奶牛肺外結核病的綜合診斷與病原分離鑒定

許 芳,田莉莉,齊亞銀,孫世雄,孫翔翔,剡根強,曾巧英,范偉興

(1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266114;2. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院,甘肅蘭州 730070;3. 石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832003)

奶牛肺外結核病的綜合診斷與病原分離鑒定

許 芳1,2,田莉莉1,齊亞銀3,孫世雄1,孫翔翔1,剡根強3,曾巧英2,范偉興1

(1. 中國動物衛(wèi)生與流行病學中心,山東青島 266114;2. 甘肅農業(yè)大學動物醫(yī)學院,甘肅蘭州 730070;3. 石河子大學動物科技學院,新疆石河子 832003)

為揭示牛型提純結核菌素(PPD)檢測陽性牛與剖檢肺臟病變不吻合的真實原因,綜合運用皮內變態(tài)反應(SIT)、比較變態(tài)反應(SICCT)、IFN-γ試驗,以及牛型PPD點眼反應、ELISA抗體檢測等5種免疫學方法,對我國西部5個奶牛場進行牛結核病綜合診斷,然后對鎖定的后期感染牛進行撲殺、剖檢,采集病料進行病理學和病原學診斷.結果顯示:用5種方法綜合檢測確診的95頭后期感染牛中,有84頭(88.42%)剖檢可見明顯結核病變,其中12頭(14.29%)的病變發(fā)生在肺和肺門淋巴結,72頭(85.71%)的病變發(fā)生在肝、脾、腸系膜淋巴結等肺外組織器官;95頭后期感染牛中,有54頭病料培養(yǎng)陽性;陽性菌經(jīng)Xpert MTB/RIF和Enigma鑒定,均為牛分枝桿菌.該研究結果表明:我國牛結核病存在肺結核和肺外結核兩種,因而增加了牛結核病的診治難度;牛結核病確診僅靠單一檢測方法十分困難,需運用多種免疫學方法進行綜合診斷;該結果可以解釋目前出現(xiàn)的檢測陽性與肺部剖檢病變結果不一致的困惑.

牛結核病;綜合診斷;病原學診斷;肺外結核

牛結核病主要由牛分枝桿菌引起,經(jīng)呼吸道傳播[1-4],表現(xiàn)為肺及其附屬淋巴結核,以組織器官形成結核結節(jié)性肉芽腫和干酪樣壞死或鈣化結節(jié)為特征[5-7].我國現(xiàn)行牛結核病診斷方法包括牛型提純結核菌素(Purified protein derivative,PPD)皮內變態(tài)反應(Single intradermal tuberculin,SIT)和新增設的IFN-γ試驗.長期以來,我國牛場一直采用SIT方法,對牛群進行牛結核病檢疫.但近年來獸醫(yī)人員和養(yǎng)殖業(yè)者在牛結核病檢疫過程中很少見到SIT檢出的PPD陽性牛肺臟病變.這種檢疫結果與肺部剖檢病變不一致的現(xiàn)象,使獸醫(yī)人員和養(yǎng)殖業(yè)者產(chǎn)生了很大困惑,甚至出現(xiàn)了對陽性牛撲殺執(zhí)行難的問題.

2007年以來在全國30個省(直轄市、自治區(qū))開展的牛結核病定點流行病學調查結果也證實,很少在SIT陽性剖檢牛的肺臟和胸腔內找到結核病變.10年來,我們對各地用SIT方法檢出的1 665頭陽性奶牛,用IFN-γ試驗進行復核,然后對復核陽性的460頭牛進行撲殺剖檢,發(fā)現(xiàn)僅有7頭有肺臟結核病變(其中從4頭牛的病料中分離到牛分枝桿菌).這顯示SIT檢出的PPD陽性牛與剖檢病變符合率很低.為了進一步核實PPD陽性牛與剖檢病變的相關性和符合率,揭示PPD陽性牛與剖檢肺臟病變不吻合的真實原因,本文綜合運用SIT、比較變態(tài)反應(Single intradermal comparative cervical tuberculin,SICCT)、IFN-γ試驗,以及牛型PPD點眼反應、ELISA抗體檢測等5種免疫學診斷方法,對我國西部5個奶牛場進行了牛結核病檢測,然后鎖定后期感染牛,對其撲殺、剖檢,采集病料,從免疫學、病理學和病原學方面進行牛結核病確切診斷.

1 材料與方法

1.1 試劑和培養(yǎng)基

牛型PPD(批號155205a)、禽型PPD(批號150605)、BOVIGAM?牛結核分枝桿菌γ-干擾素ELISA檢測試劑盒(批號6332000801):購自瑞士Prionics公司;牛分枝桿菌抗體檢測試劑盒(批號GM500):購自美國IDEXX公司.DifcoTMLowenstein Medium Base( 批 號5271900)、DifcoTMMycobacteria 7H11 Agar(批號2003747)、DifcoTMMiddlebrook 7H9 Broth(批號5173939)培養(yǎng)基:購自美國BD公司.

1.2 主要儀器

McLintock?結核菌素皮試連續(xù)注射器:購自英 國 Bar Knight McLintock公 司;Tecan Infinite?F50酶標儀:購自瑞士Tecan公司.

1.3 試驗牛場背景

試驗場為我國西部3省的5個規(guī)模奶牛場.這些牛場每年應用SIT檢測牛結核病.歷年陽性檢出率在5%～10%之間.歷年觀察和剖檢證明:所有檢出的陽性奶牛臨床無咳嗽、呼吸困難等呼吸道癥狀;很少在肺臟和胸腔發(fā)現(xiàn)結核病變.

1.4 綜合檢測策略

對5個奶牛場綜合運用5種方法進行檢測.用進口結核菌素開展SIT、SICCT、點眼反應,用IFN-γ試驗復核,再以牛結核病ELISA抗體檢測及牛副結核病ELISA抗體檢測作為補充試驗(圖1).

圖1 奶牛場牛結核病綜合檢測策略

1.4.1 SIT. 操作方法和判定標準按國標(GB/T 18645-2002)執(zhí)行.

1.4.2 SICCT.在牛只頸部兩側上1/3處剪毛,測量皮皺厚度,分別皮內注射0.1 mL(含3 000 IU)牛型PPD和0.1 mL(含2 500 IU)禽型PPD,72 h后觀察并測量皮皺厚度,判定結果.

1.4.3 IFN-γ試驗.采集牛全血;對抗凝血用牛型PPD、禽型PPD、PBS(陰性對照)3種刺激抗原進行體外刺激;全血培養(yǎng)16～24 h,收獲血漿,用ELISA檢測各抗原刺激產(chǎn)生的IFN-γ水平.

1.4.4 牛型PPD點眼反應.對牛眼部進行術前檢查后,用1%硼酸棉球擦凈眼部外圍的污物,以左手食指與拇指使瞬膜與下眼瞼形成凹窩,右手持點眼器,滴入2～3滴牛型PPD(30 000 IU/mL,約0.2～0.3 mL),間隔3～5 d后再滴1次.點眼后,于3、6、9 h各觀察1次,必要時可觀察24 h反應.

1.4.5 ELISA抗體檢測.對牛血清50倍稀釋后,加100 μL至抗原包被板,18～26 ℃孵育1 h,洗滌后加100 μL酶標抗體,孵育30 min后洗滌,加100 μL TMB避光孵育15 min,終止后在酶標儀450 nm濾光片處讀值.

1.5 剖檢和病理組織學診斷

剖檢后期感染牛,系統(tǒng)檢查并無菌采集不同組織器官病料,固定后常規(guī)石蠟切片,HE和Ziehl-Neelsen抗酸染色,鏡檢.

1.6 病原分離鑒定

無菌采集肺、肝、脾、淋巴結等病變組織器官進行細菌分離培養(yǎng);將組織樣品處理后接種于丙酮酸鈉、L-J、7H11、7H9培養(yǎng)基,37 ℃溫濕培養(yǎng)4～8周,待菌落生長后提取核酸進行Xpert MTB/RIF和Enigma分子鑒定.

2 結果

2.1 5種方法聯(lián)合檢測

將早期(SIT/SICCT/IFN-γ試驗)和后期(牛型PPD點眼反應/ELISA抗體檢測)綜合判定均為陽性的牛鎖定為后期感染牛.5個牛場共計檢測3 367頭牛.經(jīng)5種方法綜合檢測鎖定后期感染牛194頭,剖檢95頭.5個奶牛場的5種方法檢測結果見表1.

表1 5個奶牛場5種方法檢測結果

2.2 病理學診斷

95頭后期感染牛中84頭牛(88.42%)剖檢可見有明顯結核病變,其中12頭(14.29%)在肺和肺門淋巴結,72頭(85.71%)在肝、脾、腸系膜淋巴結等肺外組織器官(表2);剩余的11頭牛未發(fā)現(xiàn)明顯眼觀病變.對約600份后期感染牛不同組織器官病料進行切片染色.HE染色顯示,剖檢牛呈早、中、后期不同階段結核病理變化.Ziehl-Neelsen抗酸染色顯示,在15頭剖檢牛的肺、肝、淋巴結等壞死灶中心處,可見紅染桿菌.病理學診斷結果另文發(fā)表[8].

表2 5個牛場剖檢牛病變及病料分離培養(yǎng)情況

2.3 病原分離鑒定

對5個牛場95頭后期感染牛的195份病料進行分離培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)54頭牛病料培養(yǎng)陽性,陽性率為56.84%(表2).對培養(yǎng)陽性菌進行Xpert MTB/RIF和Enigma鑒定,發(fā)現(xiàn)均為牛分枝桿菌(圖2).

圖2 Xpert MTB/RIF和Enigma檢測結果示例

3 討論

SICCT是英國、加拿大、美國、澳大利亞和新西蘭等國家常采用的牛結核病診斷方法[9-11].牛型PPD點眼反應曾經(jīng)是牛結核檢疫規(guī)程中的常用方法之一.ELISA方法是較為成熟的血清學診斷方法,可檢測牛血清中的牛分枝桿菌抗體.在牛結核病早期感染階段,細胞免疫占主導地位.SIT、SICCT、IFN-γ試驗均是利用分枝桿菌抗原刺激的記憶型T細胞應答進行早期感染診斷的方法.在牛結核病后期感染階段,體液免疫開始上升.PPD點眼反應和ELISA檢測抗體則是針對后期感染的診斷方法.曾在我國牛結核病檢疫規(guī)程中使用的PPD點眼反應在牛場檢疫中也取得了良好效果.

20世紀50年代前后,由于我國奶牛結核病的情況不同,同一檢疫方法對不同牛群的檢出率也有高有低.多年來的病牛剖檢資料和各地實踐結果證明,對感染程度較高、病程較久、病變較陳舊的牛群,點眼反應的檢出率一般較SIT要高[12].對比較清凈、結核病歷史較短,以及新感染的牛群,則SIT的檢出率較點眼要高.這說明點眼反應的檢出水平與結核病變的陳舊程度有著密切關系.而在比較清凈的牛群中,SIT檢出的結核牛多為處于潛伏期內或新感染的結核病牛.這似乎與結核病變的新鮮檢疫一致[12].該病復雜的發(fā)病機制導致不同病程對應的主要免疫方式也不同.因此,對不同階段的牛結核病,只有應用對應的診斷方法,才更易檢出感染牛.牛結核病的準確診斷,僅靠單一檢測方法十分困難,需運用5種免疫學方法進行綜合檢測.本研究應用SIT、SICCT、IFN-γ試驗,以及PPD點眼反應、ELISA抗體檢測5種方法進行綜合檢測,可提高牛結核病診斷的準確性,排除非特異性陽性牛,且適用于不同流行狀況地區(qū)或場區(qū)的牛結核病控制和凈化.牛場可靈活運用綜合檢測方案,因場施策,分步實施,逐步凈化.而且,運用綜合檢測方法,可最大限度地檢出感染牛,減少漏檢,且易檢出有病變的牛,提高檢測陽性與剖檢病變的符合率.

針對PPD陽性牛與肺臟剖檢病變不一致的原因,長期以來占主導性的觀點認為牛結核是一種以潛伏性感染為主的慢性傳染病.我國感染?；鶖?shù)大,被撲殺的大部分?？赡芴幱跐摲腥净蛏形串a(chǎn)生肉眼可見病變階段[13].因此多數(shù)皮試陽性動物的肺臟和胸腔中找不出結節(jié)樣病灶或分離不出菌株[14].但事實是,我國現(xiàn)行PPD檢疫陽性牛的處置方法是不剖檢而直接進行無害化處理,即使剖檢也往往僅檢查肺和胸腔而非進行系統(tǒng)檢查,因此缺乏對PPD陽性牛開展系統(tǒng)剖檢和病理組織學診斷的機會.這就使上述觀點長期以來一直停留在猜測階段,而未得到PPD陽性與剖檢、病原學之間的相互認證.針對上述主觀觀點,本研究運用5種方法綜合檢測,確定后期感染牛,并對其進行剖檢,以及病理學和病原學診斷,證明88.42%的PPD陽性牛不是檢查不到肉眼可見結核病變,而是這些病變主要分布在肺外組織器官,表現(xiàn)為肺外結核.該研究結果可以解釋獸醫(yī)人員和養(yǎng)殖業(yè)者對檢測結果與剖檢病變不一致的困惑.這種情況可能在我國其他規(guī)模奶牛場也存在.當然,尚需同行們開展更多工作來驗證上述結論.

查閱國內外文獻,并沒有找到有關奶牛肺外結核的報道.而人的肺外結核在國內外均有大量報道.研究表明人肺外結核是由反復吞咽含結核分枝桿菌痰液或食用帶菌牛奶和乳制品引起的[15-16].因此,牛肺外結核也可能是由于犢牛飲用被牛分枝桿菌污染的牛乳或飼草料而感染,最有可能的傳播途徑為消化道和糞口傳播.這提示我們在牛結核病的防控中必須注重牛奶的巴氏滅菌消毒和防止飼草料被結核菌污染.這一問題也對現(xiàn)代規(guī)?；膛龅慕Y核病防控提出了新的挑戰(zhàn)和課題,應引起相關主管部門、業(yè)務部門和養(yǎng)殖業(yè)者的關注.

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(責任編輯:朱迪國)

Integrated Immunological Diagnosis of Extrapulmonary Tuberculosis for Dairy Cows Combining with Pathogenic Isolation and Identification

Xu Fang1,2,Tian Lili1,Qi Yayin3,Sun Shixiong1,Sun Xiangxiang1,Yan Genqiang3,Zeng Qiaoying2,Fan Weixing1
(1. China Animal Health and Epidemiology Center,Qingdao,Shandong 266114;2. College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou,Gansu 730070;3. College of Animal Science and Technology,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003)

In order to reveal the true reason why there was inconsistence between PPD positive cattle and their autopsy lesions in lungs,5 kinds of bovine tuberculosis immunological diagnosis methods,including SIT,SICCT,IFN-γ test,bovine PPD eye-drops reaction and ELISA antibody detection,were adopted to carry out a synthetic detection towards 5 dairy farms of western China. Then the infected cows at late stage were locked,killed and necropsied,the pathological samples were collected for pathological and etiological diagnosis. Based on the results,among the 95 positive cows that were locked through five detection methods,84 cows(88.42%)were found to have obvious tuberculosis lesions,lesions of 12 cows(14.29%)were in lung and hilar lymph nodes,lesions of the rest 72 cows(85.71%)were found in extrapulmonary tissues and organs,such as liver,spleen and mesenteric lymph nodes,etc.Pathological samples of 54 cows were cultured positive among the 95 cows,and all the positive bacteria were identified as Mycobacterium bovis by Xpert MTB/RIF and Enigma. The results suggested that it was more difficult to diagnose and prevent bovine tuberculosis because pulmonary tuberculosis and extrapulmonary tuberculosis were both present in China. It was very difficult to use single detection method for diagnosis of bovine tuberculosis,so using integrated immunological diagnosis were essential. And the results also could explain the confusion that the positive detection results were inconsistent with their lung lesions at necropy.

bovine tuberculosis;integrated diagnosis;etiological diagnosis;extrapulmonary tuberculosis

S855.2

A

1005-944X(2017)12-0001-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.12.001

甘肅農業(yè)大學伏羲杰出人才項目;現(xiàn)代農業(yè)(奶牛)產(chǎn)業(yè)技術體系建設項目(CARS-36)

曾巧英、范偉興