培養(yǎng)工程化軟骨的新方法

雷忱+陳國杰+王彪

摘要：目的 探索組織工程室用于體內(nèi)培養(yǎng)大體積工程化軟骨的可行性。方法 取成年雄性新西蘭大白兔10只，分別于耳部切取0.2 ml軟骨切碎植入于背部同期構(gòu)建的組織工程室內(nèi)，1個月時，進行取材。結(jié)果 1個月時，組織工程室內(nèi)構(gòu)建物基本充滿工程室，軟骨組織平均體積（1.869±0.187）ml，較原始體積增大約（543.4±71.3）%。組織形態(tài)學(xué)觀察：新生軟骨區(qū)域明顯，其中含有大量細(xì)胞外基質(zhì)及軟骨細(xì)胞，部分軟骨細(xì)胞形態(tài)已較成熟。結(jié)論 組織工程室作為培養(yǎng)大體積工程化軟骨的新方法可行，效果顯著。

關(guān)鍵詞：小耳畸形；組織工程軟骨；軸心血管；組織工程室

中圖分類號：R318 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1959（2017）23-0028-03

A New Method of Cultivating Engineering Cartilage

LEI Chen，CHEN Guo-jie，WANG Biao

（Department of Plastic Surgery，the First Affiliated Hospital，F(xiàn)ujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005，F(xiàn)ujian，China）

Abstract：Objective To explore the feasibility of tissue engineering room for in vivo culture of large volume engineering cartilage.Methods 10 adult male New Zealand white rabbits were cut into 0.2 ml cartilage and cut into the tissue engineering room at the same time.The specimens were harvested at 1 month.Results At 1 month，the indoor building full of tissue engineering cartilage tissue engineering chamber，the average volume （1.869±0.187）ml，compared with the original volume increased by about（543.4±71.3）%.Observe morphology：new cartilage region is obvious，which contains large amounts of extracellular matrix and cartilage cells form part of cartilage cells is mature.Conclusion Tissue engineering room is a new method to cultivate large volume of engineered cartilage，and the effect is remarkable.

Key words：Microtia；Tissue engineering cartilage；Axial vessel；Tissue engineering room

世界小耳癥發(fā)病率約9/10000。目前常見的小耳再造術(shù)式是以Nageta及firmin為代表的直埋法[1-5]。以及Park[6]、張慶國[7]為代表的擴張法。但兩種方法均是以自體肋軟骨移植為基礎(chǔ)的術(shù)式。隨之帶來3～6根肋軟骨的缺損、供區(qū)胸壁瘢痕的形成，組織類型為透明軟骨，彈性差；甚至為了取得足量用于移植的軟骨，不得已將手術(shù)年齡推遲至10歲左右。單純的支架植入在出現(xiàn)皮瓣壞死后難以解決支架外露的問題。而目前利用細(xì)胞培養(yǎng)復(fù)合支架的方法雖然已取得初步成效。但存在傳代過程中去分化、轉(zhuǎn)移至體內(nèi)后宿主排斥反應(yīng)等缺點。

組織工程室是基于Hofer[8]等人在2003年發(fā)表的原始模型，利用在體的血管的動靜脈環(huán)吻接（AVL），并將吻接環(huán)置入有一定硬度的惰性容器中，發(fā)現(xiàn)沿血管軸心生長的肉芽組織填滿了惰性容器。Morrison[9-10]等在此基礎(chǔ)上更進一步，利用了含AVL的血管化組織工程室模型，成功的誘導(dǎo)了心肌細(xì)胞的再生。而尚未有實驗將組織工程室技術(shù)應(yīng)用于軟骨組織的培養(yǎng)。因此，本實驗試圖通過將組織工程室技術(shù)應(yīng)用于軟骨組織培養(yǎng)，驗證此法可行性，為進一步臨床探索奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實驗動物

取成年雄性新西蘭大白兔10只，每只體重約2.0～2.2 kg（福建醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供）。實驗動物均為SPF級，層流室內(nèi)飼養(yǎng)。

1.2組織工程室準(zhǔn)備

取邊長2 cm×2 cm×1 cm長方體方體型硅膠模具，并于各側(cè)壁打孔，間隔0.5 cm。完成后高壓消毒備用。

1.3組織工程室模型構(gòu)建方法

手術(shù)前1 d，兔背部、耳部備毛。手術(shù)當(dāng)天，使用10%水合醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，在兔耳取約3 cm手術(shù)切口，分離至耳軟骨表面，切取約1.5 cm長梭型耳軟骨（約0.1 ml），切碎備用。背部正中取5 cm手術(shù)切口，切開至皮下，分離兩側(cè)肩胛骨上脂肪瓣，裸化其供血軸心血管。將裸化血管植入預(yù)先高壓消毒的工程室中，調(diào)整位置后絲線固定于兔背部。最后將剪碎耳軟骨由側(cè)壁孔洞均勻鋪入組織工程室內(nèi)。關(guān)閉皮膚創(chuàng)面。

1.4形態(tài)學(xué)及免疫組化染色

于1個月時完整切取組織工程室內(nèi)工程化組織，保存于多聚甲醛固定24 h，然后石蠟包埋切片，行蘇木素-伊紅（HE）染色及馬松三色染色。endprint

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

計量資料以（x±s）表示，應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，組間比較采用隨機資料單因素方差分析，以P<0.05為差異學(xué)有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1組織工程軟骨的大體觀察

新西蘭大白兔對手術(shù)操作耐受良好，1個月時取材，麻醉后由原切口入路，可見組織工程室表面覆蓋包膜，打開包膜后見大量滲出液，肉芽組織基本充滿組織工程室，除去組織工程室后可見原軸心血管保留完好，軟組織塊表面血管化良好。連帶軸心血管將軟組織塊游離，仔細(xì)剝離軟組織塊表面組織，可見內(nèi)部軟骨樣組織，并形成接近正方形塊狀結(jié)構(gòu)，剖開后可見光滑質(zhì)韌軟骨樣組織（見圖1B）。工程化軟骨體積及其在軟骨質(zhì)塊中體積比統(tǒng)計見圖2B。1個月時，軟骨組織平均體積（1.869±0.187）ml，較原始體積增大約（543.4±71.3）%。在軟骨樣組織周圍，可見較多纖維肉芽組織增生，包裹軟骨組織。

2.2組織形態(tài)學(xué)觀察

1個月時，HE顯示原有軟骨組織邊界較為清晰，界限內(nèi)軟骨組織形態(tài)基本良好，部分軟骨細(xì)胞略肥大，偶見少量鈣化。而在軟骨組織間隙中，存在新生軟骨細(xì)胞區(qū)域（見圖3），其中軟骨細(xì)胞形態(tài)良好，部分已出現(xiàn)成熟軟骨細(xì)胞形態(tài)（圖3黑色箭頭示）未見明顯軟骨細(xì)胞肥大及鈣化，且在細(xì)胞周圍可見大量細(xì)胞外基質(zhì)（圖3白色箭頭示）。并且，新生軟骨細(xì)胞呈現(xiàn)出越靠近原有軟骨，組織形態(tài)越加成熟的趨勢，提示原有軟骨在組織工程室環(huán)境下被誘導(dǎo)再生的可能性。

3 討論

利用殘耳軟骨是目前耳再造中既避免繼發(fā)缺損，又能獲得彈性軟骨的重要手段。但殘耳軟骨體積有限，要求較高的體外擴增倍數(shù)。而體外培養(yǎng)后的去分化現(xiàn)象卻限制了通過傳代獲得大量軟骨細(xì)胞及組織的方法。雖然從健側(cè)切取耳軟骨能一定程度上彌補基礎(chǔ)軟骨量的不足。但實現(xiàn)更大倍數(shù)的體積擴增才是解決問題的根本手段。本實驗中已經(jīng)誘導(dǎo)原有軟骨體積在1個月內(nèi)增大了5倍以上，并且這種再生很可能來源于原有軟骨。雖然增大的體積還未達到可供臨床使用的體積，在先前的報道中，組織工程室技術(shù)已經(jīng)成功誘導(dǎo)出比原始體積增大15倍的脂肪組織[11]?？紤]一方面和實驗動物本身體積相關(guān)，另一方面考慮培養(yǎng)時間較短，在一項肋軟骨的臨床長期觀察中發(fā)現(xiàn)，軟骨的重塑過程可持續(xù)長達10個月[12-13]。同時，取材時工程化軟骨組織基本位于工程室底部，考慮如能使軟骨碎塊在工程室內(nèi)更加均勻地分布，有望更加均勻地誘導(dǎo)軟骨組織地再生。同有報道通過加入自體富血小板血漿（PRP）作為自體支架培養(yǎng)軟骨，并已取得良好的效果，但此法同樣需要通過酶消化法獲得單個軟骨細(xì)胞，并進行體外培養(yǎng)及傳代，無法保證外源性添加試劑的安全性。而組織工程室中早期亦可添加PRP使植入軟骨分布在空間上更加均勻，下一步的實驗將在這一方向上繼續(xù)改進，進一步擴大組織工程軟骨擴增倍數(shù)。并繼續(xù)探索組織工程室誘導(dǎo)軟骨體積增大的相關(guān)機制。

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