拐棗枝多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

張保，張萌，李立天，鄭朋朋，敖新宇

（西南林業(yè)大學生命科學院，云南昆明650224）

拐棗枝多酚提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究

張保，張萌，李立天，鄭朋朋，敖新宇*

（西南林業(yè)大學生命科學院，云南昆明650224）

采用響應面法優(yōu)化拐棗枝多酚提取工藝，并研究其抗氧化活性，為拐棗枝多酚的應用提供理論依據(jù)。以拐棗枝為試驗材料，在單因素試驗的基礎上選取浸提溶劑、料液比、浸提溫度、浸提時間4個影響因素進行響應面優(yōu)化試驗；同時通過測定拐棗枝多酚對羥自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的清除率來評估其抗氧化性。結(jié)果表明：拐棗枝多酚的最佳提取工藝為以無水乙醇為浸提劑，在料液比為1∶84（g/mL），浸提溫度為60℃的條件下，浸提2.56 h，拐棗枝多酚的提取率為7.089%；拐棗枝多酚對羥自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的最大清除率分別為90.97%、93.99%、97.19%。

拐棗枝；多酚；響應面法；抗氧化活性

植物多酚（plant polyphenol）又稱為植物單寧（vegetable tannin），是一類具有酚羥基結(jié)構(gòu)且廣泛存在于植物體內(nèi)的天然植物化學成分[1-3]。近年來，不斷有國內(nèi)外的研究員從茶葉、水果、中草藥等植物體中提取到多酚類物質(zhì)[4]。研究表明植物多酚具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗骨質(zhì)疏松等多種生物學活性[5-8]。

拐棗（Hovenia acerba Lindl）學名枳椇，屬于鼠李科枳椇屬（Rhamnaceae hovenia），其富含蛋白質(zhì)、維生素、生物堿和有機酸等活性物質(zhì)[9-11]。根據(jù)相關文獻報道，拐棗汁和醋能夠顯著降低谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate transaminase，AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine aminotransferase；ALT）和谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（Glutamyl transferase，gamma-GT），對飲酒造成肝損傷的小鼠有較好的緩解效果[12]。目前國內(nèi)對拐棗果梗和拐棗子的研究報道較多，而對拐棗枝的研究報道極少。鄭朋朋等[13]發(fā)現(xiàn)拐棗枝乙醇浸提物的抗氧化能力比拐棗子強，微弱于拐棗果梗，但未做進一步的研究。因此，本研究采用拐棗枝為試驗材料，以多酚提取率為指標，采用響應面分析法優(yōu)化拐棗枝多酚提取工藝，并通過清除ABTS自由基、DPPH自由基和羥自由基試驗評價拐棗枝多酚的抗氧化性作用，為拐棗枝多酚的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

拐棗枝：采購于云南省昆明市西南林業(yè)大學東三環(huán)農(nóng)貿(mào)市場的帶枝拐棗，新鮮的拐棗除去拐棗果梗后放入烘箱中60℃烘至恒重，粉碎機粉碎，過80目篩，收集樣品放置于干燥器中備用。

1.1.2 試劑

水楊酸、硫酸亞鐵、抗環(huán)血酸、過硫酸鉀、碳酸鈉（均為分析純）、福林酚（BR）：國藥集團化學試劑有限公司；丙酮、正丁醇、甲醇、乙醇、30%雙氧水（均為分析純）：汕滇藥業(yè)有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate，ABTS）：美國 Sigma公司；茶多酚標準品（茶多酚含量>98%，CAS號：84650-60-2）：上海時代生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

BS224S電子天平：德國SARTORIUS公司；電熱恒溫鼓風干燥箱、HWS-12水浴鍋：上海一恒科學儀器有限公司；M20粉碎機：德國KIKAWERKE公司；AS20500B超聲波清洗儀：臺灣信達電子儀器有限公司；DHG-9240A型5430R離心機：德國Eppendorf公司；TU-1901紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司；B490真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士BUCHI公司；FD5-8冷凍干燥器：美國GoldSim公司。

1.3 方法

1.3.1 茶多酚標準曲線繪制

精確稱取40 mg的茶多酚標準品，置于50 mL的小燒杯中，加入適量的蒸餾水溶解并潤洗，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中用蒸餾水定容，配制成400 μg/mL茶多酚標準液。分別吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的標準液置于試管中，分別配制成0、50、100、200、300、400 μg/mL的茶多酚標準待測液，補加蒸餾水至體積為1.0 mL，分別加入1.0 mL福林酚，搖勻后靜置5 min，再加入質(zhì)量濃度為10%的碳酸鈉溶液2 mL，搖勻后置于黑暗處靜置反應1 h，反應結(jié)束后補加5 mL蒸餾水。于760 nm波長處測定吸光度值，繪制茶多酚標準曲線。

1.3.2 拐棗枝多酚的提取

稱取0.500 0 g拐棗枝干粉，置于100 mL的小燒杯中，按照預設的浸提溶劑，在不同的料液比、浸提溫度和浸提時間的條件下進行水浴浸提。浸提完成后轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，在6000r/min的條件下離心10min，取上清液并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容待測。

1.3.3 拐棗枝多酚含量的測定

準確量取1.0 mL多酚樣品待測液，置于試管中，依次加入1.0 mL福林酚、2 mL質(zhì)量濃度為10%的碳酸鈉溶液，搖勻后置于黑暗處靜置反應1 h，暗反應結(jié)束后補加5 mL蒸餾水，于760 nm波長處測定吸光度值，對照茶多酚標準曲線方程計算多酚含量。多酚提取率計算公式如下：

式中：W為多酚提取率，%；C為計算后所得樣品多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；V為樣品多酚體積，mL；m為拐棗枝樣品質(zhì)量，g。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1 浸提溶劑對拐棗枝多酚提取率的影響

在料液比為 1∶30（g/mL）、浸提溫度為 55℃、浸提時間為60 min的條件下分別加入不同的浸提溶劑（水、甲醇、乙醇、正丁醇、丙酮），每組3個平行試驗，按照1.3.2和1.3.3方法提取拐棗枝多酚并測定拐棗枝多酚提取率。

1.3.4.2 料液比、浸提溫度、浸提時間對拐棗枝多酚提取率的影響

以乙醇為浸提溶劑，分別設置料液比1∶10、1∶20、1 ∶30、1 ∶40、1 ∶50、1 ∶60、1 ∶70、1 ∶80、1 ∶90（g/mL）、浸提溫度 40、45、50、55、60、65、70 ℃和浸提時間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 3個單因素試驗。初始試驗條件為料液比 1∶40（g/mL）、浸提時間 60 min、浸提溫度 60 ℃，每組3個平行試驗，利用1.3.2和1.3.3方法提取拐棗枝多酚并測定拐棗枝多酚提取率。

1.3.5 響應面優(yōu)化試驗

在單因素試驗結(jié)果的基礎上，采用Box-Behnken試驗，優(yōu)化拐棗枝多酚提取條件。選取液料比（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）3個自變量（影響因素），以拐棗枝多酚提取率（Y）為響應值，并以-1、0、+1分別代表自變量3個水平見表1。

1.3.6 拐棗枝多酚制備

稱取50 g拐棗枝干粉，按響應面分析法優(yōu)化的最佳提取工藝條件進行浸提，浸提結(jié)束后在6 000 r/min的條件下離心10 min，移取上清液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至200 mL，將樣品濃縮液與蒸餾水1∶1（體積比）比例混合，樣品混合液經(jīng)真空冷凍干燥（-40℃，48 h）得到拐棗枝多酚樣品，-20℃保存待用。

表1 響應面試驗因素與水平設計Table 1 Independent factors and their levels of response surface experiments

1.3.7 拐棗枝多酚抗氧化性研究

1.3.7.1 清除羥自由基能力測定[14-15]

用蒸餾水溶解1.3.6中獲得的多酚樣品，配制成不同質(zhì)量濃度梯度[0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0（mg/mL）]。準確量取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的多酚樣品溶液（不同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對照），依次加入9 mmol/L FeSO4溶液 1.0 mL，9 mmol/L H2O2溶液 1.0 mL，9 mmol/L 水楊酸—乙醇溶液1.0 mL，在37℃下水浴30 min后，取出試管并在波長510 nm處測定吸光度值，羥自由基清除效率計算式如下：

式中：C1為·OH清除率，%；A1為不同樣品溶液吸光度值；A2為蒸餾水替代水楊酸的樣品本底吸光度值；A3為蒸餾水替代樣品的對照溶液吸光度值。

1.3.7.2 清除DPPH自由基能力測定[15-16]

用蒸餾水溶解1.3.6中獲得的多酚樣品，配制成不同質(zhì)量濃度梯度[0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0（mg/mL）]，準確量取1.0 mL不同質(zhì)量濃度的多酚樣品溶液（不同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對照），分別加入2.0 mL DPPH溶液（精確稱取0.004 0 g DPPH溶液，甲醇溶解定容至100 mL，避光放置于4℃冰箱待用），混勻，暗反應40 min。暗反應結(jié)束后在波長517 nm處測定吸光度值，DPPH自由基清除率計算公式如下：

式中：C2為DPPH自由基清除率，%；A1為樣品吸光度值；A2為本底吸光度值；A3對照溶液吸光度值。

1.3.7.3 清除ABTS自由基能力測定[15，17]

用蒸餾水溶解1.3.6中獲得的拐棗枝多酚樣品，配制成不同質(zhì)量濃度梯度[0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0（mg/mL）]，準確量取 1.0 mL 不同質(zhì)量濃度的多酚樣品溶液（不同質(zhì)量濃度的VC作為陽性對照），再加入2.0 mL的ABTS自由基工作液（ABTS和過硫酸鉀用蒸餾水分別溶解，使ABTS濃度為14 mmol/L，過硫酸鉀的濃度為4.90 mmol/L，將ABTS和過硫酸鉀1∶1（體積比）混合，將混合溶液在室溫下避光反應16 h。然后用甲醇適當稀釋ABTS自由基溶液，使其吸光度值在波長734 nm處為（0.700±0.002）范圍內(nèi)，即得到ABTS自由基工作液），混勻后于室溫下反應10 min，在734 nm處測定其吸光度值。ABTS自由基清除率計算公式如下：

式中：C3為ABTS自由基清除率，%；A1為樣品吸光度值；A2為樣品本底吸光度值；A3對照溶液吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚標準曲線

采用Origin 8.0軟件對760 nm處測定不同質(zhì)量濃度茶多酚標準溶液的吸光度值進行數(shù)據(jù)處理，得到茶多酚標準曲線，如圖1。線性回歸方程y=0.003 96x+0.039 74，R2=0.998；表明茶多酚質(zhì)量濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

圖1 茶多酚標準曲線Fig.1 Standard curve of tea polyphenols

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 浸提溶劑對拐棗枝多酚提取率的影響

浸提溶劑對拐棗枝多酚提取率的影響見圖2。

由圖2可知，不同溶劑對拐棗枝多酚提取率的影響有明顯差異，提取率大小依次為：甲醇（9.49%）＞乙醇（5.93%）＞水（4.73%）＞丙酮（3.48%）＞正丁醇（1.45%）。然而，甲醇對人體有一定的毒副作用，在食品工業(yè)應用中受限。因此，選擇乙醇作為浸提溶劑對拐棗枝進行多酚提取試驗。

圖2 浸提溶劑對拐棗枝多酚提取率的影響Fig.2 Effect of extraction solvent on extraction yield of Hovenia acerba sticks polyphenols

2.2.2 料液比對拐棗枝多酚提取率的影響

料液比對拐棗枝多酚提取率的影響結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對拐棗枝多酚提取率的影響Fig.3 Effect of ratios of water to the raw material on extraction yield of Hovenia acerba sticks polyphenols

由圖3可知，隨著料液比的增加，多酚提取率逐漸提高。當料液比增大到1∶80（g/mL）時，其提取率達到最大值7.09%，繼續(xù)增加料液比，多酚提取率趨于平緩，不再升高。因此，料液比選擇在1∶80（g/mL）為宜。

2.2.3 浸提溫度對拐棗枝多酚提取率的影響

浸提溫度對拐棗枝多酚提取率的影響結(jié)果見圖4。

圖4 浸提溫度對拐棗枝多酚提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on extraction yield of Hovenia acerba sticks polyphenols

由圖4可知，在浸提溫度達到60℃前，隨著浸提溫度的升高，拐棗枝多酚提取率也逐漸提高。浸提溫度在60℃時，多酚提取率最大（6.45%）。當浸提溫度在60℃～70℃時，多酚提取率隨著浸提溫度的升高而趨于平緩且略有下降。因此浸提溫度選擇在60℃為宜。

2.2.4 浸提時間對拐棗枝多酚提取率的影響

浸提時間對拐棗枝多酚提取率的影響結(jié)果見圖5。

圖5 浸提時間對拐棗枝多酚提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of Hovenia acerba sticks polyphenols

由圖5可知，拐棗枝多酚提取率隨著浸提時間的延長而不斷提高。當浸提時間在2.5 h時，多酚提取率最大（6.66%），之后多酚提取率隨著浸提時間的延長而趨于平緩。因此，浸提時間選擇在2.5 h為宜。

2.3 響應面試驗優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Box-Behnken試驗設計與結(jié)果

選擇料液比、浸提溫度、浸提時間3個影響因素，多酚提取率為響應值。根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，利用Design-Expert 8.0.6軟件設計三因素三水平的響應面試驗方案，試驗測定結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

2.3.2 模型方差分析

對響應面試驗結(jié)果（表2）進行多元回歸方程擬合，構(gòu)建回歸模型，方差分析見表3，得到二次多項式回歸方程：

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

此回歸模型達到極顯著水平（P<0.01），對多酚提取率影響程度依次為料液比（A）＞浸提時間（C）＞浸提溫度（B）。模型中的 A、C、A2、B2、C2對響應值影響極顯著（P＜0.01），表明試驗因素對響應值的影響不是偶然的隨機事件，不可忽略。失擬項P=0.065 5>0.05，差異不顯著。該模型的R2Adj=0.953，說明該模型能夠解釋95.3%的響應值變化，僅有總變異的4.7%不能用此模型來解釋，決定系數(shù)R2=0.983，說明該方程與實際情況擬合良好，試驗誤差小，能夠正確分析和預測不同提取工藝條件與多酚提取率之間的關系。

2.3.3 響應面圖分析

料液比、浸提溫度和浸提時間對多酚提取率影響的3D響應面見圖6。

由圖6可知，在所選的各因素的取值范圍內(nèi)，響應值（多酚提取率）呈現(xiàn)極大值。對響應值的影響極顯著的因素有料液比和浸提時間，表現(xiàn)為曲線較陡；浸提溫度對響應值的影響不顯著，表現(xiàn)為曲線平緩。

圖6 料液比、浸提溫度和浸提時間對多酚提取率影響的3D響應面Fig.6 The 3D response surface of extraction yield of polyphenols affected by ratio of solid to solution，extraction temperature，extraction time

2.3.4 最佳工藝條件驗證

應用響應面尋優(yōu)分析方法對回歸模型進行分析得到最優(yōu)結(jié)果：當料液比（A）為 1∶83.66（g/mL）、浸提溫度（B）為59.63℃、浸提時間（C）為2.56 h時，理論最佳拐棗枝多酚提取率為7.089%?？紤]到實際情況與試驗操作的方便性，將各因素修正為：浸提溫度60℃、浸提時間2.56 h、料液比1∶84（g/mL）。然后在此工藝條件下進行3次平行試驗，得到多酚提取率為（7.048±0.103）%，且RSD為1.5%。因此，采用響應面法對拐棗枝多酚浸提條件進行優(yōu)化是可行的。

2.4 拐棗枝多酚抗氧化結(jié)果分析

2.4.1 羥自由基清除率的測定

羥自由基可以在還原性過渡金屬（Fe2+）和H2O2的存在下通過芬頓反應形成，是已知分子氧的所有還原形式中最具活性的，同時也被認為是生物體內(nèi)細胞損傷的開始[18]。

圖7 多酚對羥自由基的清除作用Fig.7 Scavenging activity of polyphenols on hydroxyl radical

由圖7可知，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，拐棗枝多酚和VC對羥自由基均有明顯的清除作用；在0.5mg/mL～3.0 mg/mL時，拐棗枝多酚對羥自由基的清除作用隨著多酚濃度的增大而迅速增強，質(zhì)量濃度在3.0 mg/mL～5.0 mg/mL時，拐棗枝多酚對羥自由基的清除作用隨著濃度的增大而緩慢增強，之后趨于平緩，最大清除率達到90.97%。VC在0.5 mg/mL～2.0 mg/mL 時，VC對羥自由基的清除作用隨著VC質(zhì)量濃度的增加而迅速增強，質(zhì)量濃度大于2.0 mg/mL后，清除率趨于穩(wěn)定，維持在99.92%。與VC相比較，拐棗枝多酚對羥自由基的清除能力稍弱。

2.4.2 DPPH自由基清除率的測定

DPPH自由基在517 nm下有最大吸收峰，是一種穩(wěn)定的自由基，很容易被抗氧化劑清除[19]?，F(xiàn)在已被廣泛應用于評估食物或植物提取物的抗氧化性能力[20]見圖8。

圖8 多酚對DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging activity of polyphenols on DPPH radical

由圖8可知，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，拐棗枝多酚和VC對DPPH自由基均有明顯的清除能力，在0.005 mg/mL～0.05 mg/mL時，拐棗枝多酚對DPPH自由基的清除能力隨著多酚濃度的增大而迅速增強，質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL～3.0 mg/mL時，拐棗枝多酚對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增大而緩慢增強，表現(xiàn)為曲線平緩，當質(zhì)量濃度大于0.5 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到最大值97.19%。VC在0.01 mg/mL～0.05 mg/mL時，VC對DPPH自由基的清除作用隨著VC質(zhì)量濃度的增加而迅速增強，質(zhì)量濃度大于0.05 mg/mL后，清除率趨于穩(wěn)定，維持在96.05%。與VC相比較，雖然拐棗枝多酚在DPPH最大清除率上略高于VC，但是在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)VC對DPPH自由基的清除能力比拐棗枝多酚強。

2.4.3 ABTS自由基清除率的測定

ABTS自由基是通過ABTS與過硫酸鉀的氧化反應生成[21]。當ABTS自由基與樣品中的抗氧化劑反應時，其特征顏色（藍綠色）將會褪去[22]，在734 nm處的特征吸收峰將會減弱。因此，通過檢測734 nm處反應體系的吸光度值，可以定量分析ABTS自由基清除率大小，結(jié)果見圖9。

圖9 多酚對ABTS自由基的清除作用Fig.9 Scavenging activity of polyphenols on ABTS radical

由圖9可知，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，拐棗枝多酚和VC對ABTS自由基均有明顯的清除能力，質(zhì)量濃度在0.005 mg/mL～0.05 mg/mL時，拐棗枝多酚對ABTS自由基的清除能力隨著多酚濃度的增大而迅速增強，質(zhì)量濃度在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL時，拐棗枝多酚對ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增大而趨于平緩，最大清除率達到93.99%。VC0.01 mg/mL～0.05 mg/mL時，VC對ABTS自由基的清除作用隨著VC質(zhì)量濃度的增加而迅速增強，質(zhì)量濃度大于0.05 mg/mL后，清除率達到最大值，維持在97.53%。與VC相比較，拐棗枝多酚對ABTS自由基的清除能力稍弱。

3 結(jié)論

本研究利用響應面分析法對拐棗枝多酚的提取工藝條件進行優(yōu)化試驗，回歸模型方差分析后得出最佳提取工藝條件：在料液比為1∶84（g/mL），浸提溫度為60℃的條件下，浸提2.56 h，拐棗枝多酚的理論提取率為7.089%，實際提取率為（7.048±0.103）%。因此，響應面分析法優(yōu)化得到的拐棗枝多酚提取工藝參數(shù)是準確可靠的。抗氧化性試驗研究結(jié)果表明，在試驗的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著拐棗枝多酚的質(zhì)量濃度增加，其對羥自由基、ABTS自由基和DPPH自由基的清除作用增強，最大清除率分別達到90.97%、93.99%、97.19%。因此，拐棗枝多酚具有較強的抗氧化能力，是潛在的天然抗氧化劑，有待進一步研究和利用。

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Optimization of Extraction Technology of Hovenia acerba Sticks Polyphenols and Its Antioxidant Activity

ZHANG Bao，ZHANG Meng，LI Li-tian，ZHENG Peng-peng，AO Xin-yu*
（College of Life Science，Southwest Forestry University，Kunming 650224，Yunnan，China）

In order to provide theoretical basis for rationally developing and utilizing Hovenia accrba sticks polyphenols，the extraction technology of polyphenols from Hovenia accrba sticks was optimized by response surface methodology and studying its antioxidant activity.Using Hovenia accrba sticks as experimental materials，the effects of extraction solvent，material-liquid ratio，extraction temperature and extraction time on extraction rates of polyphenols were studied based on single factor experiment with response surface methodology.The antioxidant activities were investigated on the basis of hydroxyl radical，ABTS free radical and DPPH free radical assay．Result showed that the optimal extraction conditions were using anhydrous alcohol as extraction solvent with conditions of material-liquid ratio 1∶84 （g/mL），extraction temperature 60℃，extraction time 2.56 h，and the optimum extraction rate was up to 7.089%.The antioxidant activity tests revealed that polyphenols exhibited antioxidant activities in a concentration-dependent manner，and maximum scavenging rate were 90.97%，93.99%and 97.19%，respectively.

Hovenia accrba sticks；polyphenols；response surface methodology；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.23.009

云南省優(yōu)勢特色重點學科生物學一級學科建設項目（50097505）；西南林業(yè)大學科技創(chuàng)新基金（15125）

張保（1992—），男（漢），碩士研究生，研究方向：生物化學與分子生物學。

*通信作者：敖新宇（1978—），男（漢），副教授，碩士，主要從事于生物化學與分子生物學研究工作。

2017-04-20