基于SSR的刺槐無性系遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建*

毛秀紅 鄭勇奇 孫百友 張?jiān)獛?韓叢聰 位 曉 荀守華

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)局森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 2. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院 山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250014； 3. 山東費(fèi)縣大青山林場 費(fèi)縣 273402； 4. 勝利油田勝大集團(tuán) 東營 257083)

基于SSR的刺槐無性系遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建*

毛秀紅1,2鄭勇奇1孫百友3張?jiān)獛?韓叢聰2位 曉4荀守華2

(1. 中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國家林業(yè)局森林培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 2. 山東省林業(yè)科學(xué)研究院 山東省林木遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 濟(jì)南 250014； 3. 山東費(fèi)縣大青山林場 費(fèi)縣 273402； 4. 勝利油田勝大集團(tuán) 東營 257083)

【目的】 對山東省刺槐無性系進(jìn)行遺傳多樣性分析和指紋圖譜構(gòu)建，為刺槐新品種選育、遺傳改良和品種鑒定提供可靠的依據(jù)，為中國其他省市刺槐遺傳資源保存、評價(jià)與利用提供參考?！痉椒ā?采用熒光SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行檢測； 利用所得結(jié)果分析49個(gè)無性系遺傳多樣性并構(gòu)建其指紋圖譜； 采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行基于親緣關(guān)系的無性系聚類分析。【結(jié)果】 8對SSR引物共檢測到51個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因?yàn)?～15個(gè)，平均每對引物擴(kuò)增出6.375個(gè)多態(tài)性等位基因。不同位點(diǎn)的PIC值變化范圍很大，在0.092～0.879之間，平均PIC值為0.509 8。使用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進(jìn)行UPGMA聚類分析，結(jié)果表明49份無性系沒有嚴(yán)格按照不同區(qū)域聚類到一起，無性系分組與現(xiàn)有栽培區(qū)沒有明顯的規(guī)律。來自臨沂的‘魯刺8’和‘魯刺13’、青島的‘魯刺40’和‘魯刺42’以及日照的‘魯刺10’和‘魯刺86’親緣關(guān)系最近。本研究所使用的9對引物中，其中2對Rply109和rops16可以區(qū)分開45份無性系，鑒定率達(dá)到91.84%。檢測到22個(gè)刺槐無性系在1個(gè)或者2個(gè)位點(diǎn)得到3個(gè)等位基因，表明這些無性系可能是發(fā)生自然變異的多倍體?！窘Y(jié)論】 山東省刺槐具有較高的遺傳多樣性。無性系分組與現(xiàn)有栽培區(qū)沒有明顯的規(guī)律。引物Rply109和rops16對49份無性系的分子鑒定率為91.84%，可作為刺槐指紋圖譜構(gòu)建和分子鑒定的高效分子標(biāo)記。利用SSR標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜可為刺槐遺傳資源管理、品種鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)為刺槐的引種和遺傳育種親本選擇提供科學(xué)的理論依據(jù)。

刺槐； SSR； 分子標(biāo)記； 遺傳多樣性； 指紋圖譜； 聚類分析

刺槐(Robiniapseudoacacia)為豆科(Leguminosae)刺槐屬(Robinia)闊葉大喬木(2n=22)，原產(chǎn)美國，速生、抗旱、耐瘠薄、耐輕度鹽堿，適宜多種土壤和氣候條件，具有很高的觀賞、材用、生態(tài)防護(hù)、蜜源和飼用價(jià)值。1601年被引入法國，至18世紀(jì)遍布?xì)W洲各國(Keresztesi, 1980)； 1897年由德國人引入中國青島(陳一山等， 2005)，這是據(jù)文獻(xiàn)記載最早引入中國的刺槐遺傳資源。此后的100年里，又有來自美國、朝鮮等刺槐遺傳資源引入山東省(顧萬春等， 1991)，部分優(yōu)樹無性系現(xiàn)在收集保存在山東省費(fèi)縣大青山林場刺槐種質(zhì)資源庫。山東在中國引種刺槐歷史最早，栽培也很廣泛，但是各地栽培的刺槐來源記載不清，遺傳關(guān)系不明，遺傳多樣性狀況信息甚少，急需開展刺槐遺傳多樣性評價(jià)，為刺槐新品種選育或者遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

植物遺傳多樣性的研究方法主要有形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生理生化標(biāo)記以及分子標(biāo)記4大類，它們分別從宏觀和微觀角度，以及個(gè)體、細(xì)胞和分子3個(gè)水平為植物的遺傳多樣性研究提供有價(jià)值的信息。前人在刺槐形態(tài)性狀(Keresztesi， 1980； 李善文等， 1997)、蛋白(Surlesetal.， 1989； Majoretal.， 1998； 楊敏生等， 2004)和分子(Majoretal.， 1998； Bindiyaetal.， 2003； 韓宏偉， 2007； 孫芳等， 2009； 王東升等， 2012)3個(gè)不同水平上分別做了相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)刺槐變異類型很多，遺傳多樣性豐富。相對于顯性標(biāo)記，SSR是共顯性標(biāo)記，具有多態(tài)性高、穩(wěn)定性高、分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，被視為是檢測植物遺傳多樣性和遺傳分化的最有效標(biāo)記(Ellegren， 2004)，在國內(nèi)被廣泛應(yīng)用于植物遺傳多樣性評價(jià)或品種鑒定(馮錦霞等， 2011； 李美芹等， 2016； Sunetal.， 2016)。SSR分子標(biāo)記也已經(jīng)被應(yīng)用于紅花刺槐(R.pseudoacaciavar.decaisneana)和香花槐(R.pseudoacacia‘Idaho’)的品種鑒定(方志達(dá)， 2006)、航天誘變刺槐群體遺傳多樣性分析(袁存權(quán)等， 2010)。趙克奇等(2014)進(jìn)行了刺槐EST-SSR標(biāo)記PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化，為以后應(yīng)用于刺槐遺傳多樣性評價(jià)奠定了很好的基礎(chǔ)。因此，應(yīng)用SSR分子標(biāo)記分析山東省刺槐無性系遺傳多樣性和構(gòu)建指紋圖譜，有助于了解我國刺槐多樣性分布，鑒別無性系和制定雜交育種策略等。

本研究采用SSR分子標(biāo)記對來自膠東半島(青島、威海、煙臺)、魯南(臨沂、日照)、魯中(濟(jì)南、泰安、萊蕪、淄博、濰坊)、魯西南(濟(jì)寧、菏澤、棗莊)和魯西北(德州、濱州、聊城、東營)5個(gè)不同刺槐栽培區(qū)的49份刺槐無性系進(jìn)行遺傳多樣性評價(jià)和指紋圖譜構(gòu)建，以期為刺槐新品種選育、遺傳改良和品種鑒定提供可靠的依據(jù)，為中國其他省市刺槐遺傳資源保存、評價(jià)與利用提供參考。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料和采樣地點(diǎn)

試驗(yàn)材料為1973—2014年山東省不同地市從刺槐實(shí)生群體中篩選出的49株優(yōu)樹(表1)，通過嫁接保存到山東省禹城市刺槐屬植物種質(zhì)資源庫和山東省費(fèi)縣大青山林場刺槐種子園。從以上2個(gè)地點(diǎn)采集幼嫩葉片，硅膠干燥，備用。

1.2DNA提取與熒光引物PCR擴(kuò)增

所有無性系的葉片DNA均采用英芮誠生化科技(上海)有限公司植物組織基因組DNA提取試劑盒(磁珠法)(貨號PTED-6030)按照說明書進(jìn)行提取，并采用多功能酶標(biāo)儀(Spectra Max i3，上海)檢測所提DNA濃度和OD260/OD280值，檢測結(jié)果在1.6～1.9之間的-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 刺槐樣品信息①Tab.1 Sampling information of Robinia pseudoacacia

①GB1: 山東省禹城市刺槐屬植物種質(zhì)資源基因庫； GB2: 山東省費(fèi)縣大青山林場。GB1: Germplasm gene bank ofR.pseudoacaciain Yucheng city, Shandong province; GB2: Daqingshan Forest Farm in Feixian, Shandong province.

根據(jù)文獻(xiàn)收集到的刺槐SSR引物，選取9對用于本研究(趙克奇等， 2014； Lianetal.， 2004)。引物由北京市睿博興科生物技術(shù)有限公司合成，純化方式PAGE。引物的編號、重復(fù)單元、引物序列、片段長度、退火溫度以及所用熒光見表2。

熒光引物PCR擴(kuò)增體系： 2×Taq PCR MasterMix由北京市睿博興科生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。PCR選用10 μL體系： DNA(20 ng·μL-1)0.5 μL，滅菌去離子水4.3 μL，2×Taq PCR MasterMix 5 μL，正反引物各0.1 μL。

熒光引物PCR擴(kuò)增程序采用Touchdown模式： 95 ℃預(yù)變性5 min； 95 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s(每個(gè)循環(huán)降低0.5 ℃)，72 ℃延伸40 s，14個(gè)循環(huán)； 95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s， 20個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。

表2 本研究所用9對SSR引物信息Tab.2 9 pairs of SSR primers used in this study

1.3毛細(xì)管電泳上機(jī)檢測

用毛細(xì)管電泳儀ABI 3730XL檢測PCR產(chǎn)物等位基因數(shù)目。取PCR產(chǎn)物各0.3 μL、分子量內(nèi)標(biāo)(生產(chǎn)商ABI)0.5 μL和去離子甲酰胺(生產(chǎn)商ABI)9.5 μL混合加入PCR板，95 ℃變性5 min，4 ℃冷卻后離心，1×Buffer緩沖液上機(jī)檢測?；蚍治鰞x生產(chǎn)廠家是ABI公司，型號3730xl DNA analyzer，所用參數(shù)如下： 工作電壓15.0 kV，進(jìn)樣電壓1.6 kV，噴射持續(xù)時(shí)間15 s，穩(wěn)壓電流30.0 μA。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用Genemarker 2.2.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析； 用GenALEx軟件(Peakalletal., 2012)計(jì)算平均等位基因數(shù)Na、有效等位基因數(shù)Ne和Shannon信息指數(shù)I； 用CERVUS version 3.0(Kalinowskietal.， 2007)計(jì)算多態(tài)性信息量PIC。

使用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進(jìn)行聚類分析，得到山東省49份無性系的UPGMA親緣關(guān)系圖。

1.5指紋圖譜構(gòu)建與無性系鑒定

根據(jù)每對SSR引物的帶型結(jié)果，組合形成每個(gè)無性系的SSR指紋圖譜，根據(jù)指紋圖譜的差異，再區(qū)分無性系。

2 結(jié)果與分析

2.1刺槐遺傳多樣性分析

9個(gè)SSR位點(diǎn)中有1個(gè)在個(gè)別樣品中得不到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(GenAlEx軟件不識別)，故采用8個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算。在49個(gè)樣本中共擴(kuò)增出51個(gè)等位基因，每個(gè)位點(diǎn)的等位基因數(shù)為2～15個(gè)，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出6.375個(gè)等位基因，最多的rops16有15個(gè)等位基因，Rply109次之，有10個(gè)等位基因，最少的是Rply31，只有2個(gè)等位基因(圖1)。不同位點(diǎn)的PIC值變化范圍很大，在0.092～0.879之間，平均PIC值為0.509 8(表3)。根據(jù)Botstein(1980)的理論，有1個(gè)標(biāo)記為低度多態(tài)位點(diǎn)(PIClt;0.25)，3個(gè)標(biāo)記為中度多態(tài)位點(diǎn)(0.25lt;PIClt;0.5)，其他4個(gè)為高度多態(tài)位點(diǎn)(PICgt;0.5)。以上遺傳多樣性參數(shù)表明山東省49份刺槐無性系具有較高的遺傳多樣性。

圖1 部分刺槐無性系在Rply31位點(diǎn)的等位基因變異Fig.1 Allelic phenotype of Robinia pseudoacacia clones at Rply31 locus

引物L(fēng)ocus樣本量N等位基因數(shù)Na有效等位基因數(shù)NeShannon信息指數(shù)I多態(tài)信息指數(shù)PICRply1094910000483117800767Rply22494000150306770314Rply16498000180410410430Rply01494000241210060505Rply02495000333213170649rops164915000932424250879Rply31492000110702020092Rply32493000219608570442均值Mean4963753314116305098

①N: Number of samples;Na: Number of alleles;Ne: Effective number of alleles;I: Shannon’s information index; PIC: Polymorphic information content.

2.2不同來源地刺槐無性系之間遺傳關(guān)系

使用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法對山東省49份刺槐無性系進(jìn)行聚類分析，得到的親緣關(guān)系如圖2所示。來自臨沂的4號(‘魯刺8’)和8號(‘魯刺13’)、來自青島的14號(‘魯刺40’)和15號(‘魯刺42’)以及來自日照的6號(‘魯刺10’)和40號(‘魯刺86’)親緣關(guān)系最近，最先聚在一起，說明它們遺傳基礎(chǔ)相近，可能來自同一種源。全部無性系聚為2大類： 第Ⅰ類共有5份，包含了沿海地區(qū)青島1份(36號)、日照3份(6、40和27號)和濰坊1份(47號)； 第Ⅱ類共有44份，占89.80%，包含的無性系非常豐富，涵蓋的區(qū)域廣。第Ⅱ類又可以分為3個(gè)亞類： Ⅱ-a共有6份，分別是魯西南2份(19號和21號)、魯南2份(32號和28號)和魯中2份(31號和22號)； Ⅱ-b共有33份，包含膠東半島13份(煙臺的3號、威海的38號和青島的1、37、13、34、45、44、12、2、35、15、14號)、魯西北3份(東營的24和23號以及德州的46號)、魯南9份(日照的25號和臨沂的4、8、18、49、5、7、33、39號)、魯西南4份(菏澤的29號、濟(jì)寧的41號和棗莊的16、43號)和魯中4份(10、11、20和48號)； Ⅱ-c共有5份，包含魯南2份(26號和9號)、魯西南2份(17號和42號)和青島1份(30號)。由上可以看出這49份無性系聚類結(jié)果與地理區(qū)域并不完全相符，無性系分組與現(xiàn)有栽培區(qū)沒有明顯的規(guī)律，說明來自相同地區(qū)的刺槐無性系之間遺傳差異較大。這與王東升等(2012)使用AFLP標(biāo)記分析得出的結(jié)論“山東省刺槐無性系的聚類與地理位置不完全相關(guān)”一致。

圖2 基于SSR數(shù)據(jù)的49份刺槐無性系UPGMA聚類分析Fig.2 Dendrogram of 49 accessions Robinia pseudoacacia germplasms based on SSR data using UPGMA method樣品編號詳細(xì)信息見表1。See Tab.1 for sample number details.

2.3指紋圖譜構(gòu)建與品種鑒定

利用毛細(xì)管電泳檢測熒光PCR產(chǎn)物，共獲得49個(gè)無性系9個(gè)SSR位點(diǎn)的DNA指紋圖譜(表4)。所有無性系都不具有特征譜帶，無法僅用1對引物將某個(gè)無性系與其他無性系區(qū)分開，因此需要利用引物組合進(jìn)行區(qū)分。所使用的9對引物中，其中2對Rply109和rops16除了區(qū)分不開‘魯刺62’和‘魯刺90’、‘魯刺57’和‘魯刺103’這4份無性系外，可以區(qū)分開其他45份無性系，鑒定率達(dá)到91.84%，而其他7對引物，也不能將以上4份無性系區(qū)分開，因此后續(xù)研究需要開發(fā)更有效的SSR引物或采用更多的引物對。

另外，本研究使用9對SSR引物對49份無性系進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)‘魯刺2’、‘魯刺10’、‘魯刺14’、‘魯刺28’、‘魯刺36’、‘魯刺38’、‘魯刺40’、‘魯刺47’、‘魯刺57’、‘魯刺61’、‘魯刺62’、‘魯刺68’、‘魯刺84’、‘魯刺87’、‘魯刺90’、‘魯刺102’、‘魯刺103’、‘魯刺155’、‘膠29’、‘魯刺229’、‘壯美青山’和‘青山紐姿’共22份無性系在1個(gè)位點(diǎn)有3個(gè)等位基因，尤其是其中的‘魯刺28’(圖3)、‘魯刺40’和‘魯刺87’這3份無性系在2個(gè)位點(diǎn)均得到3個(gè)等位基因(表4)，表明這22份無性系可能是自然變異的多倍體。

表4 49份刺槐無性系的指紋圖譜①Tab.4 Fingerprint map of 49 clones of Robinia pseudoacacia bp

①無性系編號同表1； *表示缺失值。Codes of clones see Tab.1； *means the missing value.

圖3 ‘魯刺28’在rops16和Rply43位點(diǎn)的等位基因變異Fig.3 Allelic phenotype of Robinia pseudoacacia ‘Luci 28’ at rops16 and Rply31 locus

3 討論

每個(gè)位點(diǎn)上等位基因的數(shù)目是最直接度量遺傳多樣性豐富度的參數(shù)之一(徐剛標(biāo)， 2009)。袁存權(quán)等(2010)利用篩選到的8對多態(tài)性好、條帶清晰的SSR引物對刺槐航天誘變和地面對照共計(jì)48個(gè)植株組成的群體進(jìn)行SSR分析，平均每個(gè)位點(diǎn)擴(kuò)增出3.125個(gè)等位基因。本研究也是利用8對SSR引物對49個(gè)刺槐樣本分析得到了每個(gè)位點(diǎn)上等位基因的數(shù)目2～15個(gè)，平均數(shù)目是6.375個(gè)，是袁存權(quán)等(2010)所得的等位基因數(shù)目2.04倍。分析原因可能有2個(gè)： 一是所用的引物不完全一樣，引物的多態(tài)性不一樣； 二是所用刺槐材料不同，袁存權(quán)等(2010)所用材料是來自河南林場的2 000粒刺槐種子，其中1 000粒進(jìn)行航天誘變，另1 000粒作對照，播種育苗后共取48個(gè)植株進(jìn)行SSR檢測，各材料親緣關(guān)系較近。另外洪丕征(2011)利用9對AFLP引物得到所有位點(diǎn)的等位基因數(shù)目平均為1.551 4。本研究得到的等位基因數(shù)目明顯高于洪丕征(2011)的研究結(jié)果，主要是由所用的分子標(biāo)記不同和所分析的刺槐材料不同導(dǎo)致的。

據(jù)Keresztesi(1980)記載，刺槐在美國的天然分布區(qū)分為2部分： 東部分布區(qū)從賓夕法尼亞州中部延伸到亞拉巴馬和佐治亞州北部的阿帕拉契安山脈，其中包括西弗吉尼亞州的一部分、弗吉尼亞、馬里蘭德、肯塔基、田納西和南、北卡羅來納州，在佐治亞州中部的南俄亥俄和印第安納西南部也有刺槐分布； 西部分布區(qū)包括密蘇里南部的奧扎克高原，阿爾堪薩斯與東奧克拉荷馬的北部和東部，在伊利諾斯南部和印第安納西南部也有零星分布。本研究發(fā)現(xiàn)49份無性系聚為2大類(圖2)，推測這2大類無性系有可能分別來自2個(gè)不同的區(qū)域，即美國的東部分布區(qū)和西部分布區(qū)。

在構(gòu)建指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)使用9對引物區(qū)分不開‘魯刺62’和‘魯刺90’、‘魯刺57’和‘魯刺103’這4份無性系，后來作者所在實(shí)驗(yàn)室又利用新開發(fā)的9對引物依然區(qū)分不開這4份無性系，推測它們可能是同物異名。查看親緣關(guān)系圖(圖2)發(fā)現(xiàn)，這4份無性系均在第2大類中的a類出現(xiàn)，且‘魯刺62’(21號)和‘魯刺90’(28號)、‘魯刺57’(19號)和‘魯刺103’(31號)親緣關(guān)系最近，分別最先聚在一起。查閱這4份無性系檔案材料，發(fā)現(xiàn)‘魯刺62’來自棗莊滕縣，‘魯刺90’來自臨沂費(fèi)縣； ‘魯刺57’來自菏澤曹縣，‘魯刺103’來自淄博沂源縣，是山東省不同地市在引種過程中從種子實(shí)生苗中選育出的速生抗逆優(yōu)株。這一證據(jù)排除了不同地市間互相引種造成的“同物異名”。具體是否是同物異名，后期應(yīng)該加大引物使用對數(shù)，進(jìn)一步做SSR檢測，并結(jié)合表型性狀才能下定論。但是不論它們是否是同物異名，鑒于親緣關(guān)系太近，在選擇雜交親本時(shí)最好避免同時(shí)用作父母本。

韓國輝(2012)在利用EST-SSR對柑橘(Citrusreticulata)多倍體進(jìn)行遺傳分析后，認(rèn)為SSR分子標(biāo)記可以作為不同倍性植株染色體倍性確認(rèn)的一個(gè)參考； 賈會霞等(2015)在對24份楊樹無性系進(jìn)行SSR指紋圖譜構(gòu)建時(shí)發(fā)現(xiàn)，5份無性系均擴(kuò)增出3個(gè)不同等位基因，其余19份只出現(xiàn)1個(gè)或2個(gè)等位基因，F(xiàn)CM檢測結(jié)果證實(shí)這5份無性系均為三倍體，因此認(rèn)為SSR標(biāo)記能夠準(zhǔn)確地反映植物的倍性。本研究檢測到‘魯刺2’、‘魯刺10’等22份無性系在1個(gè)位點(diǎn)或者2個(gè)位點(diǎn)有3個(gè)等位基因，說明這些無性系可能是多倍體。北京林業(yè)大學(xué)1997年從韓國引入我國的飼料型四倍體刺槐K1-K5，是由人工誘導(dǎo)二倍體刺槐體細(xì)胞加倍而育成。目前國內(nèi)外尚沒有其他發(fā)現(xiàn)或者培育四倍體刺槐的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期對這5個(gè)四倍體刺槐無性系K1-K5也做了上述9對引物的SSR分析，發(fā)現(xiàn)4個(gè)無性系K1-K4只在rops16位點(diǎn)出現(xiàn)3個(gè)等位基因，K5除在Rply43位點(diǎn)出現(xiàn)缺失外，其余8個(gè)位點(diǎn)各出現(xiàn)1個(gè)或者2個(gè)等位基因。后來本實(shí)驗(yàn)室又利用新開發(fā)的9對EST-SSR引物進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)K5在RP7和RP13兩個(gè)位點(diǎn)分別有3個(gè)和4個(gè)等位基因。本研究從分子水平驗(yàn)證了K1-K5是多倍體。同時(shí)韓國人對K1-K5做的核型分析結(jié)果從染色體水平驗(yàn)證了這5個(gè)無性系確實(shí)是多倍體(Kim， 1973)。

本研究檢測到49份無性系中‘魯刺2’、‘魯刺10’等共22份可能是發(fā)生自然變異的多倍體。隨后經(jīng)過查閱大青山林場提供的林木種質(zhì)資源共性描述表，發(fā)現(xiàn)除了‘青山紐姿’外，其余21份無性系均具有典型的多倍體植株形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，如高產(chǎn)(速生)、優(yōu)質(zhì)和抗逆。具體確認(rèn)這22個(gè)無性系是幾倍體，需要進(jìn)一步做核型分析，觀察染色體組成，才能下定論。

4 結(jié)論

山東省刺槐具有較高的遺傳多樣性，無性系分組與現(xiàn)有栽培區(qū)沒有明顯的規(guī)律； 引物Rply109和rops16對49份無性系的分子鑒定率為91.84%，可作為指紋圖譜構(gòu)建、分子鑒定的高效分子標(biāo)記； 利用SSR標(biāo)記構(gòu)建的指紋圖譜可為刺槐遺傳資源管理、品種鑒定和知識產(chǎn)權(quán)保護(hù)奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為刺槐的引種和遺傳育種選擇親本提供科學(xué)的理論依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

GeneticDiversityandFingerprintsofRobiniapseudoacaciaClonesBasedonSSRMarkers

Mao Xiuhong1, 2Zheng Yongqi1Sun Baiyou3Zhang Yuanshuai3Han Congcong2Wei Xiao4Xun Shouhua2

(1.StateKeyLaboratoryofTreeGeneticsandBreedingKeyLaboratoryofTreeBreedingandCultivationoftheStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestry，ChineseAcademyofForestryBeijing100091; 2.ShandongProvincialKeyLaboratoryofForestTreeGeneticImprovementShandongAcademyofForestryJinan250014; 3.DaqingshanForestFarm,Feixian,ShandongFeixian273402; 4.ShengliOilfieldShengdaGroup,ShandongDongying257083)

【Objective】To analyze genetic diversity and to construct the fingerprints ofRobiniapseudoacaciaclones selected in Shandong province, which can lay a solid foundation forR.pseudoacacianew varieties selection, breeding and identification, and also provide a scientific basis for the conservation, assessment and utilization ofR.pseudoacaciain other provinces of China.【Method】Fluorescent SSR primers were used for PCR amplification. The products were detected with capillary electrophoresis. The results were used to analyze genetic diversity and to construct fingerprints of 49R.pseudoacaciaclones. 【Result】A total of 51 alleles were identified using 8 pairs of SSR primers, with a mean of 6.375 alleles per locus, ranging from 2-15. The mean value of PIC was 0.509 8, ranging from 0.092-0.879. Clustering analysis conducted with the method of average linkage between groups showed that clones ‘Luci 8’ and ‘Luci 13’ from Linyi, ‘Luci 40’ and ‘Luci 42’ from Qingdao, ‘Luci 10’ and ‘Luci 86’ from Rizhao displayed the closest genetic relationship, respectively. The 49 clones were not clustered together strictly in accordance with geographic areas. There were no obvious correlations between grouping and current growing regions of the clones. A total of 9 primer pairs were used for clonal identification, two of them namely Rply109 and rops16 can distinguish 45 clones, indicating an identification rate of 91.84%. Three alleles at one or two loci were detected in 22 clones, suggesting that these clones may be natural polyploidies.【Conclusion】R.pseudoacaciain Shandong province has relatively high genetic diversity. There were not obvious correlations between grouping and current growing regions of the clones. The two primers Rply109 and rops16 were determined to be efficient SSR markers for fingerprints construction and molecular identification ofR.pseudoacaciaclones, which can distinguish a proportion of 91.84% of the total number of clones. The fingerprints constructed with SSR markers can provide a basis for germplasm resources management, variety identification and intellectual property rights protection, it also provides a scientific basis for introduction, genetic improvement and breeding ofR.pseudoacacia.

Robiniapseudoacacia； SSR； molecular marker； genetic diversity； fingerprint； cluster analysis

10.11707/j.1001-7488.20171009

2017-03-14；

2017-07-20。

國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)“刺槐屬種質(zhì)資源收集保存與創(chuàng)新利用研究”(201304116)。

*荀守華為通訊作者。

S718.46； S718.49

A

1001-7488(2017)10-0080-10