釋后的序列提交GenBank.

1.6 基因組特性分析

采用MEGA 6.0[7]將Mink/China/1/2016的全基因與N基因,分別與GenBank中冠狀病毒科的代表毒株(表2)全基因與N基因進(jìn)行比對(duì)和進(jìn)化分析,并對(duì)這些毒株的全基因進(jìn)行同源性分析.

表2 基因分析所使用的冠狀病毒毒株

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組解析

芯片上樣率為73%.測(cè)序文庫(kù)得到質(zhì)量較高的測(cè)序數(shù)據(jù).CLC genomics workbench 8.5.1拼接得到水貂冠狀病毒中國(guó)分離株的全基因大小為28 924 bp,GenBank登錄號(hào)為 MF113046.Mink/China/1/2016基因組具有與其他冠狀病毒相似的結(jié)構(gòu)和基因順序:5′端具有帽子結(jié)構(gòu),3′端具有A尾;基因組(圖1)中主要包含ORF1a/1b、纖突蛋白(Spike protein,S)、3c、囊膜蛋白(Envelope protein,E)、膜蛋白(Membrane protein,M)、核衣殼蛋白(Nucleocapsid protein,N),以及其他附屬編碼非結(jié)構(gòu)蛋白的基因(ORF7a、3x和7b);ORF1a和ORF1b相互重疊42 bp,其長(zhǎng)度分別是12 030和8 034 bp;在ORF1a～ORF1b重疊區(qū)域(12 262～12 304)形成一個(gè)基因三級(jí)結(jié)構(gòu),可由其引起核糖體閱讀框移位;與其他冠狀病毒相似,核糖體移動(dòng)的滑動(dòng)位點(diǎn)為UUUAAAC;在非轉(zhuǎn)錄酶基因(3x和7b 除外)的上游均具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列(CTAAAC),其是不間斷合成亞基因組RNA所必須的.

圖1 Mink/China/1/2016基因組結(jié)構(gòu)

2.2 基因組比較

Mink/China/1/2016與19株代表性毒株(表2)的全基因組進(jìn)化分析結(jié)果見圖2,保守基因(N基因)的進(jìn)化分析見圖3,各毒株之間的全基因同源性分析見圖4.分析結(jié)果顯示,Mink/China/1/2016與已報(bào)道全基因的2株水貂冠狀病毒(WD1127和WD1133)親緣關(guān)系最近,基因組同源性分別為92.7%和93.8%,且此3株病毒在全基因和N基因的進(jìn)化樹中都?xì)w為一簇,并與2株雪貂冠狀病毒(NL-2010和4370-7)明顯歸為一個(gè)與Alphacoronavirus 1并列的小分支.按照之前的報(bào)道[6],將此分支暫時(shí)命名為Alphacoronavirus 2(尚未被病毒分類委員會(huì)認(rèn)可).在全基因和N基因的進(jìn)化樹中,各病毒的進(jìn)化關(guān)系相似.

圖2 冠狀病毒全基因進(jìn)化分析

3 討論

我國(guó)水貂養(yǎng)殖業(yè)始于1956年.有報(bào)道稱,2005年全國(guó)約有水貂飼養(yǎng)場(chǎng)戶5 000 多家,種貂存欄250萬只,年產(chǎn)水貂皮800萬張[8].近幾年,我國(guó)水貂飼養(yǎng)數(shù)量迅速增長(zhǎng),已經(jīng)成為世界上較大的毛皮生產(chǎn)國(guó)和成品出口國(guó).水貂消化道疾病往往導(dǎo)致水貂死亡或皮毛品質(zhì)下降,造成較大經(jīng)濟(jì)損失.

圖3 冠狀病毒全基因進(jìn)化分析

圖4 Mink/China/1/2016 與冠狀病毒代表毒株的同源性分析

我國(guó)對(duì)水貂疫病的研究較少,主要針對(duì)犬瘟熱病毒、水貂細(xì)小病毒和新城疫病毒感染等[9-10].而對(duì)水貂冠狀病毒,尤其是該病毒的分子生物學(xué)特性研究較少.

Anastasia等[6]于2011年首次報(bào)道了2株分離自美國(guó)的水貂冠狀病毒全基因序列,之后再無其他水貂冠狀病毒全基因的報(bào)道.我國(guó)早在20世紀(jì)80年代就發(fā)生了由水貂冠狀病毒引起的水貂流行性卡他性胃腸炎,但一直未對(duì)水貂冠狀病毒流行毒株的分子生物學(xué)特性進(jìn)行研究.本研究采用高通量測(cè)序方法,解析1株分離自青島市的水貂冠狀病毒(Mink/China/1/2016)全基因.此屬該病毒中國(guó)分離株基因組的首次報(bào)道,也是世界上第3個(gè)該病毒全基因的報(bào)道.

對(duì)Mink/China/1/2016的全基因分析發(fā)現(xiàn),該病毒基因組與2011年報(bào)道的2株美國(guó)分離株基因組極為相似,同源性分別達(dá)92.7%和93.8%,但由于3株毒株基因組中,有一些與ORF翻譯起始和終止位點(diǎn)發(fā)生了變化,同一ORF在3株毒株中的大小存在差異,其翻譯的蛋白大小也隨之發(fā)生了改變.此變化是否會(huì)引起病毒致病力的改變有待進(jìn)一步解析.我國(guó)分離株與美國(guó)分離株差異不大.這也可能與該病原由北美進(jìn)口種貂帶入有關(guān).N基因是冠狀病毒保守的結(jié)構(gòu)蛋白.本研究選用此基因進(jìn)行進(jìn)化分析,經(jīng)與文獻(xiàn)報(bào)道[6]對(duì)比分析發(fā)現(xiàn),該毒株Mink/China/1/2016與其余2株水貂冠狀病毒和2株雪貂冠狀病毒同屬于冠狀病毒的一個(gè)新種(Alphacoronavirus 2).本分析結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了Anastasia等[6]的研究結(jié)論,為此新種的認(rèn)可增加了科學(xué)依據(jù).

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[2]韓慧民,劉維全,楊盛華,等. 水貂冠狀病毒性腸炎研究初報(bào)[J]. 獸醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),1988,8(2):169.

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(責(zé)任編輯:朱迪國(guó))

Whole Genome Sequencing and Analysis on Mink Coronavirus Isolated from China

Wang Kaicheng,Zhuang Qingye,Qiu Yuan,Hou Guangyu
(China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong 266032)

To analyze the genetic characteristics of Mink coronavirus isolated from China,the genome of Mink coronavirus isolated from a farm of Qingdao city was determined by high throughput sequencing. The full-length genome sequence of the Mink coronavirus Chinese isolate was reported for the first time. The genomic sequence of the isolate was analyzed and compared with reference coronavirus. The results showed that the full-length of the isolate was 28 924 bp,which possessed genomic structure and gene order similar to the reference coronaviruses. The 5' end had a hat structure,and the 3' end had poly(A)tail. The genome and N gene evolution and homology analysis between the isolate and other 19 representative strains showed that the isolate had a high homology with the American isolate,and was a new species belonging to the coronavirus with the other 2 Mink coronaviruses and 2 ferret coronaviruses.

Mink coronavirus;Chinese isolates;genome analysis;high-throughput sequencing

S851.3

B

1005-944X(2017)12-0088-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.025

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFC1200500);中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心創(chuàng)新基金(2015IF-0004FF)