奶山羊miRNA-451表達(dá)譜分析及靶基因初步鑒定

郭文嬌 李轉(zhuǎn)見 張博文 藍(lán)賢勇 雷初朝 陳宏*

(1，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 712100;2，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 450000)

奶山羊miRNA-451表達(dá)譜分析及靶基因初步鑒定

郭文嬌1李轉(zhuǎn)見2張博文1藍(lán)賢勇1雷初朝1陳宏1*

(1，西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 712100;2，河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院 450000)

基于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用高通量測(cè)序得到的奶山羊泌乳峰期和干奶期乳腺組織中小RNA結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、基因克隆、重組腺病毒以及細(xì)胞培養(yǎng)等技術(shù)并結(jié)合生物信息學(xué)的方法，對(duì)miRNA-451的表達(dá)譜及其靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)與驗(yàn)證分析。miRNA-451在不同組織和不同泌乳時(shí)期乳腺組織中的表達(dá)量結(jié)果顯示：miRNA-451在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、卵巢組織表達(dá)量都很低，在4個(gè)泌乳時(shí)期（泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期）的變化與泌乳曲線的變化有相似之處，同時(shí)在泌乳4個(gè)時(shí)期有逐漸降低趨勢(shì)。本研究構(gòu)建了攜帶奶山羊miRNA-451前體序列404bp的重組腺病毒載體。雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)結(jié)果表明，CAST基因?yàn)閙iRNA-451的靶基因。

奶山羊；miRNA-451；表達(dá)譜分析；靶基因

miRNA是一種22個(gè)核苷酸（nt)左右的單鏈小分子RNA。它的發(fā)現(xiàn)開啟了人類認(rèn)識(shí)非編碼RNA的新篇章，miRNA在生物的生長(zhǎng)過程中參與了細(xì)胞的增殖、分化、生物發(fā)育及代謝等許多生物學(xué)過程，同時(shí)也在疾病發(fā)生發(fā)展過程中扮演了重要的角色[1]。miRNA在乳腺發(fā)育過程中具有重要作用。Liu等[2]首次利用miRNA芯片掃描了人的全基因組miRNAs，結(jié)果在乳腺組織中發(fā)現(xiàn)有23種miRNAs的表達(dá)量較高，但和其他21個(gè)組織中發(fā)現(xiàn)的miRNAs數(shù)量相比，乳腺組織中發(fā)現(xiàn)miRNAs的數(shù)目較少。Iorio等[3]研究表明，miRNA-125b在乳腺發(fā)育的各個(gè)階段都處于高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌組織中miRNA-125b處于表達(dá)量較低，這表明抑制miRNA-125b的表達(dá)對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的分化具有破壞作用。Silveri等[4]利用Northern blot的方法分析發(fā)現(xiàn)在小鼠的乳腺中有9種特異表達(dá)的miRNAs。Wang等[5]應(yīng)用miRNA芯片已分析出在小鼠的懷孕和哺乳期miRNA-138和miRNA-431有下調(diào)的作用，而miRNA-133和miRNA-133a-133b具有上調(diào)的作用。Gu等[6]研究發(fā)現(xiàn) miRNA-21，miRNA-23a，miRNA-24和miRNA-143在乳腺的生長(zhǎng)和發(fā)育期這些miR-NAs發(fā)揮著重要的功能。Tanaka等[7]研究表明，miRNA-101a對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的發(fā)育和分化具有調(diào)控作用。Avril-Sassen等[8]研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺發(fā)育過程中miRNA的表達(dá)可能共同來調(diào)節(jié)一些集群，而在這些集群中與乳腺癌相關(guān)的miRNAs表達(dá)量顯著增高，影響這些miRNAs共同調(diào)節(jié)的機(jī)制和功能為我們提供了一條新的研究乳腺生物學(xué)的途徑。Cui等[9]的研究表明，miRNA-126-3p對(duì)乳腺上皮細(xì)胞的增殖有調(diào)控作用，其通過與其靶基因--孕酮受體（PGR）的3′UTR結(jié)合從而發(fā)揮作用的。

目前關(guān)于miRNA-451研究主要集中在癌癥上。Scholl等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-451在診斷中的表達(dá)水平與IM療法有相關(guān)性[10]；Cheng等研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-451靶向干擾素調(diào)節(jié)因子參與全身性紅斑狼瘡的發(fā)生[11]。巢海潮等分析發(fā)現(xiàn)，miR-451在不同膀胱癌細(xì)胞中差異表達(dá)，其表達(dá)異?？捎绊懓┘?xì)胞生物學(xué)功能[12]。Pigati等研究表明，miR-451在正常乳腺上皮細(xì)胞高表達(dá)[13]。miRNA-451的超表達(dá)可以抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程、細(xì)胞的遷移、入侵和促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的凋亡。本研究以西農(nóng)薩能奶山羊泌乳峰期和干奶期的乳腺組織為研究材料，基于本實(shí)驗(yàn)室以前的高通量測(cè)序及分析結(jié)果[14]，鑒定與奶山羊乳腺泌乳生理密切相關(guān)的miRNA-451及其靶基因，為西農(nóng)薩能奶山羊的定向選育提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 組織樣品的采集與總RNA的提取

健康的成年西農(nóng)薩能奶山羊母羊（3周歲），采自楊凌姚南新村屠宰場(chǎng)。采取Trizol法提取西農(nóng)薩能奶山羊乳腺組織，及心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、肌肉、脂肪、卵巢組織的總RNA。

1.2miRNA的定量分析

依據(jù)Chen等人提出的Stem-loop實(shí)時(shí)定量PCR的方法自行設(shè)計(jì)了特異性的反轉(zhuǎn)錄引物及相應(yīng)的PCR引物，本研究根據(jù)牛miRNA-451的序列（NC_007317.5)克隆出miRNA-451前體序列404 bp，設(shè)計(jì)帶有SalⅠ、HindⅢ酶切位點(diǎn)的引物，見表1。

1.3 奶山羊miRNA-451靶基因預(yù)測(cè)

根據(jù)Allen[15]和Schwab[16]方法和原則進(jìn)行miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，同時(shí)利用TargetScan在線軟件預(yù)測(cè)了miRNA-451的靶基因，即ING3、FLT-1、CAST基因。

1.4 候選靶序列的擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的牛ING3（NC_007302.5）、FLT-1（NC_007310.5）、 CAST（NC_007305.5） 基因的序列設(shè)計(jì)引物（表2），擴(kuò)增預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)兩側(cè)目的片段。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 20.0軟件中單因素方差分析以及Dunnett's多重比較統(tǒng)計(jì)兩組間的差異。*：＜0.05； **：＜0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳腺發(fā)育相關(guān)的miRNA-451的表達(dá)譜分析

如圖1表達(dá)譜分析結(jié)果，肝臟（Liver，Li）、肺臟（Lung， Lu）、 心臟（Heart He）、 腎臟（Kidney， Ki）、 肌肉（Skeletal muscle， Mu）、 脾臟（Spleen， Sp）、 脂肪（Inner Fat，F(xiàn)a）和卵巢組織（Ovary，Ov））和不同的泌乳時(shí)期乳腺組織（泌乳前期（30 DAL）、泌乳峰期（75 DAL）、泌乳末期（200 DAL）和干奶期（320 DAL））。MiRNA-451在肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、脂肪、卵巢組織表達(dá)量都很低，在泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期的變化與奶山羊泌乳曲線的變化有些相似，同時(shí)在泌乳的4個(gè)時(shí)期有逐漸降低的趨勢(shì)。總體來說，奶山羊乳腺組織的miRNA-451在乳腺組織中表達(dá)量相對(duì)較高，并且在不同泌乳時(shí)期的表達(dá)存在顯著差異。

表1 miRNA-451實(shí)時(shí)定量引物信息

表2 候選基因引物

圖1 miRNA-451的表達(dá)譜分析

2.2 miRNA-451腺病毒過表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)染

2.2.1 重組質(zhì)粒表達(dá)載體的構(gòu)建

克隆得到了包含miR-451前體的目的片段，并將該目的片段與載體pAdTrack-CMV重組，得到重組載體pAdTrack-CMV-miRNA-451，雙酶切鑒定結(jié)果證明該載體構(gòu)建成功。pAdTrack-CMV-miRNA-451載體與骨架載體pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，得到重組質(zhì)粒pAd-miRNA-451，酶切結(jié)果表明腺病毒重組成功。

2.2.2 重組腺病毒表達(dá)載體的包裝和擴(kuò)增與最佳滴度確定

重組質(zhì)粒pAd-miRNA-451線性化后，轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞，2 d后在熒光顯微鏡下可觀察到細(xì)胞中有綠色熒光，第7天可觀察到噬菌斑，說明細(xì)胞出現(xiàn)病變，9d后80%細(xì)胞游離脫落，此時(shí)收集的病毒為第一代病毒，反復(fù)感染3次后得到高滴度的病毒。

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞鋪于6孔板中，將包裝好的腺病毒載體pAd-miRNA-451和腺病毒空對(duì)照載體pAd-Control（由本實(shí)驗(yàn)室保存）分別感染293T細(xì)胞。pAd-miRNA-451 的 MOI為 150、 200、 250， pAd-Control的 MOI為50、100、150，每組重復(fù)3次，72h后觀察其綠色熒光表達(dá)情況，最佳的MOI為熒光強(qiáng)度亮并且細(xì)胞形態(tài)不變時(shí)的腺病毒感染量。pAd-miRNA-451的最佳MOI為200，pAd-Control的最佳MOI為100，如圖2所示：

圖2 轉(zhuǎn)染腺病毒后的293T細(xì)胞（100×）

2.2.3 重組腺病毒在293T細(xì)胞中的表達(dá)情況

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的293T細(xì)胞鋪于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，根據(jù)最佳MOI，感染293T細(xì)胞，并設(shè)置對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。72 h后提取細(xì)胞內(nèi)的RNA，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組重組的過表達(dá)腺病毒pAdmiRNA-451的表達(dá)量是對(duì)照組重組的過表達(dá)空載體pAd-Control的27倍（如圖3），差異極顯著。此結(jié)果說明，本研究構(gòu)建的重組腺病毒pAd-miRNA-451能高水平的表達(dá)目標(biāo)基因，為以后繼續(xù)研究miRNA-451調(diào)控乳腺上皮細(xì)胞的作用及機(jī)制以及對(duì)奶山羊泌乳的調(diào)控提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.3 奶山羊miRNA-451靶基因的初步研究

2.3.1 靶基因的預(yù)測(cè)

圖3 pAd-miRNA-451在293T細(xì)胞中的表達(dá)

利用預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)靶基因，并結(jié)合Grimson等[17]提出的miRNA靶位點(diǎn)的序列特征，獲得如下較為可信的靶位點(diǎn)：ING3（inhibitor of growth family，member 3，生長(zhǎng)抑制因子3基因）；CAST（calpastatin，鈣蛋白酶抑制蛋白）；FLT-1（fms-related tyrosine kinase 1，fms相關(guān)的酪氨酸激酶1），如圖4。

圖4 靶基因預(yù)測(cè)AING3基因；B CAST基因；C FLT-1基因

2.3.2 對(duì)應(yīng)山羊靶基因序列的擴(kuò)增與比對(duì)

經(jīng)PCR克隆與測(cè)序，獲得山羊的序列后，利用序列分析軟件BioXM 2.6進(jìn)行序列的同源性和保守性分析。分析結(jié)果如圖5。

2.3.3 psiCHECK-2載體構(gòu)建與鑒定

克隆ING3和CAST基因上miRNA-451的靶序列，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。將擴(kuò)增得到的片段與psiCHECK-2載體連接，得到含有目的基因3'UTR的雙熒光素酶報(bào)告載體。用Overlap PCR的方法擴(kuò)增ING3（圖6）和CAST（圖7）上miRNA-451的靶序列的突變體。將擴(kuò)增得到的片段與psiCHECK-2載體連接，得到含有目的基因3'UTR的突變型雙熒光素酶報(bào)告載體。

2.3.4 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)

本研究利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)鑒定山羊miRNA-451的靶基因。即利用miRNA-451 mimics分別與野生型重組載體（psiCHECK-2-ING3和psiCHECK-2-CAST）和對(duì)應(yīng)的突變型重組載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，以單獨(dú)分別用野生型重組載體和突變型重組載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞為對(duì)照。統(tǒng)計(jì)海腎熒光素酶的活性變化。分析結(jié)果表明，miRNA-451的miScript mimic與psiCHECK-2-CAST共轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞中psiCHECK-2-CAST重組質(zhì)粒表達(dá)海腎熒光素酶與對(duì)照組的海腎熒光素酶的活性變化顯著（＜0.05）（圖 8）， 突變分析結(jié)果顯示miRNA-451的miScript mimic不能使CAST基因突變重組質(zhì)粒表達(dá)的螢火蟲熒光素酶活性的降低（圖8），說明CAST基因是miRNA-451作用的靶基因。

圖5 牛與山羊的靶序列比對(duì)注：方框內(nèi)的序列是預(yù)測(cè)的與miRNA結(jié)合序列；小寫字母為錯(cuò)匹配堿基

圖6 ING3基因的overlap-PCR電泳圖。372bp為上游片段，67bp為下游片段，重合32bp。372+67-32=407

圖7 CAST基因的overlap-PCR電泳圖。190bp為上游片段，192bp為下游片段，重合32bp。190+192-32=350片

圖8 miR-451的CAST靶基因的驗(yàn)證

A預(yù)測(cè)的miR-451靶基因CAST位點(diǎn)，構(gòu)建缺失種子區(qū)（粗體）的突變體載體。B miR-451 mimics分別與野生型psiCHECK-2-CAST重組載體和突變型psiCHECK-2-CAST重組載體共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，以單獨(dú)分別用野生型psiCHECK-2-CAST重組載體和突變型psiCHECK-2-CAST重組載體轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞為對(duì)照（*＜0.05)。

3 討論

很多研究證明，miRNA的表達(dá)具有明顯的時(shí)序和組織特異性。miRNA的特異性表達(dá)依賴于特定的生理功能和生理狀態(tài)。Ji等[17]比較嶗山奶山羊泌乳中期和泌乳后期乳腺差異表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)了1113種保守miRNA和31種新miRNA，其中，697個(gè)保守的miRNA表達(dá)差異顯著，包括272個(gè)具有上調(diào)功能的miRNA和425個(gè)具有下調(diào)功能的miRNA，還揭示了這兩個(gè)不同泌乳階段中共表達(dá)最豐富的10種miRNA（miR-143， miR-143-3p， miR-138a-3p， let-7-5p， let-7b，let-7b-5p， miR-30a， miR-30a-5p， miR-738e， miR-378d）。而本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451在乳腺組織中表達(dá)量很高，并且在不同的泌乳時(shí)期的表達(dá)存在顯著差異，泌乳峰期miRNA-451的表達(dá)量是干奶期表達(dá)量的一倍多。

腺病毒具有高效率感染其他細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)可以避免自然腺病毒的毒性對(duì)人及其他動(dòng)物的危害。在基因功能的研究中，腺病毒載體得到了越來越廣泛的應(yīng)用。Russell等[18]通過管內(nèi)注射重組腺病毒載體到小鼠的乳腺上皮細(xì)胞中，發(fā)現(xiàn)腺病毒并沒有破壞乳腺上皮細(xì)胞的正常形態(tài)及其功能，這樣就可以通過這種非侵害性的方法來研究乳腺上皮細(xì)胞這種腔類細(xì)胞中基因的功能。本研究中的奶山羊miRNA-451的前體序列長(zhǎng)度是404bp屬于短片段基因，而腺病毒載體最高可以表達(dá)10 kb的基因，因此，腺病毒載體可以高效的表達(dá)miRNA-451的前體序列。

本試驗(yàn)主要是通過生物信息學(xué)的方法來預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。由于沒有專門預(yù)測(cè)山羊靶基因的數(shù)據(jù)庫(kù)，只能利用物種間的同源性來預(yù)測(cè)。利用TargetScan在線軟件和一些靶基因的預(yù)測(cè)規(guī)則進(jìn)行預(yù)測(cè)。最后通過基因功能確定ING3、CAST和FLT-1為候選靶基因，又進(jìn)一步通過克隆及同源性的比對(duì)最終確定了ING3和CAST為候選的靶基因。

因?yàn)閙iRNA-451在泌乳峰期的乳腺組織中是上調(diào)的，而miRNA-451在轉(zhuǎn)錄后抑制靶基因的表達(dá)。因此，本研究結(jié)合靶基因的預(yù)測(cè)篩選了一些在乳腺發(fā)育或泌乳生理過程中具有負(fù)向調(diào)控的基因。構(gòu)建野生型和突變型靶序列的雙熒光報(bào)告載體，利用雙熒光檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性的變化，據(jù)此來判斷miRNA與某一特定的靶基因識(shí)別情況。這種方法在miRNA靶基因驗(yàn)證研究中廣泛應(yīng)用[19-22]。293T細(xì)胞在這里只是工具，在研究中只利用細(xì)胞的翻譯系統(tǒng)，所以實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)果是可靠的和具有普遍性的。本研究中利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證明了CAST基因?yàn)閙iRNA-451的靶基因。

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本研究由高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金（博導(dǎo)類）、西農(nóng)薩能奶山羊泌乳生理相關(guān)miRNA調(diào)控機(jī)理研究（20120204110007）、西北農(nóng)林科技大學(xué)基本科研費(fèi)項(xiàng)目（No.QN2011102)、西農(nóng)薩能奶山羊乳腺泌乳相關(guān)miRNAs的鑒定及其調(diào)控泌乳性能研究（QN2011102）資助完成。

郭文嬌（1987-），女，陜西省西安市人，碩士研究生，研究方向：動(dòng)物遺傳學(xué)。

陳宏，教授，研究方向：生物技術(shù)與家畜育種。